一种检测遗传性耳聋基因突变位点的方法及试剂盒转让专利
申请号 : CN201810612543.7
文献号 : CN108676869B
文献日 : 2021-11-05
发明人 : 蒋析文 , 黄桃生 , 林卫萍
申请人 : 广州达安基因股份有限公司
摘要 :
本发明提供了一种检测遗传性耳聋基因突变位点的方法及试剂盒，具体地本发明提供了一组能够有效扩增多个遗传性耳聋基因突变位点的引物对组，并设计了相应了检测探针，实验结果表明，本发明的引物对组具有极高的扩增效率和良好的特异性，由于可以对多个位点进行多重检测，因此本发明的引物对组和探针组极大的提高了检测效率并显著地降低了检测成本。
权利要求 :
1.一种检测遗传性耳聋基因突变位点的引物对组，其特征在于，所述引物对组包括第一引物对集和第二引物对集，所述第一引物对集由以下引物对组成：引物对1：
上游引物：CCCTGCCCCAACATCGTGGA(SEQ ID NO.:1)；
下游引物：CAGGCCTCGCAGGACCC(SEQ ID NO.:2)；
引物对2：
上游引物：ACCCCAGAAAACTACGATAGCC(SEQ ID NO.:3)；
下游引物：ACACTCTGGTTCGTCCAAGTGC(SEQ ID NO.:4)；
引物对3：
上游引物：AGCAAACCGCCCAGAGTAGAA(SEQ ID NO.:5)；
下游引物：CTCATCTCCCCACACCTCCTTT(SEQ ID NO.:6)；
引物对4：
上游引物：CACTACTTCCCCATCTCCCACAT(SEQ ID NO.:7)；
下游引物：GCCTTCGATGCGGACCTTCT(SEQ ID NO.:8)；
引物对5：
上游引物：TCCCAACACTGTGGACTGCTTT(SEQ ID NO.:9)；
下游引物：CCTCATCCCTCTCATGCTGTCTATT(SEQ ID NO.:10)；
引物对6：
上游引物：ATGCGGGTTCTTTGACGACAAC(SEQ ID NO.:11)；和下游引物：TGGAACCTTGACCCTCTTGAGATT(SEQ ID NO.:12)；
所述第二引物对集由以下引物对组成：
引物对7：
上游引物：TGAAGAACCTCAAGGAGTGAAGATTC(SEQ ID NO.:13)；
下游引物：ACACAAAGGGAAGAGGGTCTAGG(SEQ ID NO.:14)；
引物对8：
上游引物：GTTGTCATCCAGTCTCTTCCTTAGG(SEQ ID NO.:15)；
下游引物：GCCTTCCTCTGTTGCCATTCCT(SEQ ID NO.:16)；
引物对9：
上游引物：AACAAGGAATTATTAAAACCAATGG(SEQ ID NO.:17)；
下游引物：AGCATTGTAATTTTTTTCCAGG(SEQ ID NO.:18)；
引物对10：
上游引物：GCAAAGGAGGTGTGGGGA(SEQ ID NO.:19)；
下游引物：GGATGTGGGAGATGGGGAAGTAG(SEQ ID NO.:20)；和引物对11：
上游引物：CCCAACCAAGGAAATAGAGATTCAAGT(SEQ ID NO.:21)；
下游引物：GGACAACCCACATCATTTTACTATTGC(SEQ ID NO.:22)。
2.如权利要求1所述的引物对组，其特征在于，所述第一引物对集和所述第二引物对集用于多重不对称PCR。
3.如权利要求1所述的引物对组，其特征在于，各引物对中上游引物和下游引物的含量比为2‑10∶1。
4.如权利要求3所述的引物对组，其特征在于，各引物对中上游引物和下游引物的含量比为6‑3:1。
5.如权利要求1所述的引物对组，其特征在于，所述第一引物对集和/或所述第二引物对集中的各上游引物的5'端带有生物素标记修饰。
6.一种检测遗传性耳聋基因突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对组。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针组，其特征在于，所述探针组由以下探针组成：
GTTCACACCCCCCAGGA(SEQ ID NO.:23)、TGTTCACACCCCCAGGA(SEQ ID NO.:24)、TAGCATCATGGACCGTCA(SEQ ID NO.:25)、TAGCATCACGGACCGTCA(SEQ ID NO.:26)、GGTAGGTCGGGCAATGTA(SEQ ID NO.:27)、GGTAGGTCAGGCAATGTA(SEQ ID NO.:28)、CATGGACCGTCAAAAAGA(SEQ ID NO.:29)、CATGGACCATCAAAAAGA(SEQ ID NO.:30)、GCACACGTTCTTGCAGCC(SEQ ID NO.:31)、TGATCGTAGCTGGCTGCA(SEQ ID NO.:32)、TCTTCTCATGTCTCCGG(SEQ ID NO.:33)、TTCTTCTCGTCTCCGGTA(SEQ ID NO.:34)、CATTCAGCAGGATGCAAA(SEQ ID NO.:35)、TTCAGCCGTTAGGATGCA(SEQ ID NO.:36)、CAGCTGCAGGGCCCATAG(SEQ ID NO.:37)、CAGCTGCAGGCCCATAG(SEQ ID NO.:38)、TTATCGTCTGAAATAAAA(SEQ ID NO.:39)、TTATCGTCCGAAATAAAA(SEQ ID NO.:40)、GAAGATGTTGCTGATCCC(SEQ ID