一种用于检测展青霉素的分子印迹电化学传感器及制备方法

摘要

本发明提供了用于检测展青霉素的分子印迹电化学传感器，其由玻碳电极、硫堇‑Pt纳米粒子‑氮掺杂石墨烯复合纳米材料层和分子印迹聚合物层组成。本发明提供的分子印迹电化学传感器可以有效地放大信号，获得高灵敏度，同时选择性好，回收率高，重现性好。无需依赖昂贵的大型仪器，前处理简单，且在保证结果准确性的同时，实现了快速检测，极大的节省了成本，提高了检测效率。

权利要求

1.用于检测展青霉素的分子印迹电化学传感器，其特征在于其由玻碳电极、硫堇-Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯复合纳米材料层和分子印迹聚合物层组成；

其中Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料层涂覆在玻碳电极表面，分子印迹聚合物层涂覆在Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料层表面；

其中所述的Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料是通过如下方法制备得到的：(1)将2-100mmol L-1的H2PtCl6·6H2O水溶液和1-20mmol L-1的盐酸水溶液按体积比30-

50:1制备混合液，将氮掺杂石墨烯分散在混合液中，氮掺杂石墨烯的浓度为1-50mg mL-1；然-1后加入浓度为0.01-10mol L 的抗坏血酸水溶液，抗坏血酸水溶液与前述总混合液的体积比为1:0.1-10，超声1-6h；离心，收集黑色反应产物，并用乙腈、水洗涤，烘干，制备获得Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯复合纳米材料；

(2)将上述制备的Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯复合纳米材料和硫堇以质量比0.1-10:1混合，加入二甲基甲酰胺超声1-6h；然后离心收集反应产物，用水洗涤反应物后，室温干燥，制备获得硫堇-Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯复合纳米材料；

其中所述的分子印迹聚合物层是以硫堇为聚合单体，展青霉素为模板分子，电聚合形成的分子印迹聚合物层。

2.制备权利要求1所述分子印迹电化学传感器的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)用Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料分散于水中得分散液；将分散液滴涂于玻碳电极上，室温干燥后，制备获得Th-PtNPs-NGEs/GCE电极；

(2)将Th-PtNPs-NGEs/GCE电极浸入预聚合水溶液中，采用循环伏安法在-0.4-0.4V电位范围内扫描；然后，将电极浸入0.1-10mol L-1硫酸溶液中1-100min，去除展青霉素，然后用水冲洗，室温晾干，制备获得所需的分子印迹电化学传感器；

其中预聚合水溶液中含有硫堇、展青霉素和氯铂酸，三者的浓度比例为1-10:1:0.3-4。

说明书

一种用于检测展青霉素的分子印迹电化学传感器及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子印迹电化学传感器技术领域，具体地说涉及用于检测展青霉素的分子印迹电化学传感器及其制备方法。

背景技术

[0002] 展青霉素(Patulin,PAT)又名棒曲霉素，4-羟基-4-氢-呋喃(3,2C)并吡喃-2(6H)酮 (4-hydroxy-4H-furo[3,2C]pyran-2(6H)-one)，分子式为C7H6O4，是具有神经毒性的真菌次级代谢产物，具有潜在的致畸性、致癌性和致突变性。展青霉素广泛存在于水果及其制品中，对人体健康和经济造成严重影响。国际组织和许多国家均制定了展青霉素的最大限-1量，我国也规定了苹果、山楂及其制品中展青霉素的限量不能超过50μg kg 。因此，展青霉素的检测分析方法至关重要，已成为国际研究热点。

[0003] 近年来，展青霉素的检测方法主要包括气相/液相色谱法、气相/液相色谱法串联质谱法等，这些检测手段灵敏度高，样品检测量大，也非常适合于复杂样品的分离分析；但是其仪器设备昂贵，操作过程繁琐，尤其是不利于实现现场的在线检测。电化学检测虽然可以实现快速在线检测，且操作简便、分析成本低，但是很难达到很高的灵敏度和好的选择性。

