一种三萜类化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一种三萜类化合物及其制备方法和应用。所述的三萜类化合物的结构式如式(Ⅰ)所示：与现有技术相比，本发明提供了一种结构新颖的三萜类化合物，以及它的制备方法和应用，该化合物的制备方法简单易操作。本发明申请人通过考察该化合物对多种肿瘤细胞株的抑制作用，结果表明该化合物具有较强的体外抗肿瘤活性，且对正常细胞的毒性较小，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

权利要求

1.一种三萜类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述的三萜类化合物的结构式如式(Ⅰ)所示：所述的制备方法包括如下步骤：

1)以羊开口为原料，以水和/或有机溶剂为溶媒进行提取，获得羊开口提取物；其中，所述的有机溶剂为丙酮、体积浓度为10-100％甲醇或体积浓度为10-100％乙醇；提取方式为常温浸提、加热提取或回流提取；

2)将羊开口提取物上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇组成的混合液或者是以石油醚和丙酮组成的混合液作为溶剂体系进行梯度洗脱，以TLC和HPLC-UV分析检测，收集含目标化合物的流分；所得含目标化合物的流分依次用反相色谱柱、葡聚糖凝胶柱、制备液相进行分离，即得到目标化合物；

步骤2)中，

当硅胶柱层析时所用的溶剂体系由二氯甲烷和甲醇组成时，二氯甲烷和甲醇的体积比为1000：1～1：1；

当硅胶柱层析时所用的溶剂体系由石油醚和丙酮组成时，石油醚和丙酮的体积比为

1000：1～1：1；

在用反相色谱柱分离时，洗脱剂为由甲醇和水按2：8～1：0的体积比组成的混合液或者是由乙腈和水按1：9～1：0的体积比组成的混合液，洗脱的方式为梯度洗脱；

在用葡聚糖凝胶柱分离时，洗脱剂为甲醇；

在用制备液相分离时，洗脱剂为体积浓度为40～50％的乙腈-0.3％三氟乙酸水溶液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，当硅胶柱层析时所用的溶剂体系由二氯甲烷和甲醇组成时，二氯甲烷和甲醇的体积比为100：1～1：1；

当硅胶柱层析时所用的溶剂体系由石油醚和丙酮组成时，石油醚和丙酮的体积比为

100：1～1：1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，当硅胶柱层析时所用的溶剂体系由二氯甲烷和甲醇组成时，二氯甲烷和甲醇的体积比为50：1～1：1；

当硅胶柱层析时所用的溶剂体系由石油醚和丙酮组成时，石油醚和丙酮的体积比为

50：1～1：1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为体积浓度为50-

100％甲醇或体积浓度为50-100％乙醇。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法，其特征在于，对羊开口提取物按下述方法a或方法b进行纯化以制得纯化后的提取物，再将纯化后的提取物上硅胶柱层析；

方法a：将羊开口提取物置于1～10％酒石酸水溶液中溶解，过滤得到酸水不溶物，从而得到纯化后的提取物；

方法b：将羊开口提取物依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，收集萃取后的部位，得到纯化后的提取物。

说明书

一种三萜类化合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一种三萜类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 羊开口是野牡丹科野牡丹属植物展毛野牡丹(Melastoma normale D.Don)和野牡丹(Melastoma malabathricum.Linn)的干燥根及茎。收载于《广西壮族自治区药材质量标准(第一卷)》2014年版。羊开口性微温，味甘、酸、涩，具有收敛、止血、解毒的功效，用于治疗泄痢、崩漏带下、内外伤出血等症状，主要分布于中国广西、云南、贵州、四川等省市以及东南亚部分国家，为酸性土壤指示植物，多数生长在山坡，路旁，河岸上的灌木丛中。羊开口中主要化合物有黄酮类、鞣酸、酚酸类、甾体类、萜类、酰胺类成分和氨基酸类等，其中鞣花酸具有多方面的药理活性。

[0003] 羊开口资源分布较广，所含化合物结构类型丰富，作为单方或者与其他药材组方配伍使用治疗腹泻、腹痛、痢疾、便血等症状都取得良好的治疗效果。但是，羊开口主要物质基础尚不明确，也鲜见有关药效成分的含量测定文献，其潜在的药理活性有待去发掘。

