包含柏木醇或其衍生物或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗自身免疫疾病的药物组合物

摘要

本发明涉及一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，其包含柏木醇或其药学上可接受的盐作为活性成分。具体来说，本发明的柏木醇或其衍生物抑制了IL‑17A的表达，特别是，柏木醇、乙酸柏木酯和柏木烯在牛皮癣动物模型中表现出延缓牛皮癣发作及对其进行治疗的作用。因此，这些化合物可以用于治疗由IL‑17介导的自身免疫性疾病。

权利要求

1.式2表示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途，其中所述自身免疫性疾病是牛皮癣：【式2】

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述自身免疫性疾病由白细胞介素‑17介导。

说明书

包含柏木醇或其衍生物或其药学上可接受的盐的用于预防或

治疗自身免疫疾病的药物组合物

背景技术

1.技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，其包含柏木醇或其衍生物或其药学上可接受的盐作为活性成分。

[0002] 2.技术背景

[0003] 免疫力是保护活体免受进入或注入活组织的所有外来物质的影响的自我保护系统之一。所有正常个体都不会对自身形成的抗原产生负面反应，而他们有能力识别和响应
非自身抗原并能够将其消除。然而，如果宿主未能区分自身抗原与外来抗原并由此诱导异
常免疫响应，则内源性免疫细胞攻击身体的细胞组分以引起各种疾病，其被称为自身免疫
性疾病。

[0004] 自身免疫性疾病是由各种原因引起的，包括遗传、压力、激素、重金属、食物、感染、以及农药等，本病的发病率全球约为5％至8％。自身免疫性疾病也可能由IL‑17细胞因子过
量引起。一旦抗原呈递细胞 (APC)识别体内的抗原，取决于细胞分泌的细胞因子的种类，各
种T细胞被激活。具体来说，当Th17细胞被激活时，细胞因子如白细胞介素‑17A(IL‑17A)、白
细胞介素‑17F(IL‑17F)、白细胞介素‑21(IL‑21) 或白细胞介素‑22(IL‑22)激活免疫系统。
在上述细胞因子中，当IL‑17A和IL‑17F过度表达时，它们形成与白细胞介素‑17受体A(IL‑
17RA)和白细胞介素‑17受体C(IL‑17RC)相结合的同源二聚体或异源二聚体，表达在皮肤或
粘膜细胞上引起炎症和细胞破坏。当分泌的IL‑17作用于血管内皮细胞时，会发生血栓症或
炎症。当分泌的IL‑17作用于上皮组织时，皮肤或粘膜上会发生各种炎症反应。另外，当分泌
的IL‑17 作用于巨噬细胞或树突细胞时，不仅会引起各种炎症，而且还会引起软骨组织损
伤。当分泌的IL‑17作用于成骨细胞时，会诱发骨质疏松症。因此，为了抑制各种自身免疫性
疾病，需要开发一种能够抑制分泌 IL‑17的Th17细胞的活化的化合物或一种能够阻断IL‑
17的表达的化合物，以治疗或预防由IL‑17介导的自身免疫性疾病。

[0005] IL‑17在各种器官或组织中的过度分泌会导致各种疾病。例如，消化道或呼吸道粘膜中IL‑17的过度分泌会引起克罗恩氏病、炎症性肠病、1型糖尿病和哮喘。骨关节系统中
IL‑17的过度分泌会引起骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性多肌痛、强直性脊柱炎和牛
皮癣性关节炎。神经系统中IL‑17的过度分泌会引起多发性硬化、IL‑17诱发的痴呆、周围神
经病和自闭症。血管系统中IL‑17的过度分泌会引起葡萄膜炎、干眼病和同种异体移植排
斥。此外，当特定器官中IL‑17的过度分泌诱发慢性炎症时，它可以引发诸如胃癌、胰腺癌、
乳腺肿瘤、卵巢癌、结肠直肠癌和肺癌等癌症的发展。因此，这种疾病可以通过抑制 IL‑17
分泌来预防或治疗。

[0006] 目前，抗炎和免疫抑制药物被用于治疗自身免疫性疾病。但是，一些患者对这些药物表现出抗药性，这使得治疗变得困难。

[0007] 牛皮癣是自身免疫性疾病之一，是一种重复恶化和改善的非传染性慢性皮肤病。当牛皮癣首次发病时，会在皮肤上观察到小米状的红色皮疹，其然后会随着与白色皮肤角
质形成细胞分层而生长。牛皮癣可以在所有年龄段发病，但在二十多岁时最常见，其次是青
少年和三十多岁。牛皮癣的全球发病率约为3％并且正在逐步上升。近年来，已经知晓牛皮
癣的发病机制是通过IL‑23/Th17/IL‑17通路。由于抑制IL‑17的药物并不多，临床上使用甲
氨喋呤、依曲替酯等类固醇药物作为牛皮癣治疗剂，但这些类固醇药物有肝损伤、胎儿畸形
等副作用。

[0008] 因此，正在进行研究以开发一种无副作用的自身免疫性疾病治疗剂。具体来说，韩国专利公开 No.10‑2014‑0096770描述了一种用于治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的组
合物，其包含作为活性成分的 Martensia bibarii提取物。以及韩国专利No.10‑0804517描
述了一种包含苦参提取物的自身免疫性疾病治疗剂。

[0009] 在开发无体内副作用的自身免疫性疾病治疗剂的研究过程中，本发明人发现，柏木醇、乙酸柏木酯、α‑柏木烯、甲基柏木酮、甲基柏木醚和柏木烯环氧化物抑制IL‑17的表
达。具体地，本发明人证实，在牛皮癣动物模型中，柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯有效地延
缓了牛皮癣的发展并对牛皮癣进行治疗，从而完成了本发明，提供了一种用于预防和治疗
自身免疫性疾病的组合物。

发明内容

[0010] 本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，一种用于改善自身免疫性疾病的健康功能性食品或一种用于缓解皮肤刺激的化妆品组合物，
其包含一种或多种选自式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分：

[0011]

[0012] 为了实现上述目的，本发明提供了一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，其包含一种或多种选自式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分：

[0013]

[0014]

[0015] 本发明还提供了一种用于改善自身免疫性疾病的健康功能性食品，其包含一种或多种选自式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。

[0016] 此外，本发明提供了一种用于缓解皮肤刺激的化妆品组合物，其包含一种或多种选自式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。

[0017] 有益效果

[0018] 本发明的柏木醇或其衍生物可以抑制IL‑17A的表达。具体来说，已证实，在牛皮癣动物模型中，柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯有效地延缓了牛皮癣的发展并且对该疾病进
行治疗，表明所述化合物可有效地用于治疗由IL‑17介导的自身免疫性疾病。

附图说明

[0019] 通过参照附图，可以最好地理解本发明的优选实施例的应用，在附图中：

[0020] 图1是说明了柏木醇、乙酸柏木酯、α‑柏木烯、甲基柏木酮、甲基柏木醚和柏木烯环氧化物对IL‑17A 表达的抑制作用的图表(Con：未使用这些化合物中的任何一个进行处理
的对照组)。

[0021] 图2A是说明了蒸馏水(IMQ)、柏木醇(C)、乙酸柏木酯(CA)或α‑柏木烯(CE)对在小鼠的耳朵和背部由咪喹莫特诱发的牛皮癣的处理作用的一组照片，于施用咪喹莫特之前
(D0)或施用咪喹莫特一天之后(D1)观察，同时将所述化合物经口服给予小鼠。

