抗逆相关蛋白TaMYB85及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了抗逆相关蛋白TaMYB85及其编码基因与应用。本发明所提供的抗逆相关蛋白TaMYB85，为如下1)或2)或3)：1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆性相关的蛋白质。实验证明，将编码抗逆相关蛋白TaMYB85的核酸分子导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到转基因拟南芥；高温处理后，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐热性显著提高。因此，抗逆相关蛋白TaMYB85可调控植物抗逆性。

权利要求

1.蛋白质TaMYB85，为如下1）或2）：

1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

2）在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质TaMYB85的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表中序列1自5′末端起第64至1020位所示的DNA分子；

（a2）与（a1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质TaMYB85的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

5.b1）或b2）的应用：

b1）权利要求1所述蛋白质TaMYB85，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求

2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗逆性中的应用；

b2）权利要求1所述蛋白质TaMYB85，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求

2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用；

所述抗逆性为耐热性。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；所述双子叶植物为十字花科植物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述禾本科植物为小麦；所述十字花科植物为拟南芥。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述小麦为小麦品种TAM107；所述拟南芥为哥伦比亚生态型拟南芥。

10.一种培育转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质TaMYB85的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗逆性提高；所述抗逆性为耐热性。

11.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1所述蛋白质TaMYB85的含量和/或活性，从而提高植物的抗逆性；所述抗逆性为耐热性。

12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；所述双子叶植物为十字花科植物。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述禾本科植物为小麦；所述十字花科植物为拟南芥。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述小麦为小麦品种TAM107；所述拟南芥为哥伦比亚生态型拟南芥。

说明书

抗逆相关蛋白TaMYB85及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及抗逆相关蛋白TaMYB85及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。

[0003] 在高温、干旱、高盐等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。

[0004] 近年来，随着温室效应的加剧，全球平均气温日渐升高，高温使植物生育期缩短、早衰，抗病虫害能力下降，降低花粉育性和坐果率，成为限制植物生长和地域分布的重要因素之－。小麦作为我国重要的粮食作物，起源于温带，在生长季节内(尤其是生育后期)遭遇高温会严重影响其生长发育，导致产量下降，品质变劣。因此鉴定小麦抗逆相关基因并探讨耐热分子生物学机制，将为今后分子设计育种培育抗逆性小麦品种提供优异基因资源和理论技术支持。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题时如何提高植物的抗逆性。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质TaMYB85。

[0007] 本发明所提供的蛋白质TaMYB85，可为如下1)或2)或3)：

[0008] 1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

[0009] 2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

[0010] 3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆性相关的蛋白质。

[0011] 其中，序列表中序列2由318个氨基酸残基组成。

[0012] 为了使1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0013] 表1.标签的序列

[0014]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0015] 上述3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0016] 上述3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0017] 上述3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端起第64至1020位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0018] 上述任一所述蛋白质TaMYB85中，所述抗逆性可为耐热性。

[0019] 编码所述蛋白质TaMYB85的核酸分子也属于本发明的保护范围。

[0020] 编码所述蛋白质TaMYB85的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：

[0021] (a1)编码区如序列表中序列1自5′末端起第64至1020位所示的DNA分子；

[0022] (a2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第64至1020位所示的DNA分子；

[0023] (a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质TaMYB85的DNA分子；

[0024] (a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质TaMYB85的DNA分子。

[0025] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0026] 其中，序列表中序列1由1077个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

[0027] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质TaMYB85的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质TaMYB85的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白TaMYB85，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0028] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质TaMYB85的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0029] 含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

[0030] 所述重组载体可为将编码所述蛋白质TaMYB85的核酸分子(即序列表中序列1自5′末端起第64至1020位所示的DNA分子)插入出发质粒得到的重组质粒。

[0031] 所述重组载体具体可为重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85。所述重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85为将载体pJIT163hGFP的限制性内切酶HindIII和XbaI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5′末端起第64至1017位所示的DNA分子。重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85表达序列表中序列2所示的蛋白质TaMYB85。

[0032] 所述重组载体具体可为重组质粒Psuper1300-TaMYB85。所述重组质粒Psuper1300-TaMYB85为将载体Psuper1300的限制性内切酶XbaI和SacI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5′末端起第64至1020位所示的DNA分子。重组质粒Psuper1300-TaMYB85表达序列表中序列2所示的蛋白质TaMYB85。