NO.:41)、AGAAGATGTAGCTGATCC(SEQ ID NO.:42)、GGCCGTGCGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:43)、GGCCATGTGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:44)、GGCCGTGTGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:45)、GGCCATGCGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:46)、ATAAAATACTTACTGTGG(SEQ ID NO.:47)、ATAAAATATTTACTGTGG (SEQ ID NO.:48)、GTCAAGCACAAGGCTATG(SEQ ID NO.:49)、GTCAAGCAGAAGGCTATG(SEQ ID NO.:50)、CCACCCGCAGTGATCTCA(SEQ ID NO.:51)、GCTGTGATCTCACTCC(SEQ ID NO.:52)、TTGAGGAGGGTGACGGGC(SEQ ID NO.:53)、TTGAGGAGAGTGACGGGC(SEQ ID NO.:54)、CGACTTGTCTCCTCTA(SEQ ID NO.:55)、和CGACTTGCCTCCTCTA(SEQ ID NO.:56)。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述探针组中各探针的5’端连接有GCGGA，并且所述探针组中各探针的3’端连接有TCCGC。
说明书 :
一种检测遗传性耳聋基因突变位点的方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种检测遗传性耳聋基因突变位点的方法及试剂盒。
背景技术
[0002] 基因检测可以使人们了解自己的基因信息，明确病因或预知身体患某种疾病的风险，即可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗
传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病
的诊断和某些常见病的辅助诊断。
传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病
的诊断和某些常见病的辅助诊断。
[0003] 基因突变检测可用于多种疾病的早期筛查、诊断及预后判断。多种恶性肿瘤，如恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、肺癌等存在不同比例的B‑raf基因突变；结直肠癌、胰腺
癌、肺癌等存在不同比例的K‑ras基因突变。良性肿瘤的患者若是检出B‑raf或K‑ras基因突
变，提示有肿瘤恶变的可能。PIK3CA基因突变检测，对肺癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤患者的
早期筛查、诊断及预后具有重要意义。
癌、肺癌等存在不同比例的K‑ras基因突变。良性肿瘤的患者若是检出B‑raf或K‑ras基因突
变，提示有肿瘤恶变的可能。PIK3CA基因突变检测，对肺癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤患者的
早期筛查、诊断及预后具有重要意义。
[0004] 遗传性耳聋是临床上最常见的遗传性疾病之一，根据第六次全国人口普查及第二次全国残疾人抽样调查显示我国听力残疾者约为2054万，占总残疾人口的24％。我国每年
新增约3万先天性聋儿，另外还将新增3～5万的迟发性、药物性耳聋患儿，其中约60％与遗
传因素有关，70％表现为非综合征型耳聋。但是目前，临床上仍然缺乏有效的快速检测遗传
性耳聋的方法。
新增约3万先天性聋儿，另外还将新增3～5万的迟发性、药物性耳聋患儿，其中约60％与遗
传因素有关，70％表现为非综合征型耳聋。但是目前，临床上仍然缺乏有效的快速检测遗传
性耳聋的方法。
[0005] 因此，本领域技术人员致力于开发遗传性耳聋的基因检测方法，以满足临床的需求。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种检测遗传性耳聋基因突变位点的方法及试剂盒。
[0007] 在本发明的第一方面，提供了一种检测遗传性耳聋基因突变位点的引物对组，所述引物对组包括第一引物对集，所述第一引物对集包括选自下组的一种或多种引物对：
[0008] 引物对1：
[0009] 上游引物：CCCTGCCCCAACATCGTGGA(SEQ ID NO.:1)；
[0010] 下游引物：CAGGCCTCGCAGGACCC(SEQ ID NO.:2)；
[0011] 引物对2：
[0012] 上游引物：ACCCCAGAAAACTACGATAGCC(SEQ ID NO.:3)；
[0013] 下游引物：ACACTCTGGTTCGTCCAAGTGC(SEQ ID NO.:4)；
[0014] 引物对3：
[0015] 上游引物：AGCAAACCGCCCAGAGTAGAA(SEQ ID NO.:5)；
[0016] 下游引物：CTCATCTCCCCACACCTCCTTT(SEQ ID NO.:6)；
[0017] 引物对4：
[0018] 上游引物：CACTACTTCCCCATCTCCCACAT(SEQ ID NO.:7)；
[0019] 下游引物：GCCTTCGATGCGGACCTTCT(SEQ ID NO.:8)；