[0022] 图2B是说明了蒸馏水(IMQ)、柏木醇(C)、乙酸柏木酯(CA)或α‑柏木烯(CE)对在小鼠的耳朵和背部由咪喹莫特诱发的牛皮癣的处理作用的一组照片，于施用咪喹莫特两天之
后(D2)或施用咪喹莫特三天之后(D3)观察，同时将所述化合物经口服给予小鼠。

[0023] 图2C是说明了蒸馏水(IMQ)、柏木醇(C)、乙酸柏木酯(CA)或α‑柏木烯(CE)对在小鼠的耳朵和背部由咪喹莫特诱发的牛皮癣的处理作用的一组照片，于施用咪喹莫特四天之
后(D4)或施用咪喹莫特五天之后(D5)观察，同时将所述化合物经口服给予小鼠。

[0024] 图2D是说明了蒸馏水(IMQ)、柏木醇(C)、乙酸柏木酯(CA)或α‑柏木烯(CE)对在小鼠的耳朵和背部由咪喹莫特诱发的牛皮癣的处理作用的一组照片，于施用咪喹莫特六天之
后(D6)或施用咪喹莫特七天之后(D7)观察，同时将所述化合物经口服给予小鼠。

[0025] 图3是说明了牛皮癣诱发小鼠以及未经处理的对照组(CONT)的重量变化的图表，其中所述牛皮癣诱发小鼠在施用咪喹莫特之后被经口服给予蒸馏水(IMQ)、柏木醇(IMQ+
C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)。

[0026] 图4是说明了在施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ)、柏木醇(IMQ+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的耳朵厚度的降低作用的比较的
图表。

[0027] 图5是说明了在施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ)、柏木醇(IMQ+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的角化症的降低作用的比较的图
表。

[0028] 图6是说明了在施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ)、柏木醇(IMQ+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的皮肤红肿的降低作用的比较的
图表。

[0029] 图7是说明了在施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ)、柏木醇(IMQ+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)的牛皮癣皮损面积严重度指数(PASI)的变化的图表，
其中所述牛皮癣皮损面积严重度指数反映了牛皮癣诱发小鼠的耳朵厚度、角化症和皮肤红
肿。

[0030] 图8是说明了在施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ)、柏木醇(IMQ+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的皮肤疼痛的降低作用的比较的
图表。

[0031] 图9是说明了在施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ)、柏木醇(IMQ+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的皮肤出血斑的降低作用的比较
的图表。

[0032] 图10是说明了在施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ)、柏木醇(IMQ+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的皮肤皱纹的降低作用的比较
的图表。

[0033] 图11是说明了对牛皮癣诱发小鼠以及未经处理的对照组(对照)的脾中IL‑17A表达的抑制作用的图表，其中所述牛皮癣诱发小鼠在施用咪喹莫特之后被经口服给予蒸馏水
(IMQ)、柏木醇(IMQ+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA)或α‑柏木烯(IMQ+CE)。

[0034] 图12A是说明了牛皮癣诱发小鼠以及未经处理的对照组(对照)的皮肤厚度的一组照片，其中所述牛皮癣诱发小鼠在施用咪喹莫特之后被经口服给予蒸馏水(IMQ)、柏木醇
(IMQ+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)。

[0035] 图12B是说明了牛皮癣诱发小鼠以及未经处理的对照组(对照)的皮肤厚度的图表，其中所述牛皮癣诱发小鼠在施用咪喹莫特之后被经口服给予蒸馏水(IMQ)、柏木醇(IMQ
+C)、乙酸柏木酯(IMQ+CA) 或α‑柏木烯(IMQ+CE)。

[0036] 图13A是说明了蒸馏水(IMQ)、柏木醇(C)、乙酸柏木酯(CA)或α‑柏木烯(CE)对在小鼠的耳朵和背部由咪喹莫特诱发的牛皮癣的处理作用的一组照片，于停止施用咪喹莫特一
天之后(D8)或停止施用咪喹莫特两天之后(D9)观察，同时将所述化合物经口服给予小鼠。

[0037] 图13B是说明了蒸馏水(IMQ)、柏木醇(C)、乙酸柏木酯(CA)或α‑柏木烯(CE)对在小鼠的耳朵和背部由咪喹莫特诱发的牛皮癣的处理作用的一组照片，于停止施用咪喹莫特三
天之后(D10)或停止施用咪喹莫特四天之后(D11)观察，同时将所述化合物经口服给予小
鼠。

[0038] 图13C是说明了蒸馏水(IMQ)、柏木醇(C)、乙酸柏木酯(CA)或α‑柏木烯(CE)对在小鼠的耳朵和背部由咪喹莫特诱发的牛皮癣的处理作用的一组照片，于停止施用咪喹莫特五
天之后(D12)或停止施用咪喹莫特六天之后(D13)观察，同时将所述化合物经口服给予小
鼠。

[0039] 图13D是说明了蒸馏水(IMQ)、柏木醇(C)、乙酸柏木酯(CA)或α‑柏木烯(CE)对在小鼠的耳朵和背部由咪喹莫特诱发的牛皮癣的处理作用的一组照片，于停止施用咪喹莫特七
天之后(D14)或停止施用咪喹莫特八天之后(D15)观察，同时将所述化合物经口服给予小
鼠。

[0040] 图14是说明了在停止施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ(1‑7))、柏木醇(IMQ(1‑7)+C)、乙酸柏木酯(IMQ(1‑7)+CA)或α‑柏木烯(IMQ(1‑7)+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的耳
朵厚度的恢复作用的比较的图表。

[0041] 图15是说明了在停止施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ(1‑7))、柏木醇(IMQ(1‑7)+C)、乙酸柏木酯(IMQ(1‑7)+CA)或α‑柏木烯(IMQ(1‑7)+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的角
化症的恢复作用的比较的图表。

[0042] 图16是说明了在停止施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ(1‑7))、柏木醇(IMQ(1‑7)+C)、乙酸柏木酯(IMQ(1‑7)+CA)或α‑柏木烯(IMQ(1‑7)+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的皮
肤红肿的恢复作用的比较的图表。

[0043] 图17是说明了在停止施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ(1‑7))、柏木醇(IMQ(1‑7)+C)、乙酸柏木酯(IMQ(1‑7)+CA)或α‑柏木烯(IMQ(1‑7)+CE)的牛皮癣皮损面积严重度
指数(PASI)的变化的图表，其中所述牛皮癣皮损面积严重度指数反映了牛皮癣诱发小鼠的
耳朵厚度、角化症和皮肤红肿。

[0044] 图18是说明了在停止施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ(1‑7))、柏木醇(IMQ(1‑7)+C)、乙酸柏木酯(IMQ(1‑7)+CA)或α‑柏木烯(IMQ(1‑7)+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的皮
肤出血斑的恢复作用的比较的图表。

[0045] 图19是说明了在停止施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ(1‑7))、柏木醇(IMQ(1‑7)+C)、乙酸柏木酯(IMQ(1‑7)+CA)或α‑柏木烯(IMQ(1‑7)+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的皮
肤皱纹的恢复作用的比较的图表。

[0046] 图20是说明了在停止施用咪喹莫特之后根据口服蒸馏水(IMQ(1‑7))、柏木醇(IMQ(1‑7)+C)、乙酸柏木酯(IMQ(1‑7)+CA)或α‑柏木烯(IMQ(1‑7)+CE)的对牛皮癣诱发小鼠的毛
发再生的促进作用的比较的图表。

具体实施方式

[0047] 在下文中，将详细描述本发明。

[0048] 本发明提供了一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，其包含一种或多种选自式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。