[0033] 所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。

[0034] 所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具体可为根癌农杆菌GV3101。

[0035] 所述重组微生物具体可为GV3101/Psuper1300-TaMYB85。GV3101/Psuper1300-TaMYB85是将重组质粒Psuper1300-TaMYB85转化根癌农杆菌GV3101得到的重组农杆菌。

[0036] 所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaMYB85基因(即蛋白质TaMYB85的编码基因)转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

[0037] 下述b1)或b2)也属于本发明的保护范围：

[0038] b1)所述蛋白质TaMYB85，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗逆性中的应用；

[0039] b2)所述蛋白质TaMYB85，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用。

[0040] 上述应用中，所述调控植物抗逆性可为提高植物抗逆性。

[0041] 上述应用中，所述抗逆性改变可为抗逆性提高。

[0042] 上述应用中，所述抗逆性可为耐热性。

[0043] 为解决上述技术问题，本发明还提供了培育转基因植物的方法。

[0044] 本发明所提供的培育转基因植物的方法，可包括将编码所述蛋白质TaMYB85的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗逆性提高。

[0045] 上述方法中，编码所述蛋白质TaMYB85的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：

[0046] (a1)编码区如序列表中序列1自5′末端起第64至1020位所示的DNA分子；

[0047] (a2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第64至1020位所示的DNA分子；

[0048] (a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质TaMYB85的DNA分子；

[0049] (a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质TaMYB85的DNA分子。

[0050] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0051] 其中，序列表中序列1由1077个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

[0052] 上述方法中，所述“将编码所述蛋白质TaMYB85的核酸分子导入受体植物中”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质TaMYB85的核酸分子得到的重组质粒。

[0053] 所述重组载体具体可为所述重组质粒Psuper1300-TaMYB85。

[0054] 为解决上述技术问题，本发明还提供植物育种方法。

[0055] 本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质TaMYB85的含量和/或活性，从而提高植物的抗逆性。

[0056] 上述植物育种方法中，所述“增加植物中所述蛋白质TaMYB85的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述蛋白质TaMYB85的含量和/或活性的效果。

[0057] 上述植物育种方法中，所述抗逆性可为耐热性。

[0058] 上述任一所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)小麦；c5)小麦品种TAM107；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)哥伦比亚生态型拟南芥。

[0059] 实验证明，将编码抗逆相关蛋白TaMYB85的核酸分子导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到转基因拟南芥；高温处理后，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐热性显著提高。因此，抗逆相关蛋白TaMYB85可调控植物抗逆性。

附图说明

[0060] 图1为TaMYB85基因在小麦品种中国春不同组织器官中的表达模式。

[0061] 图2为TaMYB85基因在不同逆境胁迫条件下的表达模式。

[0062] 图3为亚细胞定位的实验结果。

[0063] 图4为转TaMYB85基因拟南芥的耐热性鉴定。

具体实施方式

[0064] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0065] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0066] 引物T15和M-MLV反转录酶均为Promega公司的产品。2×SYBR为Takara公司的产品。根癌农杆菌GV3101为BIOMED公司的产品。

[0067] 小麦品种TAM107和小麦品种中国春均记载于如下文献中：Qin D，Wu H，Peng H，et al.Heat stress-responsive transcriptome analysis in heat susceptible and tolerant wheat(Triticum aestivum L.)by using Wheat Genome Array[J].BMC genomics，2008，9(1)：432.。小麦品种TAM107(以下简称TAM107)属于冬小麦品种，为耐热型。小麦品种中国春(以下简称中国春)属于春小麦品种，为热敏感型。

[0068] 水培条件为：22℃/18℃。水培的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养；光照培养2 -1
时的光照强度为120-150μmol/m·s ；湿度为60％-70％。

[0069] 光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)条件为：22℃/18℃。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养；光照培养时的光照强度为120-150μmol/m2·s-1；湿度为60％-70％。

[0070] 热处理培养条件为：38℃。热处理培养的周期为16h光照培养/8h黑暗培养；光照培养时的光照强度为120-150μmol/m2·s-1；湿度为60％-70％。

