一种他卡西醇软膏剂有关物质检查方法

摘要

本发明公开了一种低浓度的他卡西醇软膏剂有关物质的高效液相色谱分析方法，该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈‑水的混合液为流动相，特别是采用了涡旋‑萃取‑浓缩的方式获得供试品溶液和对照溶液，极大地保证了该软膏中极低剂量的药物及其有关物质可以被检测到，还优化了溶解浓缩至干剩余物的溶剂体系，使得出峰峰形更加尖锐，重现性好。本方法可同时分析他卡西醇软膏剂中所有已知杂质，并且可通过加校正因子的主成分自身对照法有效控制各已知杂质的含量，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂质峰的峰纯度均大于1.0。本发明为他卡西醇软膏剂的质量控制提供了简易和可靠的分析方法。

权利要求

1.一种低剂量的他卡西醇固体或半固体制剂的有关物质检查方法，其特征在于，该检查方法是用于检查规格为 2μg/g的他卡西醇软膏的有关物质检查方法，具体包含如下：避光操作，取本品约1g，相当于他卡西醇2μg，置25ml顶空瓶中，加入5ml正己烷，密封，涡旋5min，使其完全溶解，再加入5ml甲醇，再涡旋5min，静置分层，将上层浑浊溶液弃去，下层于25℃下旋蒸至干，加1ml 80%甲醇溶解后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；取供试品溶液0.1ml，置10ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，作为溶液①，再取4ml，置10ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液；按照高效液相色谱法测定；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；调整流速，使他卡西醇的保留时间约为24min；检测波长265nm；

取系统适用性溶液和供试品溶液各300μl注入液相色谱仪，系统适用性溶液连续6针的相对标准偏差不得过10%；系统适用性溶液主峰面积应为溶液①主峰面积的28% 52%；供试~

品溶液中前他卡西醇和他卡西醇的分离度不得小于5；供试品溶液色谱图中，除他卡西醇和前他卡西醇峰外，按面积归一化法计算，相对保留时间0.83的色谱峰不得过0.8%，杂质总量不得过2.0%。

说明书

一种他卡西醇软膏剂有关物质检查方法

技术领域

[0001] 本发明属于一种药物制剂的有关物质检查方法，具体涉及一种低浓度的他卡西醇软膏剂有关物质检查方法。

背景技术

[0002] 银屑病，又称牛皮癣，是一种慢性炎症性皮肤病，患病时间长，易于复发，有的病例几乎终生不愈；其发病以青壮年为主，对患者的身体健康和精神状态均有所影响；临床上常
为红斑和鳞屑等症状，全身均可发病，以头皮，四肢伸侧较多，在冬季易加重；目前治疗银屑
病外用药物主要有维生素D类衍生物、皮质类固醇类、维A酸类、蒽林、角质脱剥剂等；皮质类
固醇是由肾上腺皮质产生的类固醇类物质，多是激素类，如糖皮质类固醇和盐皮质类固醇
等；在牛皮癣的治疗中，已知使用联合治疗，其中牵涉一种类固醇化合物，如皮质类固醇化
合物，和一种维生素D类似物。

[0003] 维生素D(vitamin D)为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。目前认为维生素D也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中最重要的成员是VD2(麦角钙化
醇)和VD3(胆钙化醇)。维生素D均为不同的维生素D原经紫外照射后的衍生物。缺乏维生素D
可能对身体极其有害。维生素D衍生物活性较高，故其制剂含量都非常低，通常在0.0001～
0.0005％之间。

[0004] 他卡西醇(Tacalcitol)，是维生素D3活性代谢产物的类似物，化学名为(+)－(5Z，7E，24R)－9，10－开链胆甾－5，7，10(19)－三烯－1a，3b，24－三醇，化学式C27H44O3，CAS
登录号57333-96-7；是一种治疗银屑病(牛皮癣)的药物。于1993年由日本的帝人制药株式
会社(Teijin)生物医药研究院推出上市，商品名为萌尔夫。由于他卡西醇药效好且可以用
于面部感染的银屑病的治疗，因此成为治疗银屑病(牛皮癣)的主要外敷药物。

