一种利用化学-酶法生产L-草铵膦的方法转让专利
申请号 : CN201810338960.7
文献号 : CN108690854B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : 薛亚平 , 郑裕国 , 曹成浩 , 徐建妙 , 吴哲明
申请人 : 浙江工业大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种化学‑酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述方法为:以外消旋N‑乙酰草铵膦为底物,以SEQ ID NO.2所示含羧肽酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂,以pH值为5~10的缓冲液为反应介质,在45℃水浴摇床
200rpm条件下反应,反应完全后,获得含D‑N‑乙酰草铵膦和L‑草铵膦的反应液,将反应液分离纯化,收集D‑N‑乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分,同时获得L‑草铵膦;所述工程菌宿主菌为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
2.如权利要求1所述化学‑酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述底物终浓度以缓冲液体积计为10~100mM,所述催化剂用量以湿菌体重量计为5~50g/L缓冲液。
3.如权利要求1所述化学‑酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述外消旋N‑乙酰草铵膦按如下方法制备:以外消旋的草铵膦为原料,加入乙酸,10‑60℃保温搅拌,加入乙酸酐,反应至溶液澄清透明,在80℃、0.075~0.085MPa条件下旋蒸除去乙酸,取浓缩物用水溶解,并用氢氧化钠水溶液调至中性,加入乙醇静置析出晶体,干燥,获得外消旋N‑乙酰草铵膦;
所述乙酸与外消旋的草铵膦重量比20~30:1,所述乙酸酐与外消旋的草铵膦重量比为0.7~1.5:1。
4.如权利要求1所述化学‑酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述催化剂按如下方法制备:(1)湿菌体:将含羧肽酶基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,
37℃培养过夜,再以体积浓度1%接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150rpm培养至菌体浓度OD600至0.4‑0.8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,28℃诱导培养12h后,4℃、8000rpm离心10min,收集湿菌体;(2)纯酶:将步骤(1)湿菌体悬浮于20mM、pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液中,振荡摇匀后超声波破碎15min,破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片,收集上清液;将上清液进行Ni‑NTA柱层析,先用上样平衡缓冲液平衡Ni‑NTA柱后,以
1.5mL/min的速率上样上清液,用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白,最后用洗脱缓冲液洗脱收集目标蛋白,目标蛋白在20mM、pH 8.5的Tris‑HCl中透析,取截留液即为纯酶;
所述上样平衡缓冲液为含500mM NaCl和20mM咪唑的20mM Tris‑HCl,pH 8.5;所述洗脱缓冲液为含500mM NaCl和500mM咪唑的20mM Tris‑HCl,pH 8.5。
5.如权利要求1所述化学‑酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述反应液分离纯化的方法为:反应完全后,将反应液离心,取上清液调节pH值至2,抽滤,取滤液上样至氢型001x7阳离子树脂,离子交换柱柱高比15:1,上样流速为1.0BV/h,上样后用超纯水冲洗4BV,收集含有未反应底物D‑N‑乙酰草铵膦流出液,将D‑N‑乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分;再用