[0071] 酶解液：将溶液甲(溶质及其浓度为：1％(1mg/100mL)纤维素酶R-10、0.25％(0.25mg/100mL)离析酶R-10、0.4M甘露醇、20mM KCl和20mM MES；溶剂为超纯水；pH值为5.7)先置于55℃水浴10min，然后冷却至室温，加入CaCl2、BSA和β-巯基乙醇，得到溶液乙；
溶液乙中，CaCl2的浓度为10mM，BSA的浓度为0.1％(0.1mg/100mL)，β-巯基乙醇的浓度为
5mM。最后用直径为0.45μM的滤膜过滤，得到酶解液。

[0072] W5溶液的溶质及其浓度为：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、5mM葡萄糖和2mM MES；溶剂为超纯水；pH值为5.7。

[0073] MMg溶液的溶质及其浓度为：0.4M甘露醇、15mM MgCl2和4mM MES；溶剂为超纯水；pH值为5.7。

[0074] PEG/Ca2+溶液：将4g PEG4000、2.5mL浓度为0.8M的甘露醇水溶液、1mL浓度为1M的CaCl2水溶液溶于8mL超纯水中，65℃水浴溶解。

[0075] WI溶液的溶质及其浓度为：0.5M甘露醇、20mM KCl和4mM MES；溶剂为超纯水；pH值为5.7。

[0076] 载体Psuper1300记载于如下文献中：Guo L，Yang H，Zhang X，et al.Lipid transfer protein 3as a target of MYB96mediates freezing and drought stress in Arabidopsis[J].Journal of experimental botany,2013，64(6)：1755-1767.[0077] 载体pJIT163hGFP记载于如下文献中：Cheng H，Kun W，Liu D，et al.Molecular cloning and expression analysis of CmMlo1in melon[J].Molecular biology reports，2012，39(2)：1903-1907.

[0078] 实施例1、蛋白质TaMYB85的编码基因的克隆

[0079] 1、取水培10d的TAM107的幼苗，置于40℃培养箱，光照培养(光照强度为120-150μmol/m2·s-1)1h；然后用液氮速冻，-80℃保存，作为实验材料。

[0080] 2、取步骤1得到的实验材料，用TRIZOL提取总RNA，然后采用引物T15和M-MLV反转录酶进行反转录，得到小麦的cDNA。小麦的cDNA中，cDNA浓度为100ng/μL。

[0081] 3、以小麦的cDNA为模板，以TaMYB85-L：5’-CCAATCAACTCACAACGCAAG-3’和TaMYB85-R：5’-AGCCTACACAAATCC-3’为引物进行PCR扩增，得到约1077bp的PCR扩增产物。

[0082] 反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

[0083] 对PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列表中序列1自5’末端起第64至1020位所示的DNA分子(以下命名为TaMYB85基因)编码序列表中序列2所示的蛋白质(以下命名为TaMYB85蛋白或蛋白质TaMYB85)。

[0084] 实施例2、表达模式分析

[0085] 一、TaMYB85基因在中国春不同组织器官中的表达模式

[0086] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

[0087] 1、取3株在大田中正常生长至苗期的中国春的叶片(以下简称苗期叶)，用TRIZOL提取总RNA，然后采用引物T15和M-MLV反转录酶进行反转录，得到苗期叶的cDNA。苗期叶的cDNA中，cDNA浓度为100ng/μL。

[0088] 按照上述方法，将苗期叶分别替换为在大田中正常生长至苗期的中国春的根(以下简称苗期根)、在大田中正常生长至花期的中国春的根(以下简称花期根)、在大田中正常生长的中国春的茎(以下简称茎)、在大田中正常生长的中国春的旗叶(以下简称旗叶)、在大田中正常生长的中国春的幼穗(以下简称幼穗)和在大田中正常生长至花期的中国春的穗(以下简称花期穗)，其它步骤均不变，分别得到苗期根的cDNA、花期根的cDNA、茎的cDNA、旗叶的cDNA、幼穗的cDNA和花期穗的cDNA。

[0089] 2、对步骤1得到的各个cDNA中TaMYB85基因的相对表达量进行实时荧光定量分析。

[0090] 反应体系：10μL 2×SYBR、2μL上游引物(浓度为2μmol·L-1)、2μL下游引物(浓度为2μmol·L-1)、1μL cDNA模板和5μL ddH2O。

[0091] 反应程序：94℃2min；94℃30s，58℃30s，68℃30s，40个循环。

[0092] 检测TaMYB85基因的引物为5’-CAGTCCAGCTCTCTGAATGG-3’和5’-GGTCGTCGTGGTCGCAC-3’。检测小麦Actin的引物为5’-CTCCCTCACAACAACCGC-3’和5’-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3’。