[0005] 他卡西醇性质不稳定，对光、热、空气均很敏感，尤其是在反应过程中容易产生一些异构体杂质及其它有关物质，难于分离纯化，因而合成条件较难把握，合成工艺技术门槛
高、难度大。同时，对原料药和制剂产品的质量控制也提出了更好的要求。

[0006] 目前为止，由于他卡西醇在制剂中的含量极低，主药本身的理化性质有极不稳定，因此，目前为止的公开文献中，对于他卡西醇的杂质研究和质量控制鲜有报道。

[0007] 众所周知，他卡西醇软膏具有极低的单元药物含量，辅料占比很大，给样品的准确检测带来干扰，增加困难。但是一般来说，低剂量药物具有较强的生理活性，其降解产物也
可能因较强的生理活性容易引起不良反应，因此低剂量药物的有关物质检查不能忽略，理
应是质量控制的关键指标之一。

[0008] 日本药典中收载了他卡西醇软膏的质量标准，其中在纯度检查中虽然描述了检查方法，但是其明确指出该方法只是适用于相对稍大规格即20μg/g的软膏的纯度检查，也就
是说对于更低规格的软膏有关物质检查无能为力，并且其他公开文献中，进一步深入的探
讨更低浓度比如2μg/g规格的他卡西醇软膏有关物质或质量研究鲜有报道。这可能也是由
于他卡西醇本身主药的含量就极低，主药在制剂和贮藏过程中产生多种杂质，就更加难以
与主药分离并检测。

[0009] 目前，他卡西醇软膏的分析方法主要依赖于精密的仪器和复杂的研究。

[0010] 综上，为保证药品的质量和安全，需要开发一种灵敏度极高的分析方法和极为精细的前处理方法，以便简便快速准确的检查低剂量剂型的他卡西醇软膏的有关物质，并获
得较好的回收率，使得更好地控制该药品的质量，增加用药安全。

发明内容

[0011] 本发明的目的在于提供一种低浓度他卡西醇软膏的有关物质的高效液相色谱分析方法，以克服现有技术中对于更低规格比如2μg/g规格的他卡西醇软膏有关物质检查方
法的缺失，更好地满足对于他卡西醇软膏的质量控制要求。

[0012] 针对现有文献对他卡西醇软膏的降解杂质鉴定研究的缺失，本发明人通过工艺试制、强制降解试验对他卡西醇相关杂质进行富集、分离提纯，具体操作可采用本领域技术人
员熟知的富集杂质和分离提纯的方法，例如，可以放大反应投料量，浓缩收集母液，进行柱
层析、重结晶等方式提纯杂质。

[0013] 本发明人总共鉴定了1个主要杂质PY1，结构如下所示，

[0014]

[0015] 同时按中国药典2015版二部通则0512(高效液相色谱法)及通则9101(药品质量标准分析方法验证指导原则)的定义及验证方法，进行专属性验证，结果表明该方法可同时分
析他卡西醇软膏中的所有已知杂质，并且可通过加校正因子的主成分自身对照法有效控制
各已知杂质含量，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂
质峰峰纯度均为1.0。

[0016] 所述“峰纯度”是指采用配有相应分析软件的光二极管阵列检测器，采集、记录、分析经色谱柱分离组份的光谱数据，自动生成的表征特定分离组份对应的光谱特征一致性的
加权值。

[0017] 本发明报道了一种他卡西醇软膏的有关物质检查方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，及紫外检测器，乙腈/水混合液为流动相等度洗脱，达到分离分析他
卡西醇软膏中主峰他卡西醇，前他卡西醇，杂质PY1，以及其他有关物质的目的。

[0018] 本发明提供了一种低浓度的他卡西醇固体或半固体制剂的有关物质检查方法，包含如下步骤：避光操作，取本品约1g(相当于他卡西醇2μg)，置25ml顶空瓶中，加入5ml正己
烷，密封，涡旋5min，使其完全溶解，再加入5ml甲醇，再涡旋5min，静置分层，将上层浑浊溶
液弃去，下层于25℃下旋蒸至干，加1ml 80％甲醇溶解后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液
作为供试品溶液；取供试品溶液0.1ml，置10ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，作
为溶液①，再取4ml，置10ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液；
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填
充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；调整流速，使他卡西醇的保
留时间约为24min；检测波长265nm；