[0020] 引物对5：
[0021] 上游引物：TCCCAACACTGTGGACTGCTTT(SEQ ID NO.:9)；
[0022] 下游引物：CCTCATCCCTCTCATGCTGTCTATT(SEQ ID NO.:10)；
[0023] 引物对6：
[0024] 上游引物：ATGCGGGTTCTTTGACGACAAC(SEQ ID NO.:11)；
[0025] 下游引物：TGGAACCTTGACCCTCTTGAGATT(SEQ ID NO.:12)。
[0026] 在另一优选例中，所述第一引物对集包括选自所述引物对1至所述引物对6中的至少两种引物对。
[0027] 在另一优选例中，所述第一引物对集包括所述引物对1至所诉和引物对6中的6种引物对。
[0028] 在另一优选例中，所述引物对组还包括第二引物对集，所述第二引物对集包括选自下组的一种或多种引物对
[0029] 引物对7：
[0030] 上游引物：TGAAGAACCTCAAGGAGTGAAGATTC(SEQ ID NO.:13)；
[0031] 下游引物：ACACAAAGGGAAGAGGGTCTAGG(SEQ ID NO.:14)；
[0032] 引物对8：
[0033] 上游引物：GTTGTCATCCAGTCTCTTCCTTAGG(SEQ ID NO.:15)；
[0034] 下游引物：GCCTTCCTCTGTTGCCATTCCT(SEQ ID NO.:16)；
[0035] 引物对9：
[0036] 上游引物：AACAAGGAATTATTAAAACCAATGG(SEQ ID NO.:17)；
[0037] 下游引物：AGCATTGTAATTTTTTTCCAGG(SEQ ID NO.:18)；
[0038] 引物对10：
[0039] 上游引物：GCAAAGGAGGTGTGGGGA(SEQ ID NO.:19)；
[0040] 下游引物：GGATGTGGGAGATGGGGAAGTAG(SEQ ID NO.:20)；
[0041] 引物对11：
[0042] 上游引物：CCCAACCAAGGAAATAGAGATTCAAGT(SEQ ID NO.:21)；
[0043] 下游引物：GGACAACCCACATCATTTTACTATTGC(SEQ ID NO.:22)。
[0044] 在另一优选例中，所述第二引物对集包括选自引物对7至引物对11中的至少两种引物对。
[0045] 在另一优选例中，所述第二引物对集包括所述引物对7至所述引物对11中的5种引物对。
[0046] 在另一优选例中，所述第一引物对集和/或所述第二引物对集用于多重不对称PCR。
[0047] 在另一优选例中，所述引物对组中，各引物对中上游引物和下游引物的含量比为2‑10∶1；优选为6‑3:1。
[0048] 在另一优选例中，所述第一引物对集和/或所述第二引物对集中的各上游引物的5'端带有生物素标记修饰。
[0049] 本发明的第二方面，提供了一种检测遗传性耳聋基因突变位点的探针组，所述探针组包括选自下组的一种或多种探针：
[0050] GTTCACACCCCCCAGGA(SEQ ID NO.:23)、TGTTCACACCCCCAGGA(SEQ ID NO.:24)、TAGCATCATGGACCGTCA(SEQ ID NO.:25)、TAGCATCACGGACCGTCA(SEQ ID NO.:26)、
GGTAGGTCGGGCAATGTA(SEQ ID NO.:27)、GGTAGGTCAGGCAATGTA(SEQ ID NO.:28)、
CATGGACCGTCAAAAAGA(SEQ ID NO.:29)、CATGGACCATCAAAAAGA(SEQ ID NO.:30)、
GCACACGTTCTTGCAGCC(SEQ ID NO.:31)、TGATCGTAGCTGGCTGCA(SEQ ID NO.:32)、
TCTTCTCATGTCTCCGG(SEQ ID NO.:33)、TTCTTCTCGTCTCCGGTA(SEQ ID NO.:34)、
CATTCAGCAGGATGCAAA(SEQ ID NO.:35)、TTCAGCCGTTAGGATGCA(SEQ ID NO.:36)、
CAGCTGCAGGGCCCATAG(SEQ ID NO.:37)、CAGCTGCAGGCCCATAG(SEQ ID NO.:38)、
TTATCGTCTGAAATAAAA(SEQ ID NO.:39)、TTATCGTCCGAAATAAAA(SEQ ID NO.:40)、
GAAGATGTTGCTGATCCC(SEQ ID NO.:41)、AGAAGATGTAGCTGATCC(SEQ ID NO.:42)、
GGCCGTGCGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:43)、GGCCATGTGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:44)、
GGCCGTGTGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:45)、GGCCATGCGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:46)、
ATAAAATACTTACTGTGG(SEQ ID NO.:47)、ATAAAATATTTACTGTGG(SEQ ID NO.:48)、
GTCAAGCACAAGGCTATG(SEQ ID NO.:49)、GTCAAGCAGAAGGCTATG(SEQ ID NO.:50)、