[0004] 有鉴于此特提出本发明。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖的三萜类化合物以及它的制备方法和应用。该结构新颖的三萜类化合物是从中药材羊开口中提取得到的。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0007] 一种三萜类化合物或其药学上可接受的盐，所述的三萜类化合物的结构式如式(Ⅰ)所示：

[0008]

[0009] 上述式(I)所示化合物的化学名称为：2，3-二羟基-23-氧代-12,20(30)-二烯-28-酸，分子式为C30H44O5，分子量为484.3189，理化性质如下：白色粉末，无臭，易溶于吡啶，可溶于二甲基亚砜、甲醇、乙醇，难溶于乙酸乙酯、水。

[0010] 本发明中，所述的三萜类化合物是从中药材羊开口中提取得到的。

[0011] 本发明还提供所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中，所述的制备方法包括如下步骤：

[0012] 1)以羊开口为原料，获得羊开口提取物；

[0013] 2)将羊开口提取物上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇组成的混合液或者是以石油醚和丙酮组成的混合液作为溶剂体系进行梯度洗脱，以TLC和HPLC-UV分析检测，收集含目标化合物的流分；所得含目标化合物的流分依次用反相色谱柱、葡聚糖凝胶柱、制备液相进行分离，即得到目标化合物。

[0014] 上述制备方法中，所述羊开口的为野牡丹科野牡丹属植物展毛野牡丹(Melastoma normale D.Don)和野牡丹(Melastoma malabathricum.Linn)的干燥根及茎，优选是以其干燥部分为原料。

[0015] 上述制备方法中，步骤2)中，

[0016] 当硅胶柱层析时所用的溶剂体系由二氯甲烷和甲醇组成时，二氯甲烷和甲醇的体积比为1000：1～1：1，优选为100：1～1：1，更优选为50：1～1：1；

[0017] 当硅胶柱层析时所用的溶剂体系由石油醚和丙酮组成时，石油醚和丙酮的体积比可以是1000：1～1：1，优选为100：1～1：1，更优选为50：1～1：1。

[0018] 上述制备方法中，步骤2)中，所得含目标化合物的流分依次用反相色谱柱、葡聚糖凝胶柱、制备液相进行分离时，它们所用的洗脱剂可以与现有技术中用于分离酚类化合物时所用的洗脱剂相同，优选的：

[0019] 在用反相色谱柱分离时，洗脱剂为由甲醇和水按2：8～1：0的体积比组成的混合液或者是由乙腈和水按1：9～1：0的体积比组成的混合液，洗脱的方式为梯度洗脱；

[0020] 在用葡聚糖凝胶柱分离时，洗脱剂为甲醇；

[0021] 在用制备液相分离时，洗脱剂为体积浓度为40～50％的乙腈-0.3％三氟乙酸水溶液。

[0022] 上述制备方法中，其中，步骤1)中获得羊开口提取物的方法与现有技术相同，具体可以是以羊开口为原料，以水和/或有机溶剂为溶媒进行提取，以获得羊开口提取物。

[0023] 其中，所述的有机溶剂为丙酮、体积浓度为10-100％甲醇或体积浓度为10-100％乙醇，优选为体积浓度为50-100％甲醇或体积浓度为50-100％乙醇。

[0024] 进一步的，所述的提取方式为常温浸提、加热提取或回流提取。

[0025] 上述制备方法中，对羊开口提取物按下述方法a或方法b进行纯化以制得纯化后的提取物，再将纯化后的提取物上硅胶柱层析；

[0026] 方法a：将羊开口提取物置于1～10％酒石酸水溶液中溶解，过滤得到酸水不溶物，从而得到纯化后的提取物；

[0027] 方法b：将羊开口提取物依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，收集萃取后的部位，得到纯化后的提取物。

[0028] 本发明还提供所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0029] 所述的抗肿瘤药物是以本发明所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分。

[0030] 优选，所述的抗肿瘤药物为以所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分与药学上可接受的辅料制成的药物；

[0031] 或者，所述的抗肿瘤药物为以所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，与抗肿瘤药物和药学上可接受的辅料制成的复方药物；