[0049] 【表1】

[0050]

[0051]

[0052] 本发明的由式1‑6表示的化合物可以以药学上可接受的盐的形式使用，其中所述盐优选为由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐。酸加成盐可以从无机酸例如盐酸、硝
酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸和亚磷酸，或无毒有机酸例如脂肪族单/二羧酸酯、
苯基取代的链烷酸酯、羟基链烷酸酯、链烷二酸酯、芳香酸和脂肪族/芳香族磺酸。药学上无
毒的盐例如硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢
盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯盐、溴盐、碘盐、氟盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐
(decanoate)、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酯(caprate)、庚酸盐、丙酸盐、草酸
盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、椰子油酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔‑1,4‑二酸盐、己
烷‑1,6‑二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲
氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、二甲苯
磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、羟基丁酸盐、乙醇酸盐、苹果酸
盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘‑1‑磺酸盐、萘‑2‑磺酸盐和扁桃酸盐。

[0053] 本发明中的酸加成盐可以通过本领域已知的常规方法制备。例如，将式1‑6的化合物溶解于有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷或乙腈中，向其中加入有机酸或无机酸
以引起沉淀。然后，过滤并干燥沉淀物以得到盐。或者将溶剂和过量的酸减压蒸馏，并干燥
以得到盐。或者将沉淀物在有机溶剂中结晶以得到盐。

[0054] 药学上可接受的金属盐可以通过使用碱来制备。碱金属或碱土金属盐通过以下工艺获得：将化合物溶解在过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中；过滤不溶性
复合盐；蒸发剩余的溶液并干燥。此时，金属盐优选以钠、钾或钙盐的药学上合适的形式制
备。并且相应的银盐通过碱金属或碱土金属盐与适当的银盐(例如硝酸银)反应来制备。

[0055] 由上述式1‑6表示的化合物具有非对称结构，因此它们以不同的对映异构体形式存在。因此，所有由式1‑6表示的化合物可以包括所有光学异构体、(R)或(S)型立体异构体
或其混合物。由式1表示的化合物可以包含其外消旋体、一个或多个对映异构体、一个或多
个非对映异构体或其混合物。根据本发明的光学异构体可以通过本领域技术人员熟知的分
离方法或制备方法获得。

[0056] 本文中的自身免疫性疾病可以由白细胞介素‑17介导。具体来说，上述自身免疫性疾病可选自以下病症：牛皮癣、湿疹、硬皮病、白癜风、克罗恩氏病、炎症性肠病、1型糖尿病、
哮喘、骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性多肌痛、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、多发
性硬化、IL‑17诱发的痴呆、周围神经病、自闭症、葡萄膜炎、干眼病、同种异体移植排斥、胃
癌、胰腺癌、乳腺肿瘤、卵巢癌、结肠直肠癌和肺癌。

[0057] 在本发明的一个优选实施例中，本发明人证实，通过使用柏木醇、乙酸柏木酯、α‑柏木烯、甲基柏木酮、甲基柏木醚和柏木烯环氧化物，柏木醇或其衍生物抑制了IL‑17A的表
达(参见图1)。

[0058] 本发明人观察了根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的耳朵厚度(参见图4)、角化症(参见图5)、皮肤红肿(参见图6)、皮肤疼痛(参见图8)，皮肤出血
斑(参见图9)和皮肤皱纹(参见图10)。结果，本发明人证实，这些化合物有效地降低了耳朵
厚度、角化症、皮肤红肿、皮肤疼痛、皮肤出血斑和皮肤皱纹并有效地抑制了脾中IL‑17A的
表达(参见图11)。还证实，表皮层的厚度小于对照组的厚度(参见图12)。

[0059] 此外，本发明人证实，将柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯经口服给予牛皮癣诱发小鼠不仅有效地恢复了耳朵厚度(参见图14)、角化症(参见图15)、皮肤红肿(参见图16)、皮肤
出血斑(参见图18)和皮肤皱纹(参见图19)，而且有效地促进了毛发再生(参见图20)。

[0060] 因此，由于本发明的由式1‑6表示的化合物抑制了IL‑17A的表达，因此其可以有效地用于治疗自身免疫性疾病，并具有延缓牛皮癣发作及对其进行治疗的作用，所述牛皮癣
即为由IL‑17A介导的疾病。

[0061] 所述药物组合物可以包括由式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐，其占组合物总重量的10‑95重量％。本发明的药物组合物可另外含有一种或多种具有与所述化合
物相同或相似功能的活性成分。

[0062] 本发明的药物组合物可以包括任何通常使用的载体、稀释剂、赋形剂、或该等物质中至少两种的组合。药学上可接受的载体可以是能够不受限制地将本发明的组合物递送至
活体内的任何载体，例如盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶
液、甘油、乙醇、脂质体和包含一种或多种该等组分的混合物。必要时，可以另外添加一般添
加剂，如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。

[0063] 本发明的组合物可以通过与通常使用的稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂)混合来制备。

[0064] 本发明的组合物可以制备用于口服给药或肠胃外给药。用于口服给药的固体制剂为片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂和锭剂。这些固体制剂通过与一种或多种合适的赋形剂
(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等)混合来制备。除了简单的赋形剂外，可以加入润滑
剂，例如硬脂酸镁、滑石粉等。用于口服给药的液体制剂是混悬剂、溶液剂、乳剂和糖浆剂，
并且上述制剂可以含有各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。

[0065] 用于肠胃外给药的制剂可以包括注射剂，例如无菌水溶液剂、水不溶性赋形剂、混悬剂和乳剂。

[0066] 水不溶性赋形剂和混悬剂可以含有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯(如油酸乙酯) 等。

[0067] 根据所需的方法，本发明的组合物可以口服给药或胃肠外给药。胃肠外给药可以选自以下方式：外部给药、腹膜内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内注射、肌内注射或胸
内注射。

[0068] 本发明的组合物以药学有效剂量给药。有效剂量可以根据疾病的类型和严重度、药物活性、药物敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和其他联合使用的药物来确
定。

[0069] 本发明的组合物可以单独给药或与其他治疗剂一起组合给药。当组合给药时，给药可以顺序地或同时地进行。

[0070] 为达到所需效果，本发明药物组合物中所含有效成分的有效剂量可以是0.001‑10,000mg/kg，特别是 0.1‑5g/kg。给药频率可以是一天一次或一天几次。

[0071] 本发明还提供了一种用于改善自身免疫性疾病的健康功能性食品，其包含一种或多种选自式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。

[0072] 根据本发明的一个实例，上述化合物可以是由式1表示的柏木醇、由式2表示的乙酸柏木酯、由式3 表示的α‑柏木烯、由式4表示的甲基柏木酮、由式5表示的甲基柏木醚、或
由式6表示的柏木烯环氧化物。

[0073] 所述化合物可具有上文所述的特征。本文中的自身免疫性疾病可以由白细胞介素‑17介导。具体来说，上述自身免疫性疾病可选自以下病症：牛皮癣、湿疹、硬皮病、白癜
风、克罗恩氏病、炎症性肠病、1型糖尿病、哮喘、骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性多肌
痛、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、多发性硬化、IL‑17诱发的痴呆、周围神经病、自闭症、
葡萄膜炎、干眼病、同种异体移植排斥、胃癌、胰腺癌、乳腺肿瘤、卵巢癌、结肠直肠癌和肺
癌。