CCACCCGCAGTGATCTCA(SEQ ID NO.:51)、GCTGTGATCTCACTCC(SEQ ID NO.:52)、
TTGAGGAGGGTGACGGGC(SEQ ID NO.:53)、TTGAGGAGAGTGACGGGC(SEQ ID NO.:54)、
CGACTTGTCTCCTCTA(SEQ ID NO.:55)、和CGACTTGCCTCCTCTA(SEQ ID NO.:56)。
GGTAGGTCGGGCAATGTA(SEQ ID NO.:27)、GGTAGGTCAGGCAATGTA(SEQ ID NO.:28)、
CATGGACCGTCAAAAAGA(SEQ ID NO.:29)、CATGGACCATCAAAAAGA(SEQ ID NO.:30)、
GCACACGTTCTTGCAGCC(SEQ ID NO.:31)、TGATCGTAGCTGGCTGCA(SEQ ID NO.:32)、
TCTTCTCATGTCTCCGG(SEQ ID NO.:33)、TTCTTCTCGTCTCCGGTA(SEQ ID NO.:34)、
CATTCAGCAGGATGCAAA(SEQ ID NO.:35)、TTCAGCCGTTAGGATGCA(SEQ ID NO.:36)、
CAGCTGCAGGGCCCATAG(SEQ ID NO.:37)、CAGCTGCAGGCCCATAG(SEQ ID NO.:38)、
TTATCGTCTGAAATAAAA(SEQ ID NO.:39)、TTATCGTCCGAAATAAAA(SEQ ID NO.:40)、
GAAGATGTTGCTGATCCC(SEQ ID NO.:41)、AGAAGATGTAGCTGATCC(SEQ ID NO.:42)、
GGCCGTGCGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:43)、GGCCATGTGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:44)、
GGCCGTGTGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:45)、GGCCATGCGGGAAAGAGC(SEQ ID NO.:46)、
ATAAAATACTTACTGTGG(SEQ ID NO.:47)、ATAAAATATTTACTGTGG(SEQ ID NO.:48)、
GTCAAGCACAAGGCTATG(SEQ ID NO.:49)、GTCAAGCAGAAGGCTATG(SEQ ID NO.:50)、
CCACCCGCAGTGATCTCA(SEQ ID NO.:51)、GCTGTGATCTCACTCC(SEQ ID NO.:52)、
TTGAGGAGGGTGACGGGC(SEQ ID NO.:53)、TTGAGGAGAGTGACGGGC(SEQ ID NO.:54)、
CGACTTGTCTCCTCTA(SEQ ID NO.:55)、和CGACTTGCCTCCTCTA(SEQ ID NO.:56)。
[0051] 在另一优选例中，所述探针组中各探针的5’端连接有GCGGA，并且所述探针组中各探针的3’端连接有TCCGC。
[0052] 在另一优选例中，所述探针组包括SEQ ID NO.:23至SEQ ID NO.:56所示的探针。
[0053] 本发明的第三方面，提供了一种检测遗传性耳聋基因突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对组。
[0054] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。
[0055] 本发明的第四方面，提供了一种检测遗传性耳聋基因突变位点的方法，所述方法包括步骤：
[0056] (1)使用本发明第一方面所述的引物组PCR扩增待检样本中的目标核酸序列，获得PCR扩增产物；
[0057] (2)使用本发明第二方面所述的探针组和步骤(1)获得的PCR扩增产物杂交，并检测杂交信号。
[0058] 在另一优选例中，所述步骤(1)中的PCR扩增为多重不对称PCR扩增。
[0059] 在另一优选例中，所述步骤(1)中分别在第一PCR扩增体系和第二PCR扩增体系中进行PCR扩增反应，所述第一PCR扩增体系中使用所述第一引物对集进行PCR扩增；所述第二
PCR扩增体系中使用所述第二引物对集进行PCR扩增。
PCR扩增体系中使用所述第二引物对集进行PCR扩增。
[0060] 在另一优选例中，所述步骤(1)中第一PCR扩增体系和/或第二PCR扩增体系为:总2+
PCR反应体系为50ul，包括16.7mMdNTPs、4mM Mg 、12U TaqHS，以及最低检测限为5ng/ul、标
本基因组DNA 5ul，空白对照用相应体积的无菌水代替标本。
PCR反应体系为50ul，包括16.7mMdNTPs、4mM Mg 、12U TaqHS，以及最低检测限为5ng/ul、标
本基因组DNA 5ul，空白对照用相应体积的无菌水代替标本。
[0061] 进一步地，所述步骤(1)中PCR扩增程序为:50℃3分钟、95℃15分钟、94℃30秒、55℃45秒、72℃30秒(94℃30秒、55℃30秒、72℃45次循环)72℃7分钟，4℃保存。
[0062] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
此不再一一累述。
附图说明