[0004] 因此有必要研发高灵敏、高特异性检测展青霉素的电化学传感器。

发明内容

[0005] 本发明首先提供了用于检测展青霉素的分子印迹电化学传感器，其由玻碳电极、硫堇-Pt 纳米粒子-氮掺杂石墨烯(Th-PtNPs-NGEs)复合纳米材料层和分子印迹聚合物层组成；

[0006] 其中Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料层涂覆在玻碳电极表面，分子印迹聚合物层涂覆在 Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料层表面；

[0007] 分子印迹聚合物层是以硫堇为聚合单体，展青霉素为模板分子，电聚合形成的分子印迹聚合物层。

[0008] 本发明还提供了上述用于检测展青霉素的分子印迹电化学传感器的制备方法，该方法包括如下步骤：

[0009] (1)用Th-PtNPs-NGEs(硫堇-Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯)复合纳米材料分散液 (Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料分散于水中所得，浓度为0.1-10mg mL-1)滴涂于玻碳电极上，室温干燥后，制备获得Th-PtNPs-NGEs/GCE电极；

[0010] (2)将Th-PtNPs-NGEs/GCE电极浸入预聚合水溶液中，采用循环伏安法在-0.4-0.4V电位范围内扫描；然后，将电极浸入0.1-10mol L-1硫酸溶液中1-100min，去除模板分子(展青霉素)，然后用二次去离子水冲洗，室温晾干，制备获得所需的分子印迹电化学传感器；

[0011] 其中预聚合水溶液中含有硫堇、展青霉素和氯铂酸(H2PtCl6·6H2O)，三者的浓度比例为 1-10:1:0.3-4，优选的浓度比例为6:1:4，进一步优选的硫堇、展青霉素和氯铂酸的浓度分别为 3mmol L-1，0.5mmol L-1和2mmol L-1；

[0012] 其中所述的Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料是通过如下方法制备得到的：

[0013] (1)将H2PtCl6·6H2O水溶液(2-100mmol L-1)和盐酸水溶液(1-20mmol L-1)按体积比30-50:1制备混合液，将氮掺杂石墨烯分散在混合液(氮掺杂石墨烯的浓度为1-50mg mL-1) 中；然后加入抗坏血酸水溶液(0.01-10mol L-1)(抗坏血酸水溶液与前述总混合液的体积比为1:0.1-10)，超声1-6h；离心，收集黑色反应产物，并用乙腈、水洗涤，烘干，制备获得 Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯复合纳米材料；

[0014] (2)将上述制备的Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯复合纳米材料与硫堇以质量比0.1-10:1混合，加入二甲基甲酰胺(DMF)中超声1-6h；然后离心收集反应产物，用水洗涤反应物后，室温干燥，制备获得Th-PtNPs-NGEs(硫堇-Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯)复合纳米材料；

[0015] 最后，将Th-PtNPs-NGEs分散于蒸馏水中，超声，配置成0.1-10mg mL-1的分散液，备用。

[0016] 本发明还提供了由上述方法制备得到的用于检测展青霉素的分子印迹电化学传感器。

[0017] 用上述分子印迹电化学传感器对溶液中展青霉素进行检测的方法包括如下步骤：

[0018] 所有的电化学实验均在CHI 660电化学分析仪(上海辰华仪器公司)上进行，三电极系统包括：本发明的分子印迹电化学传感器作为工作电极，饱和甘汞电极(SCE，江苏电化学仪器厂生产)作为参比电极，铂丝电极作为对电极；所有实验均在室温下完成；

[0019] 测定时，采用所制备的分子印迹电化学传感器，以分子印迹聚合物薄膜中的聚硫堇为电化学指示剂，通过电化学方法测定溶液中的展青霉素浓度；其中电解液为酸性磷酸缓冲溶液，扫描电位为从0.2V到-0.6V；电化学扫描测定前，分子印迹电化学传感器在待测液中的孵育时间为0.1-100min；最后通过溶液中展青霉素浓度对数(log C)与聚硫堇峰电流变化(ΔI) 之间的标准曲线计算测定待测溶液中展青霉素浓度。