[0093] 实验结果见图1。结果表明，TaMYB85基因在中国春苗期的根中和中国春花期的根中的相对表达量较高。

[0094] 二、高温胁迫下TaMYB85基因的表达模式

[0095] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

[0096] 1、取3株水培10d的TAM107的幼苗，置于40℃培养箱，光照培养(光照强度为120-150μmol/m2·s-1)0.5h，然后用TRIZOL提取总RNA，得到的RNA命名为高温处理0.5h RNA。采用引物T15和M-MLV反转录酶对高温处理0.5h RNA进行反转录，得到的cDNA命名为高温处理
0.5h cDNA。

[0097] 按照上述方法，将0.5h分别替换为1h、2h、4h、6h、12h和24h，其它步骤均不变，分别得到高温处理1h cDNA、高温处理2h cDNA、高温处理4h cDNA、高温处理6h cDNA、高温处理12h cDNA和高温处理24h cDNA。

[0098] 用TRIZOL提取3株水培10d的TAM107的幼苗的总RNA，得到对照RNA。采用引物T15和M-MLV反转录酶对对照RNA进行反转录，得到的cDNA命名为对照cDNA。

[0099] 2、对步骤1得到的各个cDNA中TaMYB85基因的相对表达量进行实时荧光定量分析。

[0100] 反应体系、反应程序、检测TaMYB85基因的引物和检测小麦Actin的引物均同步骤一中2。

[0101] 实验结果见图2中的左上图(0h为对照cDNA，0.5h为高温处理0.5h cDNA，1h为高温处理1h cDNA，2h为高温处理2h cDNA，4h为高温处理4h cDNA，6h为高温处理6h cDNA，12h为高温处理12h cDNA，24h为高温处理24h cDNA)。结果表明，在高温胁迫下，随着处理时间的延长，TaMYB85基因的相对表达量不同程度的上升。

[0102] 三、高盐胁迫下TaMYB85基因的表达模式

[0103] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

[0104] 1、取3株水培10d的TAM107的幼苗，吸干根上的水分后将幼苗置于200mM的氯化钠水溶液中，培养0.5h，然后用TRIZOL提取总RNA，得到的RNA命名为高盐处理0.5h RNA。采用引物T15和M-MLV反转录酶对高盐处理0.5h RNA进行反转录，得到的cDNA命名为高盐处理0.5h cDNA。

[0105] 按照上述方法，将0.5h分别替换为1h、2h、4h、6h、12h和24h，其它步骤均不变，分别得到高盐处理1h cDNA、高盐处理2h cDNA、高盐处理4h cDNA、高盐处理6h cDNA、高盐处理12h cDNA和高盐处理24h cDNA。

[0106] 用TRIZOL提取3株水培10d的TAM107的幼苗的总RNA，得到对照RNA。采用引物T15和M-MLV反转录酶对对照RNA进行反转录，得到的cDNA命名为对照cDNA。

[0107] 2、对步骤1得到的各个cDNA中TaMYB85基因的相对表达量进行实时荧光定量分析。

[0108] 反应体系、反应程序、检测TaMYB85基因的引物和检测小麦Actin的引物均同步骤一中2。

[0109] 实验结果见图2中的右上图(0h为对照cDNA，0.5h为高盐处理0.5h cDNA，1h为高盐处理1h cDNA，2h为高盐处理2h cDNA，4h为高盐处理4h cDNA，6h为高盐处理6h cDNA，12h为高盐处理12h cDNA，24h为高盐处理24h cDNA)。结果表明，在高盐胁迫下，随着处理时间的延长，TaMYB85基因的相对表达量先上升后下降。

[0110] 四、干旱胁迫下TaMYB85基因的表达模式

[0111] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

[0112] 1、取3株水培10d的TAM107的幼苗，吸干根上的水分后将幼苗置于20％(m/m)的PEG6000水溶液中，培养0.5h，然后用TRIZOL提取总RNA，得到的RNA命名为干旱处理0.5h RNA。采用引物T15和M-MLV反转录酶对干旱处理0.5h RNA进行反转录，得到的cDNA命名为干旱处理0.5h cDNA。