[0063] 图1是针对35delG突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0064] 图2是针对2162C>T突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0065] 图3是针对176_191del 16突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0066] 图4是针对工235delC突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中比值的对比图；
[0067] 图5是针对299_300delAT突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0068] 图6是针对511_512isAACG突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0069] 图7是针对538C>T突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0070] 图8是针对工1174A>T突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0071] 图9是针对1226G>A突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0072] 图10是针对1229C>T突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0073] 图11是针对工1975G>C突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0074] 图12是针对2027T>A突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
[0075] 图13是针对2168A>G突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。
[0076] 图14是针对IVS‑7A>G突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。
[0077] 图15是针对IVS15+5G>A突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。
[0078] 图16是针对1494C>T突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。
[0079] 图17是针对1555A>G突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。
具体实施方式
[0080] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一组能够有效扩增多个遗传性耳聋基因突变位点的引物对组，并设计了相应了检测探针，实验结果表明，本发明的引物对组具有极高
的扩增效率和良好的特异性，由于可以对多个位点进行多重检测，因此本发明的引物对组
和探针组极大的提高了检测效率并显著地降低了检测成本。在此基础上，完成了本发明。
的扩增效率和良好的特异性，由于可以对多个位点进行多重检测，因此本发明的引物对组
和探针组极大的提高了检测效率并显著地降低了检测成本。在此基础上，完成了本发明。
[0081] 在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并
且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
[0082] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语
“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和
101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和
101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0083] 虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
[0084] 遗传性耳聋相关基因基位点突变的检测
[0085] 遗传性耳聋是临床上最常见的遗传性疾病之一，研究表明，中国人群中与耳聋相关常见的致病基因分别为GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA及GJB3。GJB2基因是引起非综合
征型耳聋最常见的致病基因，该基因突变导致的耳聋表型多样，主要表现为先天性耳聋，还
可表现为非先天性语前聋、语后聋及迟发性聋，患者需及时明确病因并尽早接受医学干预，
否则会错过听力语言康复训练的最佳时期，最终导致聋哑残疾。SLC26A4基因是引起迟发性
耳聋的主要致病基因之一，与大前庭水管综合征的发生密切相关。迟发性耳聋患者出生时
听力可能正常，若有感冒、颅脑外伤、剧烈运动等诱因，可发展成重度耳聋或全聋。线粒体
12S rRNA基因突变患者对氨基糖甙类药物敏感，使用该类药物可导致“一针致聋”现象，在
临床上如果不采用基因筛查方法很难在药物致聋前发现，携带该基因突变患者需终身避免
使用氨基糖甙类药物。GJB3基因突变主要与迟发性高频听力下降相关，患者需长期密切关
注听力状况。本发明基于PCR多重不对称扩增技术，可以定性检测外周全血样本的人基因组
