一种抑制棉花霉菌生长的复合配剂

摘要

本发明公开了一种抑制棉花霉菌生长的复合配剂，是以中草药醇提液与酮康唑进行复配后获得的复合配剂；所述中草药醇提液为丁香醇提液、黄柏醇提液、丹参醇提液和黄连醇提液。本发明采用牛津杯法对引起棉花霉变的曲霉菌、镰刀霉菌和青霉菌三种霉菌进行抑制效果的筛选，通过观察抑菌圈的直径大小，结果表明本发明复合配剂对引起棉花霉变的曲霉菌、镰刀霉菌和青霉菌这三株霉菌的具有优异的综合抑菌效果。

权利要求

1.一种抑制棉花霉菌生长的复合配剂，其特征在于：所述复合配剂是以中草药醇提液与酮康唑进行复配后获得的复合配剂；

所述中草药醇提液为丁香醇提液、黄柏醇提液、丹参醇提液和黄连醇提液；

复合配剂中，酮康唑、丁香醇提液、黄柏醇提液、丹参醇提液和黄连醇提液的体积比为

0：3：2：1：4、1：1：1：1：1或2：1：4：0：3。

2.根据权利要求1所述的复合配剂，其特征在于：复合配剂中，酮康唑、丁香醇提液、黄柏醇提液、丹参醇提液和黄连醇提液的体积比为

0：3：2：1：4。

3.根据权利要求1所述的复合配剂，其特征在于：所述丁香醇提液、黄柏醇提液、丹参醇提液和黄连醇提液的浓度均为0.5g/mL；酮康唑的浓度为2-2.5mg/mL。

4.根据权利要求1所述的复合配剂，其特征在于：所述中草药醇提液是通过如下方法制备获得：

将中草药粉碎成3-5mm的颗粒，称取100g中草药颗粒置于锥形瓶内，加入500mL无水乙醇，120rpm摇床萃取24h，过滤，收集滤液；滤渣按照上述参数进行二次萃取；合并两次滤液，蒸馏除去80-90％的乙醇，在8000rpm下离心15min，收集上清液并补加无水乙醇至200mL，即得到浓度为0.5g/mL的中草药醇提液，4℃保存备用。

说明书

一种抑制棉花霉菌生长的复合配剂

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抑制霉菌生长的复合配剂，具体地说是一种抑制棉花霉菌生长的复合配剂。

背景技术

[0002] 棉花是我国第三大农作物，占有重要的经济地位。棉花在储存的过程中要求比较严格，一旦储存的温度、湿度等条件不当，容易引起棉花的霉变。每年，由于棉花霉变所造成的损失是巨大的。目前，关于棉花霉变的微生物以及对其控制作用的研究较少。本发明旨在抑制棉花霉菌的生长，为棉花的储存提供了一定的参考。

发明内容

[0003] 为了避免上述现有技术所存在的技术问题，本发明旨在提供一种抑制棉花霉菌生长的复合配剂。

[0004] 经过实验研究发现，引起棉花霉变的主要霉菌是曲霉菌(Aspergillussp.)、镰刀霉菌(Fusarium sp.)和青霉菌(Penicilliumsp.)。三株霉菌已交由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)冻干保藏，菌种保藏号分别为曲霉菌(CCTCC AF 2018003)，镰刀霉菌(CCTCC AF 2018002)，青霉菌(CCTCC AF 2018004)。本申请以中草药为材料，利用无水乙醇对中草药进行醇提。以曲霉菌、镰刀霉菌和青霉菌为研究对象，通过牛津杯法筛选中草药醇提液，达到抑制三种霉菌生长的效果。

[0005] 本发明抑制棉花霉菌生长的复合配剂，是以中草药醇提液与酮康唑进行复配后获得的复合配剂。

[0006] 所述中草药醇提液为丁香醇提液、黄柏醇提液、丹参醇提液和黄连醇提液。

[0007] 复合配剂中，酮康唑、丁香醇提液、黄柏醇提液、丹参醇提液和黄连醇提液的体积比为0：3：2：1：4、1：1：1：1：1或2：1：4：0：3，优选为0：3：2：1：4。