[0019] 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)0 40 60
30 40 60
50 0 100
60 0 100
60.1 40 60
70 40 60

[0020] 取系统适用性溶液和供试品溶液各300μl注入液相色谱仪，系统适用性溶液连续6针的相对标准偏差不得过10％；系统适用性溶液主峰面积应为溶液①主峰面积的28％～
52％；供试品溶液中前他卡西醇和他卡西醇的分离度不得小于5；供试品溶液色谱图中，除
他卡西醇和前他卡西醇峰外，按面积归一化法计算，相对保留时间0.83的色谱峰不得过
0.8％，杂质总量不得过2.0％。

[0021] 本发明提供的有关物质检查方法，该检查方法适用的剂型包括：片剂，胶囊，颗粒剂，软膏剂，凝胶剂，乳膏剂，贴剂，巴布剂。

[0022] 优选地，本发明提供的有关物质检查方法，该检查方法适用的剂型是他卡西醇软膏。

[0023] 优选地，本发明提供的有关物质检查方法，该检查方法适用的剂型是他卡西醇软膏，软膏规格是大于等于2μg/g且小于等于20μg/g。

[0024] 优选地，本发明提供的有关物质检查方法，该检查方法适用的剂型是他卡西醇软膏，软膏规格是20μg/g。

[0025] 最优选地，本发明提供的有关物质检查方法，该检查方法适用的剂型是他卡西醇软膏，软膏规格是2μg/g。

[0026] 最优选地，本发明提供的有关物质检查方法，该检查方法是用于检查规格为2μg/g他卡西醇软膏的有关物质的检查方法，具体包含如下：避光操作；取本品约1g(相当于他卡
西醇2μg)，置25ml顶空瓶中，加入5ml正己烷，密封，涡旋5min，使其完全溶解，再加入5ml甲
醇，再涡旋5min，静置分层，将上层浑浊溶液弃去，下层于25℃下旋蒸至干，加1ml 80％甲醇
溶解后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；取供试品溶液0.1ml，置10ml棕色
量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，作为溶液①，再取4ml，置10ml棕色量瓶中，加入甲醇稀
释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液；照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则
0512)测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表
进行梯度洗脱；调整流速，使他卡西醇的保留时间约为24min；检测波长265nm；

[0027] 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)0 40 60
30 40 60
50 0 100
60 0 100
60.1 40 60
70 40 60

[0028] 取系统适用性溶液和供试品溶液各300μl注入液相色谱仪，系统适用性溶液连续6针的相对标准偏差不得过10％；系统适用性溶液主峰面积应为溶液①主峰面积的28％～
52％；供试品溶液中前他卡西醇和他卡西醇的分离度不得小于5；供试品溶液色谱图中，除
他卡西醇和前他卡西醇峰外，按面积归一化法计算，相对保留时间0.83的色谱峰不得过
0.8％，杂质总量不得过2.0％。

[0029] 采用本发明方法可有效地控制他卡西醇，前他卡西醇，以及杂质PY1，均能在一张图谱上分析出来，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂
质峰峰纯度均大于980。系统适应性的典型色谱图见附图1，计算结果见表1。

[0030] 表1他卡西醇与各已知杂质色诺分离参数结果

[0031] 名称 相对保留时间 分离度 峰纯度前他卡西醇 21.370min 4.9 /
杂质PY1 24.120min 1.9 /
他卡西醇 26.0３0min / 1000

[0032] 采用本发明方法能够分析他卡西醇软膏在各种复杂环境下的降解杂质，方法专属性强。按中国药典2015版通则0512及通则9101(药品质量标准分析方法验证指导原则)的定
义及验证方法，将他卡西醇软膏分别用酸、碱、高温、氧化、光照破坏，制得破坏样品，以及未
破坏的样品。按照本发明方法分别采集各破坏样品色谱图，典型色谱图见附图1-7。结果表
明该方法能够分析经酸、碱、高温、氧化、光照破坏的样品，主峰与各杂质峰均能达到基线分
离，主峰纯度均大于980。

[0033] 采用本发明方法能对各已知杂质进行定量分析。按中国药典2015版通则0512及通则9101(药品质量标准分析方法验证指导原则)的定义及验证方法，采用杂质对照法对他卡
西醇1个已知杂质的检测限、定量限进行检测，结果表明该方法对各杂质的响应值高，能有
效控制各已知杂质，结果见表2。