DNA中与遗传性耳聋相关的17个突变位点，包括GJB2基因上的35delG、109G>A、176_
191del16、235delC、299_300delAT、511_512insAACG位点；GJB3基因上的538C>T位点；
SLC26A4基因上的1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2168A>G、IVS‑7A>G、IVS15
+5G>A位点和线粒体12SrRNA基因上的1494C>T、1555A>G位点。
征型耳聋最常见的致病基因，该基因突变导致的耳聋表型多样，主要表现为先天性耳聋，还
可表现为非先天性语前聋、语后聋及迟发性聋，患者需及时明确病因并尽早接受医学干预，
否则会错过听力语言康复训练的最佳时期，最终导致聋哑残疾。SLC26A4基因是引起迟发性
耳聋的主要致病基因之一，与大前庭水管综合征的发生密切相关。迟发性耳聋患者出生时
听力可能正常，若有感冒、颅脑外伤、剧烈运动等诱因，可发展成重度耳聋或全聋。线粒体
12S rRNA基因突变患者对氨基糖甙类药物敏感，使用该类药物可导致“一针致聋”现象，在
临床上如果不采用基因筛查方法很难在药物致聋前发现，携带该基因突变患者需终身避免
使用氨基糖甙类药物。GJB3基因突变主要与迟发性高频听力下降相关，患者需长期密切关
注听力状况。本发明基于PCR多重不对称扩增技术，可以定性检测外周全血样本的人基因组
DNA中与遗传性耳聋相关的17个突变位点，包括GJB2基因上的35delG、109G>A、176_
191del16、235delC、299_300delAT、511_512insAACG位点；GJB3基因上的538C>T位点；
SLC26A4基因上的1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2168A>G、IVS‑7A>G、IVS15
+5G>A位点和线粒体12SrRNA基因上的1494C>T、1555A>G位点。
[0086] 多重不对称PCR
[0087] 多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作
过程与一般PCR相同。
过程与一般PCR相同。
[0088] 不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50‑100∶1。在PCR
反应的最初10‑15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消
耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键
是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。还有一种方法是先用等浓
度的引物PCR扩增，制备双链DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进
行第二次PCR，制备ssDNA。不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定。
反应的最初10‑15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消
耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键
是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。还有一种方法是先用等浓
度的引物PCR扩增，制备双链DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进
行第二次PCR，制备ssDNA。不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定。
[0089] 影响多重不对称PCR反应的因素有很多，比如：
[0090] (1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制
剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处
于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法
检测。
剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处
于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法
检测。
[0091] (2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
[0092] (3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
[0093] (4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的
竟争，影响扩增效率。
竟争，影响扩增效率。
[0094] 虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
[0095] 本发明人在研究过程中，对十七项遗传性耳聋基因点突变的引物进行了设计及实验验证。结果表明，使用多重PCR扩增体系，同时检测该17项遗传性耳聋基因突变的难度极