[0113] 按照上述方法，将0.5h分别替换为1h、2h、4h、6h、12h和24h，其它步骤均不变，分别得到干旱处理1h cDNA、干旱处理2h cDNA、干旱处理4h cDNA、干旱处理6h cDNA、干旱处理12h cDNA和干旱处理24h cDNA。

[0114] 用TRIZOL提取3株水培10d的TAM107的幼苗的总RNA，得到对照RNA。采用引物T15和M-MLV反转录酶对对照RNA进行反转录，得到的cDNA命名为对照cDNA。

[0115] 2、对步骤1得到的各个cDNA中TaMYB85基因的相对表达量进行实时荧光定量分析。

[0116] 反应体系、反应程序、检测TaMYB85基因的引物和检测小麦Actin的引物均同步骤一中2。

[0117] 实验结果见图2中的左下图(0h为对照cDNA，0.5h为干旱处理0.5h cDNA，1h为干旱处理1h cDNA，2h为干旱处理2h cDNA，4h为干旱处理4h cDNA，6h为干旱处理6h cDNA，12h为干旱处理12h cDNA，24h为干旱处理24h cDNA)。结果表明，在干旱胁迫下，随着处理时间的延长，TaMYB85基因的相对表达量先上升后缓慢下降。

[0118] 五、脱落酸胁迫下TaMYB85基因的表达模式

[0119] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

[0120] 1、取3株水培10d的TAM107的幼苗，吸干根上的水分后将幼苗置于200μM的ABA水溶液中，培养0.5h，然后用TRIZOL提取总RNA，得到的RNA命名为脱落酸处理0.5h RNA。采用引物T15和M-MLV反转录酶对脱落酸处理0.5h RNA进行反转录，得到的cDNA命名为脱落酸处理0.5h cDNA。

[0121] 按照上述方法，将0.5h分别替换为1h、2h、4h、6h、12h和24h，其它步骤均不变，分别得到脱落酸处理1h cDNA、脱落酸处理2h cDNA、脱落酸处理4h cDNA、脱落酸处理6h cDNA、脱落酸处理12h cDNA和脱落酸处理24h cDNA。

[0122] 用TRIZOL提取3株水培10d的TAM107的幼苗的总RNA，得到对照RNA。采用引物T15和M-MLV反转录酶对对照RNA进行反转录，得到的cDNA命名为对照cDNA。

[0123] 2、对步骤1得到的各个cDNA中TaMYB85基因的相对表达量进行实时荧光定量分析。

[0124] 反应体系、反应程序、检测TaMYB85基因的引物和检测小麦Actin的引物均同步骤一中2。

[0125] 实验结果见图2中的右下图(0h为对照cDNA，0.5h为脱落酸处理0.5h cDNA，1h为脱落酸处理1h cDNA，2h为脱落酸处理2h cDNA，4h为脱落酸处理4h cDNA，6h为脱落酸处理6h cDNA，12h为脱落酸处理12h cDNA，24h为脱落酸处理24h cDNA)。结果表明，在脱落酸胁迫下，随着处理时间的延长，TaMYB85基因的相对表达量不同程度的上升。

[0126] 实施例3、亚细胞定位

[0127] 1、以实施例1获得的PCR扩增产物为模板，以TaMYB85-HindIII-L：

[0128] 5'-AGCCCAAGCTTATGGGGAGGGCGCC-3'(下划线为限制性内切酶HindIII的识别序列)和TaMYB85-XbaI-R：5'-GCTCTAGACATGTCATACAC-3'(下划线为限制性内切酶XbaI的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到约970bp的PCR扩增产物。

[0129] 2、用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切步骤1得到的PCR扩增产物，回收约960bp的酶切产物。

[0130] 3、用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切载体pJIT163hGFP，回收约4.5kb的载体骨架。

[0131] 4、将酶切产物和载体骨架进行连接，得到重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85。

[0132] 对重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85进行测序。根据测序结果，对重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85进行结构描述如下：将载体pJIT163hGFP的限制性内切酶HindIII和XbaI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5′末端起第64至1017位所示的DNA分子。重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85表达序列表中序列2所示的TaMYB85蛋白。重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85中，TaMYB85基因的插入方向与GFP阅读框一致。