[0020] 本发明的有益效果：

[0021] (1)本发明首次在Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料修饰的玻碳电极表面，以硫堇作为聚合单体，以展青霉素作为模板分子，通过电化学聚合法制备对展青霉素有选择性识别的分子印迹电化学传感器。

[0022] (2)本发明采用的PtNPs-NGEs复合纳米材料的具有大的比表面积，高的导电性，可以提高电化学传感器的灵敏度。

[0023] (3)PtNPs-NGEs复合纳米材料负载硫堇(Th)后，不仅可通过Th与展青霉素分子间作用力预吸附更多模板分子，还可以为下一步分子印迹膜的制备提供更多聚合单体和聚合位点，是制备分子印迹聚合薄膜的理想载体。

[0024] (4)本发明以展青霉素为模板分子，以硫堇为聚合单体制备分子印迹聚合物薄膜，在电化学传感器表面所形成的印迹孔穴的形状和尺寸大小与展青霉素高度匹配，可以实现展青霉素的高特异性检测。

[0025] (5)本发明以分子印迹聚合物薄膜中的聚硫堇为电化学指示剂进行展青霉素的检测，减少了检测中由于其它指示剂的加入造成的干扰。总之，该分子印迹电化学传感器制备简单，价格低廉，可实现对果汁中的展青霉素的高灵敏和高特异性检测。

附图说明

[0026] 图1为实施例1中分子印迹电化学传感器的结构示意图。

[0027] 图2为实施例1中的差分脉冲伏安响应图

[0028] 其中：(a)光的玻碳电极在空白PBS(0.1mol L-1，pH6.0)的差分脉冲伏安响应图[0029] (b)Th-Pt-NGE/GCE在空白PBS(0.1mol L-1，pH6.0)的差分脉冲伏安响应图[0030] (c)MIP/Th-Pt-NGE/GCE去除模板分子前在空白PBS(0.1mol L-1，pH6.0)的差分脉冲伏安响应图

[0031] (d)MIP/Th-Pt-NGE/GCE去除模板分子后在空白PBS(0.1mol L-1，pH6.0)的差分脉冲伏安响应图；

[0032] (e)MIP/Th-Pt-NGE/GCE去除模板分子后对1ng mL-1展青霉素溶液的差分脉冲伏安响应图。

[0033] 图3为实施例2中分子印迹电化学传感器以PBS(0.1mol L-1，pH6.0)为电解液，展青霉素在0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2ng mL-1浓度时，logC与-0.2V处峰电流变化(ΔI)之间的标准曲线图。

[0034] 图4为实施例2中分子印迹电化学传感器对0.2ng mL-1不同干扰物(5-HMF、AOH、AME、ALS、ALT、AFB1、AFB2、AFM1)的电化学响应。

具体实施方式

[0035] 下面给出的实施例为对本发明作进一步的说明。本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读本发明实例后，本领域技术人员能领会并在公开的实施中做许多改变也可获得相同或类似的结果，均属于本发明的构思和范围。更具体的说，有些试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似结果。所有类似的取代或修饰均被认为本发明的构思和范围，所有上述等价形式均属于本发明权利要求书限定的范围。

[0036] 原料来源：

[0037] 氮掺杂石墨烯(NGEs)购于南京先丰纳米材料科技有限公司；

[0038] H2PtCl6·6H2O购于上海阿达玛斯试剂有限公司；

[0039] 5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl-furfural，5-HMF)购于上海阿达玛斯试剂有限公司；