大。经过深入研究和反复实验，本发明人意外发现，将筛选获得的针对该17项遗传性耳聋基
因突变的引物对分两组(即第一引物对集和第二引物对集)进行多重PCR扩增，可以有效解
决引物对之间相互干扰的问题。
大。经过深入研究和反复实验，本发明人意外发现，将筛选获得的针对该17项遗传性耳聋基
因突变的引物对分两组(即第一引物对集和第二引物对集)进行多重PCR扩增，可以有效解
决引物对之间相互干扰的问题。
[0096] 在本发明的一个优选地实施方式中，提供了一组检测遗传性耳聋点突变的引物对组，所述的引物对组包括第一引物对集和第二引物对集，其中第一引物对集包括引物对1至
引物对6；第二引物对集包括引物对7至引物对11，具体如下表所示：
引物对6；第二引物对集包括引物对7至引物对11，具体如下表所示：
[0097] 表1
[0098]
[0099] 在本发明的一个优选地实施方式中，在上游引物的5'端带有生物素标记修饰。
[0100] 在本发明的另一个实施方式中，提供了一组基于液相芯片检测遗传性耳聋相关基因突变的探针(组)。
[0101] 该组探针包括十七项遗传性耳聋相关基因基因突变中常见的发生单碱基突变的种突变类型，对野生型、位点检测的特异性和敏感性好，能够快速灵敏地检测待测位点基因
突变类型。
突变类型。
[0102] 在本发明的一个优选地实施方式中，检测遗传性耳聋相关基因位点突变的探针，如下表所示：
[0103] 表2
[0104]
[0105]
[0106] 注：N表示野生型探针，M表示位点探针，POS为质控点，(+)前一个碱基进行锁核酸修饰。下划线处为反向互补的“茎区”。
[0107] 在本发明的一个优选地实施方式中，各探针的5'端带有连接臂，可以和液相芯片所用的微珠的‑COOH基团发生化学偶联反应，使得探针连接到微珠上；进一步地，连接臂优
选为NH2(CH2)12‑连接臂。
选为NH2(CH2)12‑连接臂。
[0108] 本发明探针具有反向互补结构，5’端含丰富的GC，与3’端互补，形成稳定的发夹结构。
[0109] 本发明基于Luminex液相芯片开发的试剂盒，可用于快速检测耳聋相关基因GJB2、GJB3、SLC26A4、12SrRNA基因共计17个位点的基因型别。
[0110] 本发明的主要优点在于：
[0111] (1)本发明提供了能够有效扩增多个遗传性耳聋基因突变位点的引物对组，实验结果表明，本发明的引物对组具有极高的扩增效率和良好的特异性；
[0112] (2)本发明提供了一组能够有效检测多个遗传性耳聋基因突变位点的探针组，实验结果表明，本发明的探针组具有极高的灵敏度和良好的特异性；
[0113] (3)本发明的提供的检测遗传性耳聋基因突变位点的方法，可以对多个位点进行多重检测，因此本发明的方法极大的提高了检测效率并显著地降低了检测成本；
[0114] (4)本发明的基因检测方法，与现有的基因检测方法相比，检测速度大大提升。
[0115] (5)本发明的基因检测方法，检测结果易于分析处理，适合临床大范围推广使用。
[0116] 下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条
件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)
中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计
算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)
中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计
算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0117] 实施例1遗传性耳聋基因点突变的检测
[0118] (1)样本PCR扩增
[0119] 设计并合成本发明的适于液相芯片检测十七项遗传性耳聋基因点突变的引物，引物序列如表1所示。提取样本的基因组DNA，针对所检测的突变位点，先通过PCR把包含突变
位点的片段进行PCR扩增，采用多重不对称PCR的方法在两个离心管(A管和B管，其中A管使
用第一引物对集，B管中使用第二引物对集)中把本发明探针所检测的如表1所列的17个突
变位点全部扩增出来。总PCR反应体系为50ul，主要包括0.4ul 0.5M的MgCl2，1.8ul体积的
16.7mM的dNTPs、12U达安基因生产的TaqHS，1M Tris‑HCl(pH8.8)以及15ul标本基因组DNA
(空白对照用无菌水代替标本基因组DNA)。PCR扩增条件为:50℃3分钟，95℃预变性15分钟，
然后按94℃30秒→55℃30秒→72℃30秒扩增45个循环，72℃延伸7分钟。
位点的片段进行PCR扩增，采用多重不对称PCR的方法在两个离心管(A管和B管，其中A管使
用第一引物对集，B管中使用第二引物对集)中把本发明探针所检测的如表1所列的17个突
变位点全部扩增出来。总PCR反应体系为50ul，主要包括0.4ul 0.5M的MgCl2，1.8ul体积的
16.7mM的dNTPs、12U达安基因生产的TaqHS，1M Tris‑HCl(pH8.8)以及15ul标本基因组DNA
(空白对照用无菌水代替标本基因组DNA)。PCR扩增条件为:50℃3分钟，95℃预变性15分钟，
然后按94℃30秒→55℃30秒→72℃30秒扩增45个循环，72℃延伸7分钟。
[0120] (2)探针偶联
[0121] 在合成表2所列出液相芯片检测十七项遗传性耳聋基因点突变的探针时，在探针的5'端带上NH2(CH2)12‑连接臂，NH2‑基团可以和液相芯片微球表面的‑‑COOH基团发生化学
