一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法

摘要

本发明涉及食品检测领域，具体关于一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法；本发明方法公开的一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，本发明是针对鸡蛋这个体系，利用市售的试剂盒检测鸡蛋的甲硝唑含量，其特征在于：本方法增加酶解操作和匀浆机一个装置，并使用一种蛋白吸附剂对残留的微量蛋白质进行吸附，减小蛋白残留对检测的影响。在对操作修改后，可以在鸡蛋检测时实现超出原测试灵敏度的结果，实现与质谱相近的检测限，通过样品处理过程的针对性改变，可以提高测试的灵敏度和重现性。

权利要求

1.一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，其技术方案如下：

步骤一、取去壳鸡蛋样品、均质；称取均质后鸡蛋样品2g放置于干净离心管中，加入1mL 

1X样品提取液，然后加入0.1-0.5ml中性蛋白酶酶液，中性蛋白酶酶液质量百分比浓度为

1.0%-1.5%，先在40-50℃水浴30-50min，然后在85-95℃水浴处理5-10min；

步骤二、向处理好的样品加入3.5-5.5mL的乙腈和0.15-0.35g的蛋白吸附剂，初步混匀，然后用高速匀浆机，于9000-10000rpm下匀浆40-60s；然后在20-25℃，使用3500-4000r/min的转速离心250-300s；

步骤三、移取2mL上清液到一个新的离心管中，将溶剂除去，加入0.3-0.7mL 样品稀释液和0.8-1.2mL 正己烷溶解干燥物，最大速涡流40-60s，溶解均匀；然后在20-25℃， 使用

3500-4000r/min的转速离心250-300s；弃去上层正己烷，取50μL下层液作检测；

步骤四、分别加入50μL的标准品和样品于各自所设定的孔中，在每孔中加入100μL 1x酶标记物，轻敲微孔板边缘混匀40-60s；然后在20-25℃避光孵育45min；

步骤五、洗板3次，每次加入250μL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；加入TMB底物100 μl，轻敲微孔板边缘混匀40-60s，在20-25℃避光孵育30min，加入100 μL的终止液终止反应；

步骤六、用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕，尽快在450nm下读OD值；

所述的蛋白吸附剂制备方法包括：按照质量份数，将30-35份的苯乙烯/甲基苯乙烯/茚共聚物浸泡在60-80份的二氯乙烷中，溶胀10-15h；完成溶胀后，控温2-6℃，加入含有0.5-

1.5份的间甲苯甲酰过氧化苯甲酸的丙酮溶液80-90份，搅拌反应60-120min；反应完全，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；然后将样品加入到80-100份的含有2.5-3.8份硫代牛磺酸的水溶液中，在50-60℃中超声反应18-24h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；

然后将20-30份的样品加入到50-60份的含有4-8份牛磺脱氧胆酸的水溶液中，用pH值调节剂将溶液调节pH为4-5，加入1.6-2.0份的十一碳烯酰水解大豆蛋白和1.4-2.0份的1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲，0.05-0.5份的大豆油基乙基吗啉氮鎓乙基硫酸盐, 0.005-

0.05份的水杨酸钛在20-30℃中超声反应2-6h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次即可得到一种蛋白吸附剂。

2.根据权利要求1所述的一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，其特征在于：步骤二所述的初步混匀的方法为使用最大速涡流2-6min或者用振荡器振荡8-15min。

3.根据权利要求1所述的一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，其特征在于：步骤三所述的将溶剂除去的方法为在60-70℃水浴减压旋转蒸发干燥或60-70℃水浴氮气吹干。

4.根据权利要求1所述的一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，其特征在于：所述的pH值调节剂为10%-20%的甲酸溶液。

说明书

一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及食品检测领域，具体关于一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法。

背景技术

[0002] 近年来，食品安全问题一直为人们所关注。在蛋鸡养殖和鸡蛋产品监控中，甲硝唑是一个重要的监控项目。

[0003] CN106770229A公开了一种鸡肉中甲硝唑检测卡，包括卡条，所述卡条的表面开设有放样槽，所述放样槽的上方粘贴有密封条，所述放样槽的底端连通有检测槽，所述检测槽内设置有酸性溶纸，所述检测槽的底端连通有显色槽，所述显色槽的上方固定连接有显色板，所述显色板的表面设置有碱性试纸。该鸡肉中甲硝唑检测方法及检测卡，通过设置酸性溶纸，将鸡肉切片中的甲硝唑进行酸溶解的富集，保证了后续鸡肉切片与碱性试纸反应时的显色效果，通过设置显色槽，鸡肉切片在显色槽内与碱性试纸充分接触，加快了该鸡肉中甲硝唑检测卡的反应速率。