[0040] 硫堇购于伊诺凯科技有限公司；

[0041] 光的玻碳电极(直径3mm，上海辰华仪器公司)；

[0042] 抗坏血酸购买于阿法埃莎(中国)化学有限公司；

[0043] Mycosep 228多功能净化柱购买于ROMER国际贸易(北京)有限公司；

[0044] 展青霉素(patulin,PAT)、交链格孢酚(alternariol，AOH)、交链格孢酚单甲醚(alternariol methyl ether，AME)、桔青霉素(citrinin，CIT)、交链格孢烯(altenuene，ALT)、黄曲霉毒素 B1(Aflatoxin B1，AFB1)、黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2，AFB2)、黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)及赭曲霉毒素A(ochratoxin，OTA)购买于Sigma-Aldrich公司(美国)；

[0045] 实验用水为二次去离子水。

[0046] 苹果汁及葡萄汁购买于上海乐购超市。

[0047] 所有的电化学实验均在CHI 660电化学分析仪(上海辰华仪器公司)上进行。

[0048] 实施例1

[0049] 分子印迹电化学传感器的制备，主要分为以下三步：

[0050] 1.Th-PtNPs-NGEs(硫堇-Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯)复合纳米材料的制备，采用两步法合成，具体如下：

[0051] 第一步：4.5mL的H2PtCl6·6H2O水溶液(20mmol L-1)和110μL盐酸水溶液(6mol L-1) 混合，将50mg氮掺杂石墨烯分散在混合液中，超声混匀。然后加入5.0mL的抗坏血酸水溶-1液(0.1mol L )作为还原剂，在室温下超声4h，进行还原反应。反应结束后，通过离心法分离黑色反应产物，并依次用乙腈、蒸馏水反复洗涤3次，在50℃中烘干，制备获得Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯复合纳米材料，室温储存，备用。

[0052] 第二步：将5mg上述制备的Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯复合纳米材料及2.5mg硫堇加入 5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，超声混合4h。然后以2000转/分钟转速离心，去除反应液收集反应产物，用蒸馏水反复洗涤几次反应物后，室温干燥，制备获得硫堇-Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯(Th-PtNPs-NGEs)复合纳米材料。最后，将Th-PtNPs-NGEs分散于蒸馏水中，超声，配置成5mg mL-1的Th-PtNPs-NGEs均匀分散液。

[0053] 2.Th-PtNPs-NGEs修饰玻碳电极(GCE)的制备

[0054] 将光的玻碳电极采用0.5μm氧化铝粉在麂皮上抛光成镜面后，采用超纯水冲洗。然后将 6μL的5mg mL-1的Th-PtNPs-NGEs均匀分散液滴涂于干净玻碳电极上，室温干燥后，制备获得Th-PtNPs-NGEs/GCE，备用。

[0055] 3.分子印迹聚合物/硫堇-Pt纳米粒子-N化石墨烯/玻碳电极(MIP/Th-PtNPs-NGEs/GCE)的制备

[0056] 制备预聚合水溶液：预聚合水溶液中硫堇的浓度为3mmol L-1，展青霉素(PAT)的浓度为0.5mmol L-1，H2PtCl6·6H2O浓度为2mmol L-1。

[0057] 将Th-PtNPs-NGEs/GCE浸入预聚合水溶液中，采用循环伏安法，在-0.4-0.4V电位范围内以50mV s-1速率扫描15圈，使硫堇发生电聚合反应，在电极表面形成展青霉素印迹的聚合物薄膜。然后，将电极浸入2mol L-1H2SO4中10min去除模板分子PAT，然后用二次去离子水冲洗，室温晾干，制备获得分子印迹聚合物/硫堇-Pt纳米粒子-N化石墨烯/玻碳电极 (MIP/Th-PtNPs-NGEs/GCE)。

[0058] 实验结果：

[0059] (1)分子印迹电化学传感器的结构示意图见图1，该传感器主要有三部分组成，包括玻碳电极，在玻碳电极上负载的硫堇-Pt纳米粒子-氮掺杂石墨烯(Th-PtNPs-NGEs)复合纳米材料层，及在上述Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料层上以硫堇为聚合单体，展青霉素为模板分子，电聚合形成的分子印迹聚合物层。