2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱,收集含有L‑草铵膦的洗脱液,将洗脱液在60℃,真空度
0.075~0.085MPa下,减压浓缩,结晶得到L‑草铵膦。
6.如权利要求5所述化学‑酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述D‑N‑乙酰草铵膦消旋化方法为:将含D‑N‑乙酰草铵膦流出液减压蒸干,加入乙酸混合,再加入乙酸酐,在100‑
125℃搅拌消旋反应,反应结束后将反应液减压蒸干,获得外消旋N‑乙酰草铵膦,用于循环拆分;所述乙酸酐与D‑N‑乙酰草铵膦质量比为0.1~3:1,乙酸与D‑N‑乙酰草铵膦质量比为
10~20:1。
说明书 :
一种利用化学‑酶法生产L‑草铵膦的方法
(一)技术领域
剂用途广泛,国内外市场巨大,草铵膦为三大除草剂之一,近几年由于其作用机理和转基因
技术,其市场份额有望进一步突破。
小,对环境影响小。但是现在大规模生产的商品化草铵膦都是外消旋混合物的形式。外消旋
草铵膦的使用,浪费巨大,而且对环境影响较为严重。为了减轻环保压力,减低生产成本,探
索一条具有工业化应用前景的拆分外消旋草铵膦的生产路线具有重要的市场前景和社会
意义。
耗大量昂贵的手性拆分试剂,工艺较复杂,收率一般较低。
转氨酶与氨基酸脱氢酶。
phosphinothricin‑specific transaminase from Escherichia coli[J].Applied and
Environmental Microbiology,1990,56(1):1‑6)等利用从大肠杆菌中克隆的转氨酶,以2‑
羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物,L‑谷氨酸为氨基供体,制备L‑草铵膦。但是可逆的
反应常常造成产率降低,需要加入过量的氨基供体,这给后期的产物分离带来很大的负担。
经过分离、再消旋后、再进行酶催化反应,其理论产率可达100%。
(三)发明内容
纯酶为催化剂,以pH值为5~10的缓冲液(优选pH=8.9,50mM的Tris‑HCl缓冲液)为反应介
质,在45℃水浴摇床200rpm条件下反应,反应完全后,获得含D‑N‑乙酰草铵膦和L‑草铵膦的
反应液,将反应液分离纯化,收集D‑N‑乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分,同时获得L‑草铵
膦。
能力。所述羧肽酶Ss1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示,编码基因的核苷酸序列为SEQ ID
NO.2所示。
0.075~0.085MPa条件下旋蒸除去乙酸,取浓缩物用水溶解,并用氢氧化钠水溶液调至中性
(pH为8.5),加入乙醇静置析出晶体,干燥后获得外消旋N‑乙酰草铵膦;所述乙酸与外消旋
的草铵膦重量比20~30:1(优选20:1),所述乙酸酐与外消旋的草铵膦重量比为0.7~1.5:1
(优选1:1)。
含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150rpm培养至菌体浓度OD600至0.4‑0.8,加入
终浓度为0.1mM的IPTG,28℃诱导培养12h后,4℃、8000rpm离心10min,收集湿菌体;(2)纯
酶:将步骤(1)湿菌体悬浮于20mM、pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液中,振荡摇匀后超声波破碎
(400W,1s破碎1s暂停)15min,破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片,收集上清液;将
上清液进行Ni‑NTA柱层析,先用上样平衡缓冲液平衡Ni‑NTA柱后,以1.5mL/min的速率上样
上清液,用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白,最后用洗脱缓冲液洗脱收集目标蛋
白,目标蛋白在20mM、pH 8.5的Tris‑HCl中透析,取截留液即为纯酶;所述上样平衡缓冲液
为含500mM NaCl和20mM咪唑的20mM Tris‑HCl,pH 8.5;所述洗脱缓冲液为含500mM NaCl和
500mM咪唑的20mM Tris‑HCl,pH 8.5。
为1.0BV/h,上样后用超纯水冲洗4BV,收集含有未反应底物D‑N‑乙酰草铵膦流出液,将D‑N‑
乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分;再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱,收集含有L‑草铵