[0004] CN201004064Y公开了一种甲硝唑胶体金免疫检测试纸条，它是由样液吸收层、胶体金标记层、检测反应层及吸水层依次设置在背衬上组成。该快速检测试纸条特异性强，能够实现半定量检测，4-40℃都可使用，3min以后便可观察结果，适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场等单位或个人对动物尿液、肉类等样品中的甲硝唑进行快速检测。

[0005] CN104713925A公开一种用于提高传感器性能的复合膜，该复合膜由纳米多孔镍层和分子印迹聚合物层组成，所述分子印迹聚合物中的模板分子以甲硝唑为例。该复合膜可作为检测甲硝唑的传感器表面修饰材料，利用纳米多孔镍层的多孔结构和良好导电特性，结合分子印迹聚合物层对检测分析物的特异选择性，从而明显提高现有传感器对甲硝唑检测的灵敏性和专属性，对甲硝唑的检测限可低至pmol/L级，且该复合膜具有制备简单可控，可重复使用和经济易得的优势。

[0006] 现在标准方法是质谱法，但投资较大，不便于推广；在食品安全觉检测领域中，酶联免疫（ELISA）是一种重要的快速检测方法，它是利用特征反应来检测食品中的药物残留，它比试纸法可以达到更高的灵敏度，又无需质谱那样购置昂贵的检测仪器。市埸上推出众多的专业测试的试剂盒。但市埸上的试剂盒考虑商业推广的问题，是针对多种原料的，非专用性的。而实际不同食品原料因成分和结构上的差异，经过针对性改良后才能达到理想效果。

发明内容

[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法。

[0008] 一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，其技术方案如下：

[0009] 步骤一、取去壳鸡蛋样品、均质；称取均质后鸡蛋样品2g放置于干净离心管中，加入1mL 1X样品提取液，然后加入0.1-0.5ml中性蛋白酶酶液(1.0%-1.5%)，先在40-50℃水浴30-50min，然后在85-95℃水浴处理5-10min；

[0010] 步骤二、向处理好的样品加入3.5-5.5mL的乙腈和0.15-0.35g的蛋白吸附剂，初步混匀，然后用高速匀浆机，于9000-10000rpm下匀浆40-60s；然后在20-25℃，使用3500-4000r/min的转速离心250-300s；

[0011] 步骤三、移取2mL上清液到一个新的离心管中，将溶剂除去，加入0.3-0.7mL 样品稀释液和0.8-1.2mL 正己烷溶解干燥物，最大速涡流40-60s，溶解均匀；然后在20-25℃， 使用3500-4000r/min的转速离心250-300s；弃去上层正己烷，取50μL下层液作检测；

[0012] 步骤四、分别加入50μL的标准品和样品于各自所设定的孔中，在每孔中加入100μL 1x酶标记物，轻敲微孔板边缘混匀40-60s；然后在20-25℃避光孵育45min；

[0013] 步骤五、洗板3次，每次加入250μL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；加入TMB底物100 μl，轻敲微孔板边缘混匀40-60s，在20-25℃避光孵育30min，加入100 μL的终止液终止反应；

[0014] 步骤六、用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕，尽快在450nm下读OD值。

[0015] 步骤二所述的初步混匀的方法为使用最大速涡流2-6min或者用振荡器振荡8-15min；

[0016] 步骤三所述的除去样品溶剂的方法为在60-70℃水浴减压旋转蒸发干燥或60-70℃水浴氮气吹干；

[0017] 所述的蛋白吸附剂按照以下方案制备：

[0018] 按照质量份数，将30-35份的苯乙烯/甲基苯乙烯/茚共聚物浸泡在60-80份的二氯乙烷中，溶胀10-15h；完成溶胀后，控温2-6℃，将含有0.5-1.5份的间甲苯甲酰过氧化苯甲酸的丙酮溶液80-90份，搅拌反应60-120min；反应完全，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；然后将样品加入到80-100份的含有2.5-3.8份硫代牛磺酸水溶液中，在50-60℃中超声反应
18-24h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；然后将20-30份的样品加入到50-60份的含有4-8份牛磺脱氧胆酸水溶液中，用pH值调节剂将溶液调节pH为4-5，加入1.6-2.0份的十一碳烯酰水解大豆蛋白和1.4-2.0份的1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲，0.05-0.5份的大豆油基乙基吗啉氮鎓乙基硫酸盐, 0.005-0.05份的水杨酸钛在20-30℃中超声反应2-
6h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次即可得到一种蛋白吸附剂。