[0074] 在本发明的一个优选实施例中，本发明人证实，在牛皮癣诱发动物模型中，柏木醇、乙酸柏木酯、α‑ 柏木烯、甲基柏木酮、甲基柏木醚和柏木烯环氧化物可以抑制IL‑17A的
表达(参见图1)，具体来说，柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯可以延缓牛皮癣的发展(参见图
2a‑12)并可以进一步对疾病进行治疗(参见图13a‑19)。

[0075] 因此，由式1‑6表示的化合物可以有效地用于改善由IL‑17A介导的自身免疫性疾病。

[0076] 本发明的由式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐可以用作食品添加剂。在这种情况下，本发明的由式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐可以按照原样加入或
按照常规方法与其他食物组分混合加入。活性成分的混合比例可以根据使用目的进行调
整。通常，为了生产健康功能性食品，本发明的由式 1‑6表示的化合物或其药学上可接受的
盐优选地按0.01‑90重量份(相对于总食物重量)加入。

[0077] 健康功能性食品的形式和种类不受限制。该健康功能性食品可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、液体剂和丸剂。

[0078] 和其他健康食品一样，本发明的健康功能性食品可以另外包括各种调味剂或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物可以是单糖(例如葡萄糖和果糖)、二糖(例如麦芽糖和
蔗糖)、多糖(例如糊精和环糊精)以及葡萄糖醇(例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇)中的一
种。此外，天然甜味剂(例如索马甜和甜叶菊提取物)以及合成甜味剂(例如糖精和阿斯巴
甜)可作为甜味剂加入。

[0079] 除了上述成分之外，本发明的健康功能性食品还可以包含各种营养素、维生素、矿物质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增粘剂、pH调节剂、稳
定剂、防腐剂、甘油、醇等。所有提到的成分可以单独加入或一起加入。实际上，这些成分的
混合比例无关紧要，但通常每种成分可以按0.01‑0.1重量份(每100重量份本发明的组合
物)加入。

[0080] 本发明还提供了一种用于缓解皮肤刺激的化妆品组合物，其包含一种或多种选自式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。

[0081] 根据本发明的一个实例，上述化合物可以是由式1表示的柏木醇、由式2表示的乙酸柏木酯、由式3 表示的α‑柏木烯、由式4表示的甲基柏木酮、由式5表示的甲基柏木醚、或
由式6表示的柏木烯环氧化物。

[0082] 所述化合物可具有上文所述的特征。本文中的自身免疫性疾病可以由白细胞介素‑17介导。具体来说，上述自身免疫性疾病可选自以下病症：牛皮癣、湿疹、硬皮病、白癜
风、克罗恩氏病、炎症性肠病、 1型糖尿病、哮喘、骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性多肌
痛、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、多发性硬化、IL‑17诱发的痴呆、周围神经病、自闭症、
葡萄膜炎、干眼病、同种异体移植排斥、胃癌、胰腺癌、乳腺肿瘤、卵巢癌、结肠直肠癌和肺
癌。

[0083] 在本发明的一个优选实施例中，本发明人证实，在牛皮癣诱发动物模型中，柏木醇、乙酸柏木酯、α‑ 柏木烯、甲基柏木酮、甲基柏木醚和柏木烯环氧化物可以抑制IL‑17A的
表达(参见图1)，具体来说，柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯可以延缓牛皮癣的发展(参见图
2a‑12)并可以进一步对疾病进行治疗(参见图13a‑19)。

[0084] 因此，由式1‑6表示的化合物可以有效地用于缓解由IL‑17A介导的自身免疫性疾病。

[0085] 本发明的由式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐可以按0.1‑50重量％，特别是1‑10重量％(相对于化妆品组合物的总重量)包括在化妆品组合物中。然而，上述比例
可以根据化妆品的形式、具体应用部位(面部或手部)或应用量而改变。

[0086] 除了本发明的由式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐以外，本发明的化妆品组合物还可以包括通常用于化妆品中的任何常规成分，例如添加剂和载体，如稳定剂、增
溶剂、维生素、颜料和调味剂，但并不总是限于此。

[0087] 本发明的化妆品组合物可以以本领域可接受的任何形式配制，例如膏剂、霜剂、凝胶剂、粉剂、喷雾剂、溶液剂、乳剂、混悬剂(无水和含水)、含表面活性剂的清洁剂、无水产品
(油和乙二醇)、面膜、剥撕式面膜、散粉剂、洗剂、皂剂、油剂、散粉基质、乳液基质和蜡基质
等。具体来说，本发明的化妆品组合物可以以软洗剂(皮肤)、营养洗剂(奶类洗剂)、营养霜、
按摩霜、精油、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、剥撕式面膜、喷雾剂或粉剂的形式制备。

[0088] 在将化妆品组合物配制成膏剂、霜剂和凝胶剂的情况下，适当的载体可以选自以下物质：动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、硅
石、滑石粉和氧化锌。

[0089] 在将化妆品组合物配制成粉剂或喷雾剂的情况下，适当的载体可以选自以下物质：乳糖、滑石粉、硅石、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，并且具体来说，如果将本发明的组
合物配制成喷雾剂，可以另外包括抛射剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。

[0090] 在将化妆品组合物配制成液体剂或乳剂的情况下，适当的载体可以选自以下物质：溶剂、增溶剂和乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄
酯、丙二醇、1,3‑丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯。

[0091] 在将化妆品组合物配制成混悬剂的情况下，适当的载体可以选自以下物质：液体稀释剂(例如水、乙醇或丙二醇)、助悬剂(例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和
聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯)、微晶纤维素、甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶。

[0092] 在将化妆品组合物配制成含表面活性剂的清洁剂的情况下，适当的载体可以选自以下物质：脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸酯、咪唑啉衍生物、
甲基牛磺酸酯、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰氨基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油
酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物和乙氧基化甘油脂肪酸酯。

[0093] 此外，本发明提供了一种生发组合物，其包含一种或多种选自式1‑6表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。

[0094] 根据本发明的一个实例，上述化合物可以是由式1表示的柏木醇、由式2表示的乙酸柏木酯、由式3 表示的α‑柏木烯、由式4表示的甲基柏木酮、由式5表示的甲基柏木醚、或
由式6表示的柏木烯环氧化物。

[0095] 在本发明的一个优选实施例中，本发明人证实，柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯显示出促进毛发再生的作用(参见图13a‑13d和图20)。

[0096] 因此，由式1‑6表示的化合物可以有效地用作生发组合物。

[0097] 本发明的生发组合物可含有本发明的由式1‑6表示的化合物，其浓度为生发组合物总重量的 0.001‑99.99重量％，优选浓度为0.1‑50重量％％。然而，上述浓度比例可以根
据脱发的严重程度或使用目的而改变，只要该浓度不会对人体造成毒性即可。

[0098] 除了由式1‑6表示的化合物之外，本发明的生发用组合物还可以包括通常用作药物或化妆品原料的任何常规成分，例如添加剂，诸如纯化水、矿泉水、乙醇、甘油、角鲨烷、1,
3‑丙二醇、1,3‑丁二醇、蓖麻油、椿花油、液体凡士林、表面活性剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、
抗氧化剂、芳香剂或载体。

[0099] 除了上述成分之外，本发明的组合物还可以含有能够向毛囊提供营养的任何成分或毛发生长促进辅助组分，例如维生素、氨基酸、植物油、动物油或氯化钠。此时，本文中的
维生素可以例如维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B5(烟酸)、维生素C、维生素E、泛酸
钠、泛酸钾或生物素H(维生素H)。本文中的氨基酸可以是多巴。本文中的植物油和动物油可
以例如大麻籽油、蛋黄油、橄榄油、山茶油、菜籽油、芝麻油或胚芽油。这种辅助组分可以以
组合物总重量的0.0001‑10重量％，优选0.01‑1重量％的浓度加入到本发明的组合物中。