膦的洗脱液,减压浓缩结晶获得L‑草铵膦。
反应液减压蒸干,获得外消旋N‑乙酰草铵膦,用于循环拆分;所述乙酸酐与D‑N‑乙酰草铵膦
质量比为0.1~3:1(优选1.7:1),乙酸与D‑N‑乙酰草铵膦质量比为10~20:1(优选10:1)。
催化剂羧肽酶光学选择性高(ee值99%),离子交换柱分离效果明显,更易得到高纯度的L‑
草铵膦(纯度为98%)。
(四)附图说明
(五)具体实施方式
缩物用水溶解,氢氧化钠水溶液调至中性(pH为8.5),加入乙醇静置析出晶体,干燥后获得
外消旋N‑乙酰草铵膦。利用液相色谱(岛津LC‑16)检测,液相谱图为图2,质谱验证确认是N‑
乙酰草铵膦(图3)。色谱柱为 C‑18column(250mm×4.6mm,5μm),流动相为10mM
磷酸溶液(pH为2.1),流速为0.75mL/min,紫外检测波长210nm,柱温35℃。
重组酶尾部(C端)含pET28b中的组氨酸标签。插入序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示,核
苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)
中用于后续重组酶的表达。
至菌体浓度OD600至0.6左右,加入终浓度为0.1mM的IPTG,28℃诱导培养12h后,4℃,8000rpm
离心10min,收集湿菌体细胞。
10min去除细胞碎片,收集上清液(粗酶液)用于后续的分离纯化。纯化柱为Ni‑NTA,装柱体
积为20mL,先用上样平衡缓冲液(20mM Tris‑HCl,500mM NaCl和20mM咪唑,pH 8.5)平衡Ni‑
NTA柱,以1.5mL/min的速率上样粗酶液,用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白,最后
用洗脱缓冲液(20mM Tris‑HCl,500mM NaCl,和500mM咪唑,pH 8.5)洗脱收集目标蛋白。酶
液在20mM,pH 8.5的Tris‑HCl中透析过夜(更换2次透析液),取最后一次透析获得的截留液
即为酶液。
200rpm条件下反应10min测定酶活力。反应完成后,取100μL反应液加5μL HCl(4M)终止反
应,后通过衍生化法分析转化率及产物ee值。色谱柱为 C‑18column(150mm×
4.6mm,5μm),流动相为甲醇:0.05mol/L乙酸铵溶液=10:90(v/v)流速为1mL/min,紫外检测
波长215nm,柱温35℃。衍生化试剂配制:分别称取等量的衍生化试剂OPA与NAC(0.015M)混
合,无水乙醇溶解,加入配制好的硼酸缓冲液(20mM pH=9.8)定容后置于4℃保存。衍生化
反应体系:200μl样品溶液(<2.0g/L)与400μl衍生化试剂(衍生化试剂过量)常温下混合,振
荡6min,L‑草铵膦的液相谱图如图4所示。
Zn 和EDTA的存在下,催化底物N‑乙酰草铵膦立体选择性水解生成L‑草铵膦。生物催化体系
组成及操作如下:10mL反应体系,体系缓冲液为Tris‑HCl(pH=8.9,50mM),金属离子及EDTA
终浓度为1mM,重组酶添加量为8.1μg/mL,底物终浓度为20g/L。45℃在水浴摇床200rpm条件
2+
下反应,采用实施例5方法测定酶活,结果如表1所示。酶活力测定表明,Co 的添加对酶活提
2+
高具有显著影响,其酶活提高了1.57倍,Zn 的添加对酶具有显著的抑制作用。
Tris‑HCl缓冲液(pH=8.9,50mM)中,加入终浓度100mM的N‑乙酰草铵膦,45℃在水浴摇床
200rpm条件下反应,30min后,反应液采用实施例5方法液相检测转化率49%,ee值99%。
2BV;(4)用2M盐酸水溶液洗柱,流速为0.5BV/h,洗2BV;(5)用去离子水洗柱,流速为1.0BV/
h,洗2BV。
1.0BV/h,上样后用超纯水冲洗4BV,收集含有未反应底物D‑N‑乙酰草铵膦流出液。再用
2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱,收集含有L‑草铵膦的洗脱液。将洗脱液在60℃,真空度
0.075~0.085MPa下,减压浓缩结晶得到纯度为98%的L‑草铵膦。
在120℃搅拌消旋12h,反应结束后,将反应液减压蒸干,获得外消旋N‑乙酰草铵膦,加水溶
解到50mL,测旋光度为‑0.002,保存用于循环拆分。
加入丙酮,发现有沉淀产生,进行液相检测,发现沉淀中含有30%~50%的D‑N‑乙酰草铵膦
和10%~20%的L‑草铵膦。