偶联反应，使得探针连接到Luminex公司Microspheres微珠上。不同编码的微珠偶联不同的
5
探针，如表3所示。探针与微珠偶联的步骤为:取出40ul(5×10个)需要的微珠，12000rpm离
心2min后弃上清，加入50u1 0.1M的MESpH4.5，混匀。将所用的探针稀释至100uM在偶联体系
中加入1ul。第一次加入2.5ul 10mg/ml的EDC，混匀后避光放置30min。重复再加入一次EDC，
混匀避光放置30min。用0.5ml0.02％Tween和0.1％SDS各洗一次，最后将微珠重新悬浮于
40ulTE(pH8.0)溶液中，混匀后使用血细胞计数器计数微珠数量(计数四角4个大方格的数
目后换算为每微升微珠个数)。4℃避光保存。混合偶联好的探针的微珠，使用1.5×TMAC稀
释至每种微珠的浓度是约1500个/ul。
偶联反应，使得探针连接到Luminex公司Microspheres微珠上。不同编码的微珠偶联不同的
5
探针，如表3所示。探针与微珠偶联的步骤为:取出40ul(5×10个)需要的微珠，12000rpm离
心2min后弃上清，加入50u1 0.1M的MESpH4.5，混匀。将所用的探针稀释至100uM在偶联体系
中加入1ul。第一次加入2.5ul 10mg/ml的EDC，混匀后避光放置30min。重复再加入一次EDC，
混匀避光放置30min。用0.5ml0.02％Tween和0.1％SDS各洗一次，最后将微珠重新悬浮于
40ulTE(pH8.0)溶液中，混匀后使用血细胞计数器计数微珠数量(计数四角4个大方格的数
目后换算为每微升微珠个数)。4℃避光保存。混合偶联好的探针的微珠，使用1.5×TMAC稀
释至每种微珠的浓度是约1500个/ul。
[0122] 表3.不同编码的微珠所偶联的探针
[0123]
[0124]
[0125] (3)PCR产物和偶联好探针的微珠进行杂交并检测杂交信号
[0126] 为同时检测96个样本，在15ml的1.5×TMACTE(TriS‑EDTA)杂交缓冲液中，加入每种偶联有探针的微珠2000个进行建库，得到杂交缓冲液和微珠的混合液。将杂交缓冲液和
微珠的混合液分装到反应孔，每孔45ul，PCR产物A和B管各取2.5u1加入反应孔。在55℃下进
行杂交反应15min后，加入25ul浓度为0.02mg/ul的SAPE溶液，继续于55℃孵育15min，得到
杂交产物。利用在液相芯片检测仪Luminex200(LuminexCorp.，Austin，USA)上分析获得NET
MFI值。在相同的试验条件下将常规探针(即各探针5’端不含GCGGA、3’端不含TCCGC，且无锁
核酸修饰)与本发明的探针的检测结果进行对比，结果如图1‑图17所示，本发明的探针能增
加N/M探针信号的比值在野生型样本和突变携带者之间的差异，使得检测准确度增加，即增
强了探针的特异性。
微珠的混合液分装到反应孔，每孔45ul，PCR产物A和B管各取2.5u1加入反应孔。在55℃下进
行杂交反应15min后，加入25ul浓度为0.02mg/ul的SAPE溶液，继续于55℃孵育15min，得到
杂交产物。利用在液相芯片检测仪Luminex200(LuminexCorp.，Austin，USA)上分析获得NET
MFI值。在相同的试验条件下将常规探针(即各探针5’端不含GCGGA、3’端不含TCCGC，且无锁
核酸修饰)与本发明的探针的检测结果进行对比，结果如图1‑图17所示，本发明的探针能增
加N/M探针信号的比值在野生型样本和突变携带者之间的差异，使得检测准确度增加，即增
强了探针的特异性。
[0127] 对比例1
[0128] 其它步骤基本同实施例1，不同在于步骤(1)中进行多重不对称PCR时，不分A、B管，将所有引物对放在同一管中进行PCR，实验结果表明仅4对引物(引物对3、引物对5、引物对
6、引物对9)获得扩增，其余7对引物无法扩增，引物中存在相互抑制情况。
6、引物对9)获得扩增，其余7对引物无法扩增，引物中存在相互抑制情况。
[0129] 对比例2
[0130] 其它步骤基本同实施例1，不同在于步骤(1)中进行多重不对称PCR时，A管中引物对包括：引物对1、引物对2、引物对4、引物对9、引物对10、引物对11；B管中引物对包括：引物
对3、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8。进行多重不对称PCR的实验结果表明，A管中仅引
物对1、2、4获得扩增，引物对9、10无法扩增；B管中仅引物对7、8获得扩增，引物对3、引物对
5、引物对6无法扩增。
对3、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8。进行多重不对称PCR的实验结果表明，A管中仅引
物对1、2、4获得扩增，引物对9、10无法扩增；B管中仅引物对7、8获得扩增，引物对3、引物对
5、引物对6无法扩增。
[0131] 对比例3
[0132] 其它步骤基本同实施例1，不同在于步骤(1)中进行多重不对称PCR时，A管中引物对包括：引物对1’、引物对2’、引物对3’。进行多重不对称PCR的实验结果表明存在大量引物
二聚体，引物间相互抑制明显，无法获得目的基因扩增产物。
二聚体，引物间相互抑制明显，无法获得目的基因扩增产物。
[0133] 表4
[0134]
[0135] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
围。
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
围。