[0019] 所述的pH值调节剂为10%-20%的甲酸溶液。

[0020] 本发明方法公开的一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，本发明是针对鸡蛋这个体系，利用市售的试剂盒检测鸡蛋的甲硝唑含量，其特征在于：本方法增加酶解操作和匀浆机一个装置，并使用一种蛋白吸附剂对残留的微量蛋白质进行吸附，减小蛋白残留对检测的影响。在对操作修改后，可以在鸡蛋检测时实现超出原测试灵敏度的结果，实现与质谱相近的检测限，通过样品处理过程的针对性改变，可以提高测试的灵敏度和重现性。

具体实施方式

[0021] 下面通过具体实施例对该发明作进一步说明：

[0022] 实施例1

[0023] 一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，其技术方案如下：

[0024] 步骤一、取去壳鸡蛋样品、均质；称取均质后鸡蛋样品2g放置于干净离心管中，加入1mL 1X样品提取液，然后加入0.3ml中性蛋白酶酶液(1.3%)，先在45℃水浴40min，然后在90℃水浴处理8min；

[0025] 步骤二、向处理好的样品加入4.5mL的乙腈和0.25g的蛋白吸附剂，初步混匀，然后用高速匀浆机，于9500rpm下匀浆50s；然后在23℃，使用3800r/min的转速离心280s；

[0026] 步骤三、移取2mL上清液到一个新的离心管中，将溶剂除去，加入0.5mL 样品稀释液和1mL 正己烷溶解干燥物，最大速涡流50s，溶解均匀；然后在23℃，使用3800r/min的转速离心280s；弃去上层正己烷，取50μL下层液作检测；

[0027] 步骤四、分别加入50μL的标准品和样品于各自所设定的孔中，在每孔中加入100μL 1x酶标记物，轻敲微孔板边缘混匀50s；然后在23℃避光孵育45min；

[0028] 步骤五、洗板3次，每次加入250μL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；加入TMB底物100 μl，轻敲微孔板边缘混匀50s，在23℃避光孵育30min，加入100 μL的终止液终止反应；

[0029] 步骤六、用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕，尽快在450nm下读OD值。

[0030] 步骤二所述的初步混匀的方法为使用最大速涡流4min；

[0031] 步骤三所述的除去样品溶剂的方法为在65℃水浴减压旋转蒸发干燥；

[0032] 所述的蛋白吸附剂按照以下方案制备：

[0033] 按照质量份数，将33份的苯乙烯/甲基苯乙烯/茚共聚物浸泡在70份的二氯乙烷中，溶胀13h；完成溶胀后，控温4℃，将含有1份的间甲苯甲酰过氧化苯甲酸的丙酮溶液85份，搅拌反应90min；反应完全，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；然后将样品加入到90份的含有3.2份硫代牛磺酸水溶液中，在55℃中超声反应22h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；然后将25份的样品加入到55份的含有6份牛磺脱氧胆酸水溶液中，用pH值调节剂将溶液调节pH为4.5，加入1.8份的十一碳烯酰水解大豆蛋白和1.9份的1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲，0.1份的大豆油基乙基吗啉氮鎓乙基硫酸盐, 0.02份的水杨酸钛在25℃中超声反应4h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次即可得到一种蛋白吸附剂。

[0034] 所述的pH值调节剂为15%的甲酸溶液。

[0035] 实施例2

[0036] 一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，其技术方案如下：

[0037] 步骤一、取去壳鸡蛋样品、均质；称取均质后鸡蛋样品2g放置于干净离心管中，加入1mL 1X样品提取液，然后加入0.1ml中性蛋白酶酶液(1.0%)，先在40℃水浴30min，然后在85℃水浴处理5min；

[0038] 步骤二、向处理好的样品加入3.5mL的乙腈和0.15g的蛋白吸附剂，初步混匀，然后用高速匀浆机，于9000rpm下匀浆40s；然后在20℃，使用3500r/min的转速离心250s；

[0039] 步骤三、移取2mL上清液到一个新的离心管中，将溶剂除去，加入0.3mL 样品稀释液和0.8mL 正己烷溶解干燥物，最大速涡流40s，溶解均匀；然后在20℃， 使用3500r/min的转速离心250s；弃去上层正己烷，取50μL下层液作检测；

[0040] 步骤四、分别加入50μL的标准品和样品于各自所设定的孔中，在每孔中加入100μL 1x酶标记物，轻敲微孔板边缘混匀40s；然后在20℃避光孵育45min；

[0041] 步骤五、洗板3次，每次加入250μL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；加入TMB底物100 μl，轻敲微孔板边缘混匀40s，在20℃避光孵育30min，加入100 μL的终止液终止反应；

[0042] 步骤六、用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕，尽快在450nm下读OD值。