[0032] 或者，所述的抗肿瘤药物为以所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分与药学上可接受的辅料制成的药物与抗肿瘤药物组成的组合产品。

[0033] 本发明中，所述的抗肿瘤药物可以是以所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分与药学上可接受的辅料制成的药物；

[0034] 也可以是以所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，与抗肿瘤药物和药学上可接受的辅料制成的复方药物；这里所述的抗肿瘤药物为现有技术中常用的抗肿瘤药物。本发明中，可以将所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐与现有技术中常用的抗肿瘤药物一起作为活性成分，和药学上可接受的辅料制成复方制剂。

[0035] 也可以是以所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分与药学上可接受的辅料制成的药物与抗肿瘤药物组成的组合产品。本发明中以所述的三萜类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分与药学上可接受的辅料制成的药物可以与现有技术中常用的抗肿瘤进行联合使用。在联合使用时，不分先后。

[0036] 采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

[0037] 与现有技术相比，本发明提供了一种结构新颖的三萜类化合物，以及它的制备方法和应用，该化合物的制备方法简单易操作。本发明人通过考察该化合物对多种肿瘤细胞株的抑制作用，结果表明该化合物具有较强的体外抗肿瘤活性，且对正常细胞的毒性较小，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

具体实施方式

[0038] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0039] 实施例1

[0040] 1)取野牡丹科野牡丹属植物展毛野牡丹(Melastoma normale)的干燥根茎部分18.486kg，粉碎，用体积浓度为95％乙醇渗漉提取3次，合并提取液，减压回收溶剂，得到羊开口提取物；

[0041] 2)将羊开口提取物置于3％酒石酸水溶液优选是在pH＝2～3下进行，充分溶解后对料液进行过滤，除去水溶液，以收集的酸水不溶物作为纯化后的提取物；

[0042] 3)所得纯化后的提取物上硅胶柱层析进行梯度洗脱，溶剂体系为二氯甲烷和甲醇(100：1→1：1，体积比)，分段收集样品，以TLC进行划段合瓶得到14段流分，之后用HPLC-UV分析检测，发现第5段为含目标化合物的流分；将上述含目标化合物的流分经反相色谱柱ODS(洗脱剂为由甲醇和水按3：7→9：1的体积比组成的混合液，洗脱方式为梯度洗脱)、葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20，洗脱剂为甲醇，洗脱方式为等度洗脱)、制备液相(型号Shimadzu LC-6AD，YMC-Pack ODS-A column，洗脱剂为体积浓度为65％的乙腈0.3％三氟乙酸水溶液，洗脱方式为等度洗脱)分离，干燥，得到化合物1。

[0043] 对所得化合物用NMR和HRESIMS等进行结构分析，波谱数据如下所示；并用HPLC分析检测，化合物的纯度>94％。

[0044] 化合物1：

[0045] UVmax(MeOH)nm 201,231,255；

[0046] 1H NMR(400MHz,Pyr)δ9.94(1H,d,J＝5.2Hz),4.81(3H,d,J＝20Hz),4.20(3H,d,J＝8.8Hz),1.21(3H,s),1.12(3H,s),1.11(3H,s),1.00(3H,s),0.88(3H,s)。

[0047] 13C NMR(101MHz,Pyr)δ205.90(C-24),179.76(C-28),154.20(C-20),139.67(C-13),126.31(C-12),105.66(C-30),76.52(C-22),71.71(C-21),58.84(C-23),56.14(C-
18),48.73(C-10),47.72(C-1),46.19(C-9),46.11(C-5,43.21(C-14)),40.29(C-8),40.12(C-6),38.39(C-17),38.18(C-9),33.19(C-16),32.54(C-7),30.41(C-4),28.95(C-15),
25.30(C-11),24.70(C-3),24.19(C-27),22.88(C-2),18.05(C-26),17.10(C-29),15.56(C-25)。

[0048] HRESIMS m/z 483.3130[M-H]-。

[0049] 因此，可确定上述化合物1为2α，3β-二羟基-23-氧代-12,20(30)-二烯-28-酸(2α,3β-dihydroxy-23-oxo-12,20(30)-dien-28-oic acid)，其结构式如下述式(Ⅰ)所示：