[0100] 可以将本发明的组合物直接施用或分散在头发或头皮上。因此，该组合物可以以生发剂、洗发液、发膏、喷发剂、发用摩丝、发胶、护发素、洗发水、染发剂、发膜、焗油膏、眉毛
生长剂、睫毛生长剂或睫毛营养剂、宠物洗发水或宠物染发剂的形式制备。

[0101] 本发明的组合物可以配制成本领域可常规制备的任何形式，例如霜剂、洗剂、滋补剂、喷雾剂、气雾剂、油剂、溶液剂、混悬剂、凝胶剂、软膏剂、乳剂或膏剂。

[0102] 在将本发明的组合物配制成膏剂、霜剂和凝胶剂的情况下，适当的载体可以选自以下物质：动物油、植物油、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、硅石、
滑石粉和氧化锌。

[0103] 在将本发明的组合物配制成喷雾剂的情况下，适当的载体可以选自以下物质：乳糖、滑石粉、硅石、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，并且具体来说，如果将本发明的组合物
配制成喷雾剂，可以另外包括抛射剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。

[0104] 在将本发明的组合物配制成液体剂的情况下，适当的载体可以选自以下物质：溶剂、增溶剂和乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二
醇、1,3‑丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯。

[0105] 在将本发明的组合物配制成混悬剂的情况下，适当的载体可以选自以下物质：液体稀释剂(例如水、乙醇或丙二醇)、助悬剂(例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯
和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯)、微晶纤维素、甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶。

[0106] 如以下实例所示，本发明的实际和当前优选实施例是说明性的。

[0107] 然而，应该认识到，本领域技术人员在考虑到本发明的情况下可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。

[0108] 实例1：柏木醇及其衍生物对IL‑17A表达的抑制

[0109] <1‑1>对柏木醇及其衍生物引起的IL‑17A下调的研究

[0110] 为了研究柏木醇及其衍生物对IL‑17A表达的抑制作用，用柏木醇(Sigma‑Aldrich，美国，目录号 22135)、乙酸柏木酯(Sigma‑Aldrich，美国，目录号45885)、α‑柏木
烯(Sigma‑Aldrich，美国，目录号 22133)、甲基柏木酮(Sigma‑Aldrich，美国，目录号
W522805)、甲基柏木醚(Sigma‑Aldrich，美国，目录号W525405)和柏木烯环氧化物(Sigma‑
Aldrich，美国，目录号S528188)对IL‑17荧光素酶(LUCPorter) 稳定报告细胞系(IMGENEX，
美国，目录号IML‑301)，接着进行IL‑17A抑制测定。所述IL‑17荧光素酶 ‑(LUCPorter)稳定
报告细胞系是分泌IL‑17的细胞系，其通过将LightSwitch启动子载体HEK293(人胚肾细胞
系)插入并将海肾萤光素酶插入人IL‑17A靶基因作为报告基因来制备。

[0111] 具体来说，将IL‑17萤光素酶‑(LUCPorter)稳定报告细胞系于含有4.5g/l葡萄糖、4mM L‑谷氨酰胺、 1mM丙酮酸钠、10％FBS、100μg/ml链霉素、100单位/ml青霉素、3μg/ml嘌
4
呤霉素的DMEM(GIBCO，美国)中培养。将制备的细胞以5×10 个细胞/孔的密度分布在96孔
板中，随后在37℃的5％CO2培养箱中培养16小时。使用6种本发明的化合物以10、100或1,
000μg/ml的浓度处理培养的细胞，随后在37℃的5％ CO2培养箱中继续培养6小时。然后，将
包括在LightSwitch测定试剂盒(SwitchGear Genomics，美国)中的LightSwitch萤光素酶
测定溶液(目录号LS010，Switchgear Genomics，美国)加载到平板上(50μl/孔)，随后在暗
室中反应30分钟。然后，使用多模式读板仪LB‑942(Berthold，美国)和ICE程序测量荧光。将
三次重复实验得到的结果作为平均值±标准偏差，将其作为图表来表示。

[0112] 【表2】

[0113]

[0114]

[0115] 结果，如图1和表2所示，对照组中IL‑17A的表达为2,582单位。当使用这6种化合物以10、100或 1000μg/ml的浓度处理实验组时，使用柏木醇处理的组中IL‑17A的表达为1,
718±174单位(对照为67％)、 1,460±124单位(对照为57％)和715±45单位(28％控制)。
使用α‑柏木烯处理的组中IL‑17A的表达为 2,042±114单位(对照为79％)、1,757±310单
位(对照为68％)和1,688±64单位(对照中为65％)。使用乙酸柏木酯处理的组中IL‑17A的
表达为1,994±304单位(对照为77％)、1,648±138单位(对照为64％) 和257±6单位(对照
为10％)。使用甲基柏木酮处理的组中IL‑17A的表达为2,248±194单位(对照为87％)、 1,
930±111单位(对照为75％)和866±106单位(对照为34％)。使用甲基柏木醚处理的组中
IL‑17A的表达为2,479±136单位(对照为96％)、2,379±206单位(对照为92％)和1,921±
239单位(对照为74％)。使用柏木烯环氧化物处理的组中IL‑17A的表达为2,591±458单位
(对照为100％)、2,267±806单位(对照为88％)和1,382±87单位(对照为54％)。具体而言，
柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯剂量依赖性地抑制 IL‑17A的表达。

[0116] 基于以上结果，选择柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯作为待用于以下实验的化合物。

[0117] <1‑2>对柏木醇及其衍生物相对IL‑17A表达的IC50值的研究

[0118] 为了研究柏木醇、乙酸柏木酯、α‑柏木烯、甲基柏木酮、甲基柏木醚和柏木烯环氧化物的IC50值，通过将实例<1‑1>中获得的值用于以下数学公式1中来计算每种化合物的平
均IL‑17A表达抑制率。

[0119] 通过使用计算值获得每种化合物抑制50％IL‑17A表达的IC50。每种化合物的平均IL‑17A表达抑制率示于上表2中。

[0120] 【数学公式1】

[0121] 抑制率(％)＝100×(对照的测量值‑实验组的测量值)/对照的测量值

[0122] 【表3】

[0123]

[0124]

[0125] 结果，如表3所示，乙酸柏木酯显示出最强的IL‑17A表达抑制活性，随后依次为柏木醇>甲基柏木酮> 柏木烯环氧化物>甲基柏木醚>α‑柏木烯(表3)。

[0126] 实例2：柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯对牛皮癣发展的延缓作用

[0127] <2‑1>牛皮癣诱发小鼠的准备

[0128] 为了研究柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯对牛皮癣发展的延缓作用，准备总共5组小鼠(8只小鼠/ 组)。首先，使用理发器(Kimlaube毛发笔325,327，Rikei，韩国)去除免疫系
统被削弱的8周龄雄性Balb/c 小鼠的整个背部的毛发。在剃过的小鼠背部中间，在2cm×
1.5cm的区域内施用2μg咪喹莫特(3M Health Care Limited，英格兰)，并且在小鼠的右耳
施用1,125mg咪喹莫特，每天一次以诱发牛皮癣。