[0133] 5、制备小麦原生质体

[0134] (1)取TAM107的种子，置于培养箱，光暗交替培养4-5d，得到小麦幼苗。

[0135] (2)完成步骤(1)后，先切下小麦幼苗的叶子，再切割成0.5mm×1mm的细条，将这些细条命名为小麦组织。

[0136] (3)完成步骤(2)后，向小麦组织中加入酶解液，室温酶解3h，得到消化液。

[0137] (4)完成步骤(3)后，取消化液，用滤网(规格为100-200目)过滤，得到滤液。

[0138] (5)完成步骤(4)后，取滤液，4℃、100g离心1min，弃上清，收集沉淀甲。

[0139] (6)完成步骤(5)后，取沉淀甲，加入等体积预冷的W5溶液洗涤，然后4℃、100g离心1min，弃上清，收集沉淀乙。

[0140] (7)完成步骤(6)后，取沉淀乙，加入1/2体积预冷的W5溶液，轻柔悬浮沉淀，冰上放置30min，4℃、100g离心1min，弃上清，收集沉淀丙。沉淀丙即为制备的小麦原生质体。

[0141] 6、转化

[0142] (1)取小麦原生质体，加入适量的预冷的MMg溶液进行重悬，4℃、100g离心1min，弃上清，向沉淀中加入适量MMg溶液得到原生质体浓度为2×105个/mL的原生质体溶液。

[0143] (2)将100μL原生质体溶液和10μL重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85水溶液(含15-20μg重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85)轻柔混匀，然后加入110μL PEG/Ca2+溶液，混匀，室温黑暗条件下静置30min；然后加入500μL W5溶液，轻轻混匀，100g离心1min，弃上清，将沉淀用W5溶液洗涤1-2次。

[0144] (3)完成步骤(2)后，取所述原生质体，加入1mL WI溶液，置于六孔板中暗培养12-18h；然后100g离心1min，弃部分上清并将沉淀充分混匀，然后置于载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察小麦原生质体内的荧光信号。

[0145] 按照上述方法，将重组质粒pJIT163hGFP-TaMYB85替换为载体pJIT163hGFP，其它步骤均不变，作为对照。

[0146] 实验结果见图3(从左至右依次为GFP荧光、白光、GFP荧光和白光的叠加)。结果表明，TaMYB85蛋白定位于细胞核。

[0147] 实施例5、转基因拟南芥的获得及鉴定

[0148] 一、重组质粒Psuper1300-TaMYB85的获得

[0149] 1、以实施例1获得的PCR扩增产物为模板，以TaMYB85-XbaI-L：5'-GCTCTAGAATGGGGAGGGCGCC-3'(下划线为限制性内切酶XbaI的识别序列)和TaMYB85-SacI-R：5'-AAGCGAGCTCTCACATGTCATACAC-3'(下划线为限制性内切酶SacI的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到约980bp的PCR扩增产物。

[0150] 2、用限制性内切酶XbaI和SacI酶切步骤1得到的PCR扩增产物，回收约970bp的酶切产物。

[0151] 3、用限制性内切酶XbaI和SacI酶切载体Psuper1300，回收约9kb的载体骨架。

[0152] 4、将酶切产物和载体骨架进行连接，得到重组质粒Psuper1300-TaMYB85。

[0153] 对重组质粒Psuper1300-TaMYB85进行测序。根据测序结果，对重组质粒Psuper1300-TaMYB85进行结构描述如下：将载体Psuper1300的限制性内切酶XbaI和SacI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5′末端起第64至1020位所示的DNA分子。重组质粒Psuper1300-TaMYB85表达序列表中序列2所示的TaMYB85蛋白。

[0154] 二、农杆菌的获得

[0155] 1、将重组质粒Psuper1300-TaMYB85导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/Psuper1300-TaMYB85。

[0156] 2、将载体Psuper1300导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/Psuper1300。

[0157] 三、转基因拟南芥的获得

[0158] 哥伦比亚生态型拟南芥为Arabidopsis Biological Resource Center的产品，详见网址http://abrc.osu.edu/。在下文中，哥伦比亚生态型拟南芥简称为野生型拟南芥或WT。

[0159] 1、采用拟南芥花序浸花转化法(Clough，S.J.，andBent，A.F..Floraldip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将步骤二中1制备的GV3101/Psuper1300-TaMYB85转至野生型拟南芥中，获得T1代转TaMYB85基因拟南芥的种子。