[0008] 所述丁香醇提液、黄柏醇提液、丹参醇提液和黄连醇提液的浓度均为0.5g/mL；酮康唑的浓度为2-2.5mg/mL。

[0009] 所述中草药醇提液是通过如下方法制备获得：

[0010] 1、将中草药粉碎成3-5mm的颗粒，以利于脂溶性成分的提取。

[0011] 2、称取100g中草药颗粒置于锥形瓶内，加入500mL无水乙醇，120rpm摇床萃取24h，过滤，收集滤液；滤渣按照上述参数进行二次萃取；合并两次滤液，蒸馏除去80-90％的乙醇，在8000rpm下离心15min，收集上清液并补加无水乙醇至200mL，即得到浓度为0.5g/mL的中草药醇提液，4℃保存备用。不同种类的中草药按照上述方法分别提取。

[0012] 本发明采用牛津杯法对引起棉花霉变的曲霉菌、镰刀霉菌和青霉菌三种霉菌进行抑制效果的筛选。通过观察抑菌圈的直径大小，结果表明复合配剂B1的整体抑菌效果最佳，也就是说最佳复合配剂的配比方案为(丁香：黄柏：丹参：黄连＝3：2：1：4)，这种复合配剂对引起棉花霉变的曲霉菌、镰刀霉菌和青霉菌这三株霉菌的综合抑菌效果最佳。

[0013] 本发明以常见的中草药为原料，利用无水乙醇对中草药进行浸提萃取，研究不同中草药醇提液对霉菌的抑制效果。首先筛选抑菌效果较好的中草药醇提液，然后，对抑菌效果较好的中草药醇提液，进行不同比例的配比试验，找出能够同时抑制3种霉菌生长的最佳配比，从而防止棉花的霉变，以延长棉花的储藏时间，为今后棉织品的安全储藏奠定基础。

附图说明

[0014] 图1是曲霉菌(Aspergillussp.)的菌落形态及个体形态(10×40)。

[0015] 图2是镰刀霉菌(Fuasarium sp.)的菌落形态及个体形态(10×40)。

[0016] 图3是青霉菌(Penicillivmsp.)的菌落形态及个体形态(10×40)。

[0017] 图4是乙醇对照和复合配剂B1对曲霉菌的抑菌效果。

[0018] 图5是乙醇对照和复合配剂B1对镰刀霉菌的抑菌效果。

[0019] 图6是乙醇对照和复合配剂B1对青霉菌的抑菌效果。

具体实施方式

[0020] 为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

[0021] 本实施例使用的原材料及设备为国家棉麻粮食储备库火灾等热灾害的主要形成机制与演化规律(2017YFC0805901)资助项目。

[0022] 1、棉花霉变霉菌的分离纯化与鉴定

[0023] 挑取棉花霉变样品接种于PDA培养基(马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL)。将PDA培养基放在28℃恒温箱中，培养3-5天。挑取菌丝体接种于相应的培养基，进行分离纯化，反复纯化3-4代，直至获得纯培养。保存菌种并鉴定。结果表明引起棉花霉变的主要霉菌是曲霉菌(Aspergillussp.)、镰刀霉菌(Fuasarium sp.)和青霉菌
(Penicillivmsp.)。菌种保藏号分别为曲霉菌(CCTCC AF 2018003)，镰刀霉菌(CCTCC AF 
2018002)，青霉菌(CCTCC AF 2018004)。

[0024] 2、选择有代表性的霉菌进行抑菌试验

[0025] 根据平板上菌落的生长快慢和鉴定结果，选择有代表性的主要的霉菌：曲霉菌、镰刀霉菌和青霉菌。

[0026] 3、中草药的选择

[0027] 通过查找相关文献，选择那些对细菌或霉菌有抑制的常见中草药。本实验共选取出19种中草药，分别是丁香、小蓟、黄柏、黄芪、大黄、八角、丹参、干姜、黄连、荆芥、苦参、白鲜皮、石榴皮、徐长卿、金银花、春柴胡、板蓝根、土荆皮、肉豆蔻。