[0129] 将上述准备的小鼠分为蒸馏水处理组(IMQ)、柏木醇处理组(C)、乙酸柏木酯处理组(CA)和α‑ 柏木烯处理组(CE)。此时，小鼠以200μl/小鼠的浓度口服蒸馏水，并以200μl/
小鼠(100mg/kg)的浓度口服柏木醇或其衍生物。将开始蒸馏水或化合物给药的当天记录为
第0天，并且每天进行一次给药，持续一周，在此期间每天进行照相记录(图2A‑2D)。同时，不
施用咪喹莫特，而是在对照组(CONT)的背部施用40mg凡士林，并且在对照组的右耳施用
22.5mg凡士林。而且，对照组口服蒸馏水(200μl/小鼠)。

[0130] <2‑2>根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的重量变化

[0131] 为了比较实例<2‑1>的根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的重量变化，每天在同一时间测量每只小鼠的重量，持续一周。

[0132] 结果，如图3所示，对照小鼠(CONT)的重量逐渐增加并在7天后增加了1.13g。然而，在用咪喹莫特(IMQ)处理的组中，重量从第0天起降低了2天，但相反地，重量在第3天至第5
天增加并且在第5 天后再次降低。在单独使用IMQ处理的组中，重量在7天内降低了0.48g，
而在施用IMQ期间使用柏木醇处理的组的重量在7天内增加了0.025g(图3)。

[0133] <2‑3>对根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的耳朵厚度降低作用的研究

[0134] 用肉眼观察实例<2‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠。然后，以1‑4的范围计算牛皮癣皮损面积严重度指数(PASI)，以证实化合物对耳
朵厚度的降低作用。

[0135] 结果，如图2A‑2D和图4所示，单独使用IMQ处理的组的耳朵厚度增加最多。准确地说，第1天的平均分为0.83，其连续增加到第7天的3.5。在施用IMQ之后使用柏木醇处理的组
中，平均耳朵厚度分在第7 天为2.6。在施用IMQ之后使用乙酸柏木酯处理的组中，平均耳朵
厚度分在第7天为2.3。在施用IMQ之后使用α‑柏木烯处理的组中，平均耳朵厚度分在第7天
为2.6。在使用本发明的化合物处理的组中观察到了耳朵厚度降低作用，其中乙酸柏木酯显
示出最强的降低作用，随后依次为α‑柏木烯和柏木醇(图2A‑2D和图 4)。

[0136] <2‑4>对根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的角化症的降低作用的研究

[0137] 用肉眼观察实例<2‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠。然后，计算牛皮癣皮损面积严重度指数(PASI)，以证实化合物对角化症的降低作
用。角化症是牛皮癣的一种症状。施用IMQ可以诱发角化症。

[0138] 结果，如图2A‑2D和图5所示，单独使用IMQ处理的组中强烈地诱发了角化症，并且平均分在第7天为3.8。在施用IMQ之后使用柏木醇处理的组的平均分在第7天为3.00，而在
施用IMQ之后使用乙酸柏木酯处理的组的平均分在第7天为3.08。在施用IMQ之后使用α‑柏
木烯处理的组的平均分在第7天为2.66。因此，在使用本发明的化合物处理的组中观察到了
角化症降低作用，其中α‑柏木烯显示出最强的降低作用，随后依次为乙酸柏木酯和柏木醇
(图2A‑2D和图5)。

[0139] <2‑5>对根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的皮肤红肿降低作用的研究

[0140] 用肉眼观察实例<2‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠。然后，计算牛皮癣皮损面积严重度指数(PASI)，以证实化合物对皮肤红肿的降低
作用。皮肤红肿是牛皮癣的一种症状。施用IMQ可以诱发皮肤红肿。

[0141] 结果，如图2A‑2D和图6所示，单独使用IMQ处理的组中强烈地诱发了皮肤红肿，并且平均分在第7 天为4.00。在施用IMQ之后使用柏木醇处理的组的平均分在第7天为3.33，
而在施用IMQ之后使用乙酸柏木酯处理的组的平均分在第7天为3.16。在施用IMQ之后使用
α‑柏木烯处理的组的平均分在第7天为 3.33。因此，在使用本发明的化合物处理的组中观
察到了皮肤红肿降低作用，其中α‑柏木烯显示出最强的降低作用，随后依次为柏木醇和乙
酸柏木酯(图2A‑2D和图6)。

[0142] <2‑6>被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的耳朵厚度、角化症和皮肤红肿的牛皮癣皮损面积严重度指数的累积评分的比较

[0143] 对实例<2‑3>和<2‑5>中获得的牛皮癣皮损面积严重度指数进行累积，以比较分别使用柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯经由口服给药处理的小鼠组的耳朵厚度、角化症和皮
肤红肿的牛皮癣皮损面积严重度指数。

[0144] 结果，如图7所示，α‑柏木烯和乙酸柏木酯在相似水平下表现出最强的降低作用(图7)。

[0145] <2‑7>对根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的皮肤疼痛降低作用的研究

[0146] 当挤捏实例<2‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的背部时，对那些痛苦发声并伴随有强烈排斥的小鼠进行计数。皮肤疼痛是牛皮癣的
症状，并且当施用IMQ时，皮肤疼痛会随着时间的流逝而变得愈加强烈。

[0147] 结果，如图8所示，所有组的小鼠在给药后3天后都表现出疼痛。在单独使用IMQ处理的组中，5只小鼠在第7天被证实有疼痛。然而，在施用IMQ之后使用柏木醇处理的组中，只
有一只小鼠在第4天表现出疼痛并且没有小鼠被证实在第5天有疼痛。在施用IMQ之后使用
乙酸柏木酯处理的组中，只有一只小鼠在第6天表现出疼痛并且没有小鼠被证实在第7天有
疼痛。在施用IMQ之后使用α‑柏木烯处理的组中，没有小鼠在7天观察期期间表现出疼痛。因
此，在使用本发明的化合物处理的组中观察到了皮肤疼痛降低作用，其中α‑柏木烯显示出
最强的降低作用，随后依次为柏木醇和乙酸柏木酯(图8)。

[0148] <2‑8>对根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的皮肤出血斑降低作用的研究

[0149] 用肉眼观察实例<2‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠，并对出现出血斑的小鼠的数量进行计数。出血斑是牛皮癣的症状，并且当施用
IMQ时，出血斑的数量会随着时间流逝而增加。

[0150] 结果，如图2A‑2D和图9所示，在单独使用IMQ处理的组中，只有一只小鼠在第3天出现出血斑，并且5只小鼠在第7天出现出血斑。在施用IMQ之后使用柏木醇处理的组中，一只
小鼠在第4天出现出血斑，并且3只小鼠在第7天出现出血斑。同时，在施用IMQ之后使用乙酸
柏木酯处理的组中，一只小鼠在第5天出现出血斑，并且一只小鼠在第7天出现出血斑。在施
用IMQ之后使用α‑柏木烯处理的组中，两只小鼠在第5天出现出血斑，并且只有一只小鼠在
第7天出现出血斑。因此，在使用本发明的化合物处理的组中观察到了皮肤出血斑降低作
用，其中乙酸柏木酯显示出最强的降低作用，随后依次为α‑柏木烯和柏木醇(图2A‑2D和图
9)。

[0151] <2‑9>对根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的皮肤皱纹降低作用的研究

[0152] 用肉眼观察实例<2‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠，并对出现皮肤皱纹的小鼠的数量进行计数。皮肤皱纹是牛皮癣的症状，并且当施
用IMQ时，皮肤角质化会随着时间流逝而增加并因此形成皮肤皱纹。