[0050]

[0051] 实施例2：

[0052] 重复实施例1，不同的是：将步骤1)中的提取溶液由体积浓度为95％乙醇更改为体积浓度为75％乙醇。

[0053] 对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物2α，3β-二羟基-23-氧代-12,20(30)-二烯-28-酸(2α,3β-dihydroxy-23-oxo-12,20(30)-dien-28-oic acid)。

[0054] 实施例3

[0055] 重复实施例1，不同的是：将步骤1)中的提取溶液由体积浓度为95％乙醇更改为体积浓度为100％甲醇。

[0056] 对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物2α，3β-二羟基-23-氧代-12,20(30)-二烯-28-酸(2α,3β-dihydroxy-23-oxo-12,20(30)-dien-28-oic acid)。

[0057] 实施例4

[0058] 重复实施例1，不同的是：将步骤1)中的提取溶液由体积浓度为95％乙醇更改为丙酮。

[0059] 对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物2α，3β-二羟基-23-氧代-12,20(30)-二烯-28-酸(2α,3β-dihydroxy-23-oxo-12,20(30)-dien-28-oic acid)。

[0060] 实施例5

[0061] 重复实施例1，不同的是：将步骤1)中的提取溶液由体积浓度为95％乙醇更改为体积浓度为10％甲醇。

[0062] 对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物2α，3β-二羟基-23-氧代-12,20(30)-二烯-28-酸(2α,3β-dihydroxy-23-oxo-12,20(30)-dien-28-oic acid)。

[0063] 实施例6

[0064] 重复实施例1，不同的是：将步骤2)的纯化操作更改为下述方案：

[0065] 2)将羊开口提取物用石油醚萃取2次，收集水相，所得水相用乙酸乙酯萃取，收集水相，之后再用正丁醇萃取，收集水相，减压回收溶剂，得到纯化后的提取物。

[0066] 对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物2α，3β-二羟基-23-氧代-12,20(30)-二烯-28-酸(2α,3β-dihydroxy-23-oxo-12,20(30)-dien-28-oic acid)。

[0067] 实施例7

[0068] 重复实施例1，不同的是：省略步骤2)，将所得羊开口提取物直接上硅胶柱层析。

[0069] 对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物2α，3β-二羟基-23-氧代-12,20(30)-二烯-28-酸(2α,3β-dihydroxy-23-oxo-12,20(30)-dien-28-oic acid)。

[0070] 实验例：本发明所述三萜类化合物(按实施例1所述方法进行制备)的抗肿瘤作用研究

[0071] 以临床使用的肿瘤治疗药物5-氟尿嘧啶为阳性对照药，以相应溶剂作阴性对照，以人肺癌细胞株(A549)，人胃癌细胞株(MGC-803)，人前列腺癌细胞株(T24)，人子宫癌细胞株(HeLa)和人肝细胞癌细胞株(HepG2)为受试细胞株；用MTT法对化合物进行了体外抗肿瘤活性测试。

[0072] 将受试药物和细胞共同培养48h，根据预实验细胞生长速率的结果，接种一定密度的细胞190μL于96孔培养板(约5×104～1×105个/孔)。

[0073] 培养24h待细胞贴壁后，分别加入系列浓度的样品10μL，每个样品设5个复孔，其中乙醇终浓度<1％。另设阴性对照孔4个，加入10μL空白基质。

[0074] 细胞于饱和湿度、5％CO2，37℃条件下孵化48h，每孔加入10μL MTT(5mg/ml)，继续培养4h。

[0075] 吸去上清液，加入DMSO 150μL/孔，充分溶解后用酶标仪在测定波长为570nm和参考630nm处测定OD值，计算每个给药孔细胞增殖抑制率，并计算其IC50值，结果如下述表1所示：

[0076] 表1

[0077]

[0078] 由表1可知，本发明所述化合物体外对多种肿瘤细胞均有良好的抑制作用，超过了临床治疗人结肠癌的药物5-氟尿嘧啶，表明本发明所述化合物具有良好的抗肿瘤作用，且对正常细胞的毒性小，有望用于抗肿瘤药物的制备。

[0079] 以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本发明的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许变动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。