[0043] 步骤二所述的初步混匀的方法为使用最大速涡流2min；

[0044] 步骤三所述的除去样品溶剂的方法为在60℃水浴氮气吹干；

[0045] 所述的蛋白吸附剂按照以下方案制备：

[0046] 按照质量份数，将30份的苯乙烯/甲基苯乙烯/茚共聚物浸泡在60份的二氯乙烷中，溶胀10h；完成溶胀后，控温2℃，将含有0.5份的间甲苯甲酰过氧化苯甲酸的丙酮溶液80份，搅拌反应60min；反应完全，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；然后将样品加入到80份的含有2.5份硫代牛磺酸水溶液中，在50℃中超声反应18h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；然后将20份的样品加入到50份的含有4份牛磺脱氧胆酸水溶液中，用pH值调节剂将溶液调节pH为4，加入1.6份的十一碳烯酰水解大豆蛋白和1.4份的1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲，0.05份的大豆油基乙基吗啉氮鎓乙基硫酸盐, 0.005份的水杨酸钛在20℃中超声反应2h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次即可得到一种蛋白吸附剂。

[0047] 所述的pH值调节剂为10%的甲酸溶液。

[0048] 实施例3

[0049] 一种改进型鸡蛋中甲硝唑快速测定方法，其技术方案如下：

[0050] 步骤一、取去壳鸡蛋样品、均质；称取均质后鸡蛋样品2g放置于干净离心管中，加入1mL 1X样品提取液，然后加入0.5ml中性蛋白酶酶液(1.0%-1.5%)，先在50℃水浴30-50min，然后在95℃水浴处理10min；

[0051] 步骤二、向处理好的样品加入5.5mL的乙腈和0.35g的蛋白吸附剂，初步混匀，然后用高速匀浆机，于10000rpm下匀浆60s；然后在25℃，使用4000r/min的转速离心300s；

[0052] 步骤三、移取2mL上清液到一个新的离心管中，将溶剂除去，加入0.7mL 样品稀释液和0.8-1.2mL 正己烷溶解干燥物，最大速涡流60s，溶解均匀；然后在25℃， 使用4000r/min的转速离心300s；弃去上层正己烷，取50μL下层液作检测；

[0053] 步骤四、分别加入50μL的标准品和样品于各自所设定的孔中，在每孔中加入100μL 1x酶标记物，轻敲微孔板边缘混匀60s；然后在25℃避光孵育45min；

[0054] 步骤五、洗板3次，每次加入250μL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；加入TMB底物100 μl，轻敲微孔板边缘混匀60s，在25℃避光孵育30min，加入100 μL的终止液终止反应；

[0055] 步骤六、用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕，尽快在450nm下读OD值。

[0056] 步骤二所述的初步混匀的方法为使用振荡器振荡15min；

[0057] 步骤三所述的除去样品溶剂的方法为在70℃水浴氮气吹干；

[0058] 所述的蛋白吸附剂按照以下方案制备：

[0059] 按照质量份数，将35份的苯乙烯/甲基苯乙烯/茚共聚物浸泡在80份的二氯乙烷中，溶胀15h；完成溶胀后，控温6℃，将含有1.5份的间甲苯甲酰过氧化苯甲酸的丙酮溶液90份，搅拌反应120min；反应完全，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；然后将样品加入到100份的含有3.8份硫代牛磺酸水溶液中，在60℃中超声反应24h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次；然后将30份的样品加入到60份的含有8份牛磺脱氧胆酸水溶液中，用pH值调节剂将溶液调节pH为5，加入2.0份的十一碳烯酰水解大豆蛋白和2.0份的1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲，0.5份的大豆油基乙基吗啉氮鎓乙基硫酸盐, 0.05份的水杨酸钛在30℃中超声反应6h；完成反应后，过滤，用乙醇、纯化水各洗涤三次即可得到一种蛋白吸附剂。

[0060] 所述的pH值调节剂为20%的甲酸溶液。

[0061] 对比例1

[0062] 不加蛋白吸附剂，其它同实施例1。

[0063] 对比例2

[0064] 不加硫代牛磺酸，其它同实施例1。

[0065] 对比例3

[0066] 不加牛磺脱氧胆酸，其它同实施例1。

[0067] 对比例4

[0068] 不加十一碳烯酰水解大豆蛋白，其它同实施例1。

[0069] 对比例5

[0070] 不加大豆油基乙基吗啉氮鎓乙基硫酸盐，其它同实施例1。

[0071] 对比例6

[0072] 不加水杨酸钛，其它同实施例1。

[0073] 表：不同工艺的检测方法的效果比较。

[0074]