[0153] 结果，如图2A‑2D和图10所示，在单独使用IMQ处理的组中，只有一只小鼠在第6天出现皮肤皱纹，并且3只小鼠在第7天出现皮肤皱纹。在施用IMQ之后使用柏木醇处理的组
中，一只小鼠在第5天出现皮肤皱纹，并且2只小鼠在第7天出现皮肤皱纹。同时，在施用IMQ
之后使用乙酸柏木酯处理的组中，一只小鼠在第5天出现皮肤皱纹，并且一只小鼠在第7天
出现皮肤皱纹。在施用IMQ之后使用α‑柏木烯处理的组中，一只小鼠在第6天出现皮肤皱纹，
并且只有一只小鼠在第7天出现皮肤皱纹。因此，在使用本发明的化合物处理的组中观察到
了皮肤皱纹降低作用，其中α‑柏木烯显示出最强的降低作用，随后依次为乙酸柏木酯和柏
木醇(图2A‑2D和图10)。

[0154] <2‑10>根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的对牛皮癣诱发小鼠的脾中IL‑17A表达的抑制

[0155] 通过实时PCR(聚合酶链式反应)研究根据口服柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的对牛皮癣诱发小鼠的脾中IL‑17A表达的抑制。

[0156] 具体来说，从实例<2‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠中提取脾。通过常规方法从脾中提取总RNA。为了合成cDNA，将2μgRNA载入9μl 
DEPC(无RNA酶水)，表示浓度的稀释。将1μl寡聚dT加入其中，随后在70℃下反应10分钟。样
品在冰上处理5分钟，向其中加入2μl 10X反应缓冲液、2μl dNTP(各10mM)、1μl M‑MLV逆转
录酶和5μl无DNA酶水，以使反应混合物的总体积为20μl。使混合物在42℃下反应1小时以合
成cDNA。将反应混合物在72℃下加热10分钟以除去逆转录酶活性。然后，将反应混合物在‑
20℃下储存。通过使用AMPIGENE 1‑Step Green qPCR试剂盒 (Enzo Life Sciences Inc，
美国)进行实时PCR。

[0157] 在进行实时PCR之前，在96孔板的每个孔中加入10μl 2X Ampigene qPCR Green Mix Lo‑Rox、1μl正向引物【IL‑17A正向引物：5'‑TCTCCTCTGAATGGGGTGAA‑3'】和1μl反向引
物【IL‑17A反向引物： 5'‑CAGAGTAGGGAGCTAAATTATCCA‑3'】、2μl上面合成的cDNA模板和6μl
蒸馏水(总共20μl)。按如下用样品进行PCR：在95℃下预变性2分钟(聚合酶活化)，在95℃下
变性5秒，在65℃下退火/延伸 30秒，从变性到延伸40个循环。

[0158] 结果，如图11所示，当未经处理的对照组的IL‑17A表达被认为是值1时，单独使用IMQ处理的组的 IL‑17A表达值为54.9±5.5。在施用IMQ之后使用柏木醇、乙酸柏木酯和α‑
柏木烯处理的组的IL‑17A表达值分别为1.1±0.1、7.4±0.7和31.0±3.1。因此，在使用本
发明的化合物处理的组中抑制了IL‑17A的表达，其中α‑柏木烯显示出最强的抑制作用，随
后依次为乙酸柏木酯和柏木醇(图11)。

[0159] <2‑11>被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的皮肤厚度的比较

[0160] 为了比较皮肤厚度，将实例<2‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的皮肤用苏木精和伊红染色。

[0161] 具体来说，用CO2处理实例<2‑1>的牛皮癣诱发小鼠，从中获得背部表面1cm×1cm的部分并置于PBS 中。将用PBS洗涤的组织载入10％福尔马林中，随后在室温下固色一天。
将固色后的组织用PBS洗涤一次，随后用25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇和100％甲醇各自脱
水30分钟。另外用100％乙醇对这些组织进行进一步脱水两次，每次30分钟；用包含乙醇和
二甲苯(1：1)的混合溶液进一步脱水30分钟；并用100％二甲苯进一步脱水两次，每次30分
钟。在洗涤前4小时，打开模块化组织包埋中心(LEICA EG 1150H， Leica，德国)，并在60℃
下熔化磷片状切片石蜡(Sigma Aldrich，韩国)，然后洗涤石蜡。将组织载入瓶中，将熔化的
石蜡倒入其中，随后在60℃的温室中洗涤两次，每次1小时。将不含二甲苯的组织置于石蜡
溶液中，随后在温室中反应一天。然后将组织切片置于可撕一次性包埋模具
(Polysciences，中国台湾)上，并将石蜡溶液填充至模具的一半。将组织切片置于可撕一次
性包埋模具的顶部，随后固定。将包埋环(Thomas Scientific，美国)置于模具上，用石蜡溶
液处理以使模具和环在4℃下固化3小时，然后在4℃下反应一天。包埋的组织可以在4℃下
半永久储存。使用半机动旋转切片机(LEICA RM2145 Microtome，Leica，德国) 切割包埋的
组织，将其混悬于37℃水浴中以传播石蜡皱纹。使用微型硅烷涂层载玻片(Muto Pure 
Chemicals，日本)收集拉直的皱纹，将其在37℃下干燥一天。当组织完全干燥时，用二甲苯
处理两次，每次5分钟，以消除组织中残留的石蜡。将组织用包含乙醇和二甲苯(1:1)的混合
溶液、100％乙醇、100％甲醇、75％甲醇和50％甲醇分别进一步洗涤2分钟，以便使组织易于
染色。在室温下用Mayer苏木精染液(MHS 1‑100ML，Sigma Aldrich，韩国)处理组织30分钟，
随后用PBS洗涤10分钟。然后，在室温下用伊红Y 染液(Daejung，韩国)处理1分钟以对组织
进行染色。染色完成后，将组织用75％甲醇、100％甲醇、100％乙醇和包含乙醇和二甲苯(1:
1)的混合溶液分别脱水10秒以永久保存组织。最后，将染色的组织用二甲苯处理2分钟以固
色。然后，使用NIS‑Elements F(Nikon software，DS‑F12‑U3，Nikon，美国)程序在Nikon
eclipse Ti显微镜(Nikon Instruments，美国)plan fluor 4×0.13上测量皮肤厚度。

[0162] 结果，如图12A和12B所示，未经处理的对照组和单独使用IMQ处理的组的皮肤厚度在第7天分别为 1,045μm和1,181μm。在施用IMQ之后使用柏木醇、乙酸柏木酯或α‑柏木烯处
理的组的皮肤厚度在第7天分别为954μm(19.2％抑制)、999μm(15.3％抑制)和954μm
(19.2％抑制)。在使用本发明的化合物处理的组中观察到了皮肤厚度降低作用，并且柏木
醇和α‑柏木烯的作用相似(图12A和12B)。

[0163] 实例3：柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯对牛皮癣的治疗作用的证实

[0164] <3‑1>牛皮癣诱发小鼠的准备

[0165] 在实例<2‑1>中，咪喹莫特被施用于牛皮癣诱发小鼠，其牛皮癣发展已持续一周。在开始施用8天之后停止施用。每天经由口服给药，以200μl中100mg/kg的浓度，使用蒸馏水
处理CON和IMQ组，使用柏木醇处理C组，使用乙酸柏木酯处理CA组，单独使用α‑柏木烯处理
CE组。第8天是停止咪喹莫特施用的当天，此后，化合物的给予一天一次，持续一周，并在此
期间进行照相记录(图13A‑13D)。

[0166] <3‑2>柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯对牛皮癣诱发小鼠的耳朵厚度的恢复作用