[0034] 表2他卡西醇已知杂质定量分析验证参数结果

[0035]

[0036] 本发明取得的有益的技术效果在于：

[0037] (1)本发明首次对规格2μg/g的他卡西醇软膏的有关物质进行了溯源归属，鉴定了1个有关物质，为他卡西醇软膏的有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考，具有较大的积极
进步效果和实际应用价值。

[0038] (2)本发明首次对他卡西醇软膏的有关物质进行了溯源归属，鉴定了1个有关物质，为他卡西醇软膏的有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考。由于维生素D含量极微，检
测灵敏度难以符合要求，前处理方法也较为复杂，杂质检测困难，这类药物的杂质研究尚罕
见文献报道。但由于此类药物适用人群广，包括儿童、孕妇和老人，并可能长期使用，其制备
工艺中通常存在维生素D过量投料，且维生素D结构中存在甾体母核结构，降解几率大。已知
的降解杂质包括各种经过光照和高温破坏产生的反式维生素D3等各种杂质，因此仍须在杂
质谱分析的基础上，开发适宜的分析方法对杂质进行控制。本发明提供的检测方法极好地
解决了上述现有技术中的缺陷，具有较大的积极进步效果和实际应用价值。

[0039] (3)现有技术中未有关于他卡西醇软膏在制剂和贮藏过程中的杂质的报道和分离分析方法。日本药典收载的他卡西醇软膏的质量标准的纯度检查方法只是适用于规格稍大
的20μg/g软膏的纯度检查，但无规格2μg/g软膏的纯度检查有关物质检查项，为了更好地控
制该药品的质量，增加用药安全性；本发明首次揭示了他卡西醇软膏有关物质的HPLC特性，
能够将主要他卡西醇与前他卡西醇及其他有关物质有效分离开来并准确分析，提高了他卡
西醇软膏的质量标准，进一步降低了不良反应几率，保障了人民群众的用药安全。

[0040] (4)本发明的方法能在同一个高效液相色谱条件下同时他卡西醇，前他卡西醇及其他杂质，避免了在检测中频繁更换色谱条件，提高工作效率，适合工业大生产的要求；本
发明方法所用仪器设备及试剂均为常规用品，实验操作无苛刻条件，成本低廉；本发明的检
测方法专属性好，各杂质和他卡西醇之间均达到有效分离，各杂质与主峰之间分离度较好，
系统适用性良好；灵敏度高，适合进行杂质控制，能够满足有关物质检查的要求。

附图说明

[0041] 图1是他卡西醇与前他卡西醇以及杂质PY1的混合进样，所得系统适应性试验图谱。

[0042] 图2是实施例1酸破坏色谱图。

[0043] 图3是实施例1碱破坏色谱图。

[0044] 图4是实施例1高温破坏色谱图。

[0045] 图5是实施例1氧化破坏色谱图。

[0046] 图6是实施例1光照破坏色谱图。

[0047] 图7是实施例1未破坏样品色谱图。

[0048] 图8是纯甲醇体系与甲醇/水混合体系分别溶解样品的液相出峰对比图。

具体实施方式

[0049] 实施例1：规格为2μg/g的他卡西醇软膏的有关物质的高效液相色谱分析方法避光操作；取本品约1g(相当于他卡西醇2μg)，置25ml顶空瓶中，加入5ml正己烷，密封，涡旋
5min，使其完全溶解，再加入5ml甲醇，再涡旋5min，静置分层，将上层浑浊溶液弃去，下层于
25℃下旋蒸至干，加1ml 80％甲醇溶解后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶
液；取供试品溶液0.1ml，置10ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，作为溶液①，再取
4ml，置10ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液；照高效液相色
谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为
流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；调整流速，使他卡西醇的保留时间约为
24min；检测波长265nm；

[0050] 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)0 40 60
30 40 60
50 0 100
60 0 100
60.1 40 60
70 40 60