[0160] 2、将T1代转TaMYB85基因拟南芥的种子种植于含30mg/L潮霉素的MS培养基上，25℃培养4周，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转TaMYB85基因阳性苗。T1代转TaMYB85基因阳性苗收到的种子即为T2代转TaMYB85基因拟南芥的种子。

[0161] 3、将步骤2筛选出的不同株系的T2代转TaMYB85基因拟南芥的种子播种于含30mg/L潮霉素的MS培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为TaMYB85基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转TaMYB85基因拟南芥的种子。

[0162] 4、将步骤3筛选出的T3代转TaMYB85基因拟南芥的种子再次播种于含30mg/L潮霉素的MS培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转TaMYB85基因拟南芥。将其中10个T3代纯合转TaMYB85基因拟南芥的株系依次命名为L1至L10，并进行后续实验。

[0163] 按照上述方法，将GV3101/Psuper1300-TaMYB85替换为GV3101/Psuper1300，其它步骤均相同，得到T3代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。

[0164] 三、分子鉴定

[0165] 1、分别取L1至L10的T3代种子，种植于营养土中，25℃培养4周，得到L1至L10的幼苗。

[0166] 2、分别提取L1至L10的幼苗的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用F4：5’-ATGGGGAGGGCGCCGTGCTG-3’和R4：5’-TCACATGTCATACACCACAG-3’组成的引物对1进行PCR扩增，然后进行电泳。

[0167] 3、分别提取L1至L10的幼苗的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用F5：5’-GCTCCTCTTAACCCAAAGGC-3’和R5：5’-CACACCATCACCAGAATCCAGC-3’组成的引物对2进行PCR扩增，然后进行电泳。

[0168] 按照上述方法，将L1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为水，其它步骤均相同，作为阴性对照。

[0169] 按照上述方法，将L1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为转空载体拟南芥的幼苗的叶片的基因组DNA，其它步骤均相同，作为对照1。

[0170] 按照上述方法，将L1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为野生型拟南芥的幼苗的叶片的基因组DNA，其它步骤均相同，作为对照2。

[0171] 按照上述方法，将L1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为重组质粒Psuper1300-TaMYB85，其它步骤均相同，作为阳性对照。

[0172] 部分实验结果见图4中A(TaMYB85为采用引物对1的PCR扩增结果，Actin2为采用引物对2的PCR扩增结果)。结果表明，以L1至L10的幼苗的叶片的基因组DNA或重组质粒Psuper1300-TaMYB85为模板，采用引物对1均能扩增得到957bp的条带，采用引物对2均能扩增得到156bp的条带；以水、转空载体拟南芥的幼苗的叶片的基因组DNA或野生型拟南芥的幼苗的叶片的基因组DNA为模板，采用引物对1均不能扩增得到957bp的条带，采用引物对2均能扩增得到156bp的条带。

[0173] 经过分子鉴定，L1至L10均为转TaMYB85基因拟南芥。

[0174] 四、转TaMYB85基因拟南芥的耐热性鉴定

[0175] 待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥种子、L1的T3代种子、L2的T3代种子、L3的T3代种子、L4的T3代种子、L5的T3代种子或L6的T3代种子。

[0176] 1、高温胁迫处理拟南芥种子

[0177] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：将待测拟南芥种子用50℃水浴处理70min，然后播种于MS培养基上，光暗交替培养2周，观察拟南芥种子的表型并统计萌发率。

[0178] 部分实验结果见图4中B(左图为高温胁迫处理下拟南芥种子的表型；右图为高温胁迫处理下拟南芥种子的萌发率统计结果)。结果表明，L1至L6的萌发率均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的萌发率无显著差异。

[0179] 2、高温胁迫处理拟南芥植株

[0180] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

[0181] (1)将待测拟南芥种子播种于MS培养基上光暗交替培养7d；然后移栽到营养土中，光暗交替培养14d；再热处理培养14d，观察拟南芥植株的表型并统计存活率。

[0182] (2)将待测拟南芥种子播种于MS培养基上光暗交替培养7d；然后移栽到营养土中，光暗交替培养28d，观察拟南芥植株的表型并统计存活率。

[0183] 部分实验结果见图4中C(左图为拟南芥植株的表型；右图为拟南芥种子的存活率统计结果)。结果表明，高温胁迫处理下，L1至L6的存活率均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的存活率无显著差异；正常培养条件下，野生型拟南芥、转空载体拟南芥和L1至L6的存活率均无显著差异。