[0167] 用肉眼观察实例<3‑1>中的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠。牛皮癣皮损面积严重度指数(PASI)为1‑4分，基于牛皮癣皮损面积严重度指数
来评估对耳朵厚度的恢复作用。

[0168] 结果，如图13A‑13D和图14所示，反映单独口服蒸馏水的组的耳朵厚度的PASI在第4天为4.0±1.0，并且分数从第14天起保持在平均数2.0±0并且没有再从该分数下降。反映
口服柏木醇的组的耳朵厚度的 PASI在第8天为4.0±0.6，并且分数在第16天降低至0.7±
0.6。反映口服乙酸柏木酯的组的耳朵厚度的PASI 在第8天为4.0±0.6，并且所有8只小鼠
从第15天起恢复正常。反映口服α‑柏木烯的组的耳朵厚度的PASI 在第8天为4.0±0.0，并
且分数在第15天降低至0.7±0.6。因此，证实在使用本发明的化合物处理的组中恢复了耳
朵厚度，其中乙酸柏木酯显示出最强的恢复作用，随后依次为柏木醇和α‑柏木烯(图13A‑
13D和图 14)。

[0169] <3‑3>柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯对牛皮癣诱发小鼠的角化症的恢复作用

[0170] 用肉眼观察实例<3‑1>中的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠。然后，计算牛皮癣皮损面积严重度指数(PASI)，基于牛皮癣皮损面积严重度指
数来评估对角化症的恢复作用。

[0171] 结果，如图13A‑13D和图15所示，反映单独口服蒸馏水的组的角化症的PASI在第8天为4.0±1.0，并且分数在第16天为0.7±0.6。反映口服柏木醇的组的角化症的PASI在第8
天为3.0±0.6，并且所有8只小鼠在第15天恢复正常。反映口服乙酸柏木酯的组的角化症的
PASI在第8天为4.0±0.6，并且分数在第14天为1.0±0.0。反映口服α‑柏木烯的组的角化症
的PASI在第8天为4.0±0.6，并且分数在第15天降低至 0.3±0.6。因此，证实在使用本发明
的化合物处理的组中恢复了角化症，其中柏木醇显示出最强的恢复作用，随后依次为乙酸
柏木酯和α‑柏木烯(图13A‑13D和图15)。

[0172] <3‑4>柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯对牛皮癣诱发小鼠的皮肤红肿的恢复作用

[0173] 用肉眼观察实例<3‑1>中的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠。然后，计算牛皮癣皮损面积严重度指数(PASI)，基于牛皮癣皮损面积严重度指
数来评估对角化症的恢复作用。

[0174] 结果，如图13A‑13D和图16所示，反映单独口服蒸馏水的组的皮肤红肿的PASI在第8天为4.0±0.0，并且分数在第16天为0.7±0.6。反映口服柏木醇的组的皮肤红肿的PASI在
第8天为3.0±0.6，并且所有小鼠的皮肤红肿在第16天消失。反映口服乙酸柏木酯的组的皮
肤红肿的PASI在第8天为4.0±0.0。反映口服α‑ 柏木烯的组的皮肤红肿的PASI在第8天为
4.0±1.0，并且所有小鼠的皮肤红肿在第16天消失。因此，证实在使用本发明的化合物处理
的组中恢复了皮肤红肿，其中柏木醇显示出最强的恢复作用，随后依次为乙酸柏木酯和α‑
柏木烯(图13A‑13D和图16)。

[0175] <3‑5>被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠的耳朵厚度、角化症和皮肤红肿的牛皮癣皮损面积严重度指数的累积评分的比较

[0176] 对实例<3‑2>和<3‑4>中获得的牛皮癣皮损面积严重度指数进行累积，以比较分别使用柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯经由口服给药处理的小鼠组的耳朵厚度、角化症和皮
肤红肿的牛皮癣皮损面积严重度指数。

[0177] 结果，如图17所示，柏木醇显示出最强的恢复作用，随后依次为乙酸柏木酯和α‑柏木烯(图16)。

[0178] <3‑6>柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯对牛皮癣诱发小鼠的出血斑的恢复作用

[0179] 用肉眼观察实例<3‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠，并对表现出出血斑恢复的小鼠的数量进行计数。

[0180] 结果，如图13A‑13D和图18所示，单独口服蒸馏水的组的所有8只小鼠在第8天出现出血斑，但在实验终止的第16天，只有1只小鼠出现出血斑。在使用柏木醇处理的组中，6只
小鼠在第8天出现出血斑，但在第12天，没有小鼠出现出血斑。在使用乙酸柏木酯处理的组
中，6只小鼠在第8天出现出血斑，但在第16天，没有小鼠出现出血斑。在使用α‑柏木烯处理
的组中，4只小鼠在第8天出现出血斑，但在第16 天，没有小鼠出现出血斑。因此，证实在使
用本发明的化合物处理的组中证实了对出血斑的恢复作用，其中柏木醇显示出最强的恢复
作用，随后依次为乙酸柏木酯和α‑柏木烯(图13A‑13D和图18)。

[0181] <3‑7>柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯对牛皮癣诱发小鼠的皮肤皱纹的恢复作用

[0182] 用肉眼观察实例<3‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠，并对表现出皮肤皱纹恢复的小鼠的数量进行计数。

[0183] 结果，如图13A‑13D和图19所示，在单独口服蒸馏水而未使用本发明的化合物处理的组中，5只小鼠出现皮肤皱纹，但只有一只小鼠在实验终止的第16天出现皮肤皱纹。在使
用柏木醇处理的组中，5只小鼠在第8天出现皮肤皱纹，但没有小鼠在第15天后出现皮肤皱
纹。在使用乙酸柏木酯处理的组中，3只小鼠在第8天出现皮肤皱纹，但没有小鼠在第16天出
现皮肤皱纹。在使用α‑柏木烯处理的组中，3只小鼠在第 8天出现皮肤皱纹，但没有小鼠在
第16天出现皮肤皱纹。因此，证实在使用本发明的化合物处理的组中证实了对皮肤皱纹的
恢复作用，其中柏木醇显示出最强的恢复作用，随后依次为α‑柏木烯和乙酸柏木酯(图 
13A‑13D和图19)。

[0184] <3‑8>柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯对牛皮癣诱发小鼠的毛发再生的促进作用

[0185] 用肉眼观察实例<3‑1>的被经口服给予柏木醇、乙酸柏木酯和α‑柏木烯的牛皮癣诱发小鼠，并对表现出毛发再生的小鼠的数量进行计数。

[0186] 结果，如图13A‑13D和图20所示，在单独口服蒸馏水而未使用本发明的化合物处理的组中，一只小鼠在第14天表现出毛发再生，但5只小鼠在实验终止的第16天表现出毛发再
生。在使用柏木醇处理的组中， 2只小鼠在第13天表现出毛发再生，但没有小鼠在第15天后
表现出皮肤皱纹。在使用柏木醇处理的组中， 2只小鼠在第13天表现出毛发再生，并且该组
中的所有小鼠在第16天表现出毛发再生。在使用乙酸柏木酯处理的组中，一只小鼠在第14
天表现出毛发再生，并且7只小鼠在第16天表现出毛发再生。在使用α‑柏木烯处理的组中，
一只小鼠在第13天表现出毛发再生，并且所有小鼠在第16天表现出毛发再生。因此，证实在
使用本发明的化合物处理的组中证实了对毛发再生的促进作用，其中柏木醇显示出最强的
促进作用，随后依次为α‑柏木烯和乙酸柏木酯(图13A‑13D和图20)。