[0051] 取系统适用性溶液和供试品溶液各300μl注入液相色谱仪，系统适用性溶液连续6针的相对标准偏差不得过10％；系统适用性溶液主峰面积应为溶液①主峰面积的28％～
52％；供试品溶液中前他卡西醇和他卡西醇的分离度不得小于5；供试品溶液色谱图中，除
他卡西醇和前他卡西醇峰外，按面积归一化法计算，相对保留时间0.83的色谱峰不得过
0.8％，杂质总量不得过2.0％。

[0052] 实施例2采用实施例l的检查方法，得到本发明人自制他卡西醇软膏的有关物质(规格2μg/g)

[0053] 批号 20170602 20170603 20170604杂质PY1 未检出 未检出 未检出
最大其他未知单杂(％) 未检出 未检出 未检出
总杂(％) 未检出 未检出 未检出

[0054] 实施例3对比实施例，即规格为20μg/g的他卡西醇软膏的有关物质的高效液相色谱分析方法

[0055] 本实施例中，参考日本药典中规格20μg/g他卡西醇软膏的有关物质检查方法进行实施。

[0056] 避光操作；取本品约1g(相当于他卡西醇20μg)，置25ml顶空瓶中，加入5ml正己烷，密封，涡旋5min，使其完全溶解，再加入5ml甲醇，再涡旋5min，静置分层，将上层浑浊溶液弃
去，下层于25℃下旋蒸至干，加1ml甲醇溶解后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品
溶液；取供试品溶液0.1ml，置10ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，作为溶液①，再
取4ml，置10ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液；照高效液相
色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水
为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；调整流速，使他卡西醇的保留时间约
为24min；检测波长265nm；

[0057]时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 40 60
30 40 60
50 0 100
60 0 100
60.1 40 60
70 40 60

[0058] 取系统适用性溶液和供试品溶液各30μl注入液相色谱仪，系统适用性溶液连续6针的相对标准偏差不得过10％；系统适用性溶液主峰面积应为溶液①主峰面积的28％～
52％；供试品溶液中前他卡西醇和他卡西醇的分离度不得小于5；供试品溶液色谱图中，除
他卡西醇和前他卡西醇峰外，按面积归一化法计算，相对保留时间0.83的色谱峰不得过
0.8％，杂质总量不得过2.0％。

[0059] 实施例4有关物质检查法的前处理过程的优化

[0060] 对于2μg/g规格的软膏来说，不同溶剂体系溶解浓缩剩余物，会对液相色谱的峰形带来不同程度的影响。

[0061] 其中，呈现尖锐峰形的色谱峰是采用甲醇-水混合体系溶解剩余物的结果如图8所示；而采用纯甲醇溶剂溶解剩余物会导致出峰峰形欠尖锐，峰形较宽，可能是溶剂效应产生
的影响。

[0062] 实施例6强制降解试验

[0063] 以他卡西醇软膏为考察对象，配置一系列强制降解试验样品。

[0064] (1)他卡西醇与前他卡西醇以及杂质PY1的混合进样，所得系统适应性试验图谱详见附图1。

[0065] (2)酸破坏样品：取他卡西醇软膏适量，置于50mL纳氏比色管中，加0.1mol/L盐酸溶液5mL摇匀，室温放置4h；加0.1mol/L NaOH 5mL中和后，加入至25mL。详见附图2。

[0066] (3)碱破坏样品：取他卡西醇软膏适量，置于50mL纳氏比色管中，加0.1mol/L NaOH 5mL摇匀，室温放置4h；加0.1mol/L盐酸5mL中和后，加入至25mL。详见附图3。

[0067] (4)氧化破坏样品：取他卡西醇软膏适量，置于50mL纳氏比色管中，加0.3％双氧水溶液5mL，室温放置4h，加水至25mL。详见附图4。

[0068] (5)高温破坏样品：取他卡西醇软膏适量，置于50mL纳氏比色管中，置50℃烘箱中破坏4h，取出放冷即得。详见附图5。

[0069] (6)光照破坏样品：取他卡西醇软膏适量，置于50mL纳氏比色管中，放置在光照强度为4500勒克斯的条件下照射24h。详见附图6。

[0070] (7)未破坏样品：详见附图7。

[0071] 按照上述液相条件，取上述各样品溶液，分别进样20μl，分别记录色谱图，详见依次的色谱图1-7。

[0072] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围汇总，任何他人完成的技术实
体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被
视为涵盖于本权利要求范围之中。