[0028] 4、中草药醇提液的制备

[0029] 将以上19种中草药粉碎成3-5㎜的颗粒，以利于脂溶性成分的提取。

[0030] 称取100g中草药颗粒置于锥形瓶内，加入500mL无水乙醇，120rpm摇床萃取24h，过滤，收集滤液；滤渣按照上述参数进行二次萃取；合并两次滤液，蒸馏除去80-90％的乙醇，在8000rpm下离心15min，收集上清液并补加无水乙醇至200mL，得到浓度为0.5g/mL的中草药醇提液，4℃保存备用。不同种类的中草药按照上述方法分别提取。

[0031] 5、孢子悬液的制备

[0032] 分别挑取保藏的曲霉菌、链刀霉菌和青霉菌进行斜面接种，置于28℃恒温培养箱中培养48h进行活化，待斜面长满孢子之后，加入5mL无菌水，冲洗孢子，将菌悬液倒入无菌的空试管内，制成108个孢子/mL。分别制成曲霉菌、链刀霉菌和青霉菌的孢子悬液，标记菌名，备用。

[0033] 6、选取抑菌效果较好的中草药醇提液

[0034] 牛津杯法：用移液枪吸取100μL的孢子悬液放置在PDA平板中央，用涂布棒涂抹均匀。将无菌的牛津杯放在培养基中央，并往其中加入200μL的中草药醇提液，每种中草药做3个平行实验。操作完成后，放置在28℃的培养箱中培养3-5天，直到牛津杯附近出现明显的抑菌圈。培养结束后，通过抑菌圈的大小来判断醇提液抑菌效果。

[0035] 7、复合配剂配比方案的选择

[0036] 将所得的抑菌效果较好的中草药醇提液与酮康唑进行下列配比。设定复合配剂总量为200μL，对丁香、黄柏、丹参和黄连这四种中草药和酮康唑(浓度为2.124mg/mL)采用配比为0:1:2:3:4的配比方案，详细配比方法见表1，通过抑菌圈的直径大小和牛津杯法来判定不同复合配剂的抑菌效果。

[0037] 表1：复合配剂的6种配比方案

[0038] 复合配剂编号 酮康唑(μL) 丁香(μL) 黄柏(μL) 丹参(μL) 黄连(μL)B1 0 60 40 20 80B2 80 40 0 60 20
B3 40 20 80 0 60
B4 20 80 60 40 0
B5 60 0 20 80 40
B6 40 40 40 40 40

[0039] 表2：6种复合配剂的抑菌圈直径

[0040] 复合配剂的抑菌圈直径mm 曲霉菌 镰刀霉菌 青霉菌B1 26 40 27
B2 0 13 0
B3 13 14 20
B4 0 13 17
B5 0 11 14
B6 17 22 23

[0041] 复合配剂B1-B6对3株霉菌的抑菌圈直径大小见表2。复合配剂B2、B4、B5对曲霉菌无抑菌效果。复合配剂B1、B3、B6对曲霉菌、镰刀霉菌、青霉菌都有抑菌效果，B1的配比方案为酮康唑：丁香：黄柏：丹参：黄连＝0：3：2：1：4；B6的配比方案为酮康唑：丁香：黄柏：丹参：黄连＝1：1：1：1：1；B3的配比方案为酮康唑：丁香：黄柏：丹参：黄连＝2：1：4：0：3。从复合配剂B1、B3、B6对曲霉菌、镰刀霉菌、青霉菌的抑菌圈直径的大小判断，最佳配比为B1，即酮康唑：丁香：黄柏：丹参：黄连的比例为0：3：2：1：4。这种复合配剂对引起棉花霉变的曲霉菌、镰刀霉菌和青霉菌三株霉菌的综合抑菌效果最佳。