[0060] (2)从图2可以看出，与光的玻碳电极相比，Th-Pt-NGE/GCE在-0.2V处出现了明显的峰电流，这是Th-Pt-NGE复合材料上中硫堇的还原峰。然后，将Th-PtNPs-NGEs/GCE浸入含有3 mmol L-1硫堇、0.5mmol L-1展青霉素及2mmol L-1H2PtCl6·6H2O的预聚合溶液中，采用-1循环伏安法在-0.4-0.4V电位范围内，以50mV s 速率扫描15圈后，形成MIP/Th-Pt-NGE/GCE。发现MIP/Th-Pt-NGE/GCE无论在去除模板分子之前还是之后，在-0.2V处峰电流均明显高于 Th-PtNPs-NGEs/GCE，这是由于电聚合过程中，在Th-PtNPs-NGEs/GCE电极表面形成了Pt 纳米粒子掺杂的聚硫堇分子印迹膜，Pt纳米粒子可以增加电极的导电性，同时聚硫堇的形成增加了-0.2V处的电化学响应信号。此外，MIP/Th-Pt-NGE/GCE在去除模板分子后，其峰电流选高于去除模板分子前，这是由于去除模板分子后，在MIP中形成很多与展青霉素分子匹配的孔穴，可以增加电极的导电性和电子的传递速率。将去除模板分子后的 MIP/Th-Pt-NGE/GCE浸入1ng mL-1展青霉素溶液中孵育3min后，峰电流下降，这是由于 MIP/Th-Pt-NGE/GCE结合了展青霉素，阻碍了电子的传递造成。

[0061] 实施例2

[0062] 展青霉素分子印迹电化学传感器测定样品中的展青霉素

[0063] 所有的电化学实验均在CHI 660电化学分析仪(上海辰华仪器公司)上进行，三电极系统包括：实施例1中制备得到的分子印迹电化学传感器作为工作电极，饱和甘汞电极(SCE，江苏电化学仪器厂生产)作为参比电极，铂丝电极作为对电极。

[0064] 所有实验均在室温下完成。

[0065] 采用差分脉冲伏安法(DPV)进行测试，电解液均为0.1mol L-1磷酸缓冲溶液(PBS， pH 6.0)，DPV扫描电位为从0.2V到-0.6V。最后通过溶液中展青霉素浓度对数(log C)与 -0.2V处峰电流变化(ΔI)之间的标准曲线计算测定待测溶液中展青霉素浓度。

[0066] 苹果汁和葡萄汁样品不需要经过任何前处理，直接加入电解液中进行测定。

[0067] 实验结果：

[0068] (1)检测方法用于实际样品的检测：20份葡萄汁和苹果汁的检测，其中有1份葡萄汁和1份苹果汁都检出了展青霉素，其含量分别为10.17ng mL-1和18.48ng mL-1，其余均未检出。采用Mycosep 228多功能净化柱对果汁样品进行前处理后，参考文献报道的方法(Food chemistry,2012,60,8233-8247)，采用UPLC-MS/MS方法检测该阳性样本，测定得到其含量分别为10.23ng mL-1和18.01ng mL-1，与本实施例的方法测定的结果基本一致，表明所发明的方法准确可靠。

[0069] (2)检测方法的线性与灵敏度验证：采用差分脉冲伏安法(DPV)对不同浓度展青霉素的电化学响应进行了研究。

[0070] 在0.1mol L-1磷酸缓冲溶液(PBS，pH 6.0)中，添加不同浓度的展青霉素，然后进行检测，结果如附图3所示，随着展青霉素浓度的不断增加，在0.002ng mL-1-2ng mL-1浓度范围内，其浓度对数(log C)与-0.2V处峰电流变化(ΔI)呈线性关系，标准曲线方程为ΔI(μA) ＝5.577Log(C/ng mL-1)-1.38，线性相关系数为0.995，该方法所得最低检出限为0.0007ng mL-1(S/N＝3)，表明实施例1的分子印迹电化学传感器具有较高的灵敏度，可以用于样品中痕量展青霉素的检测。

[0071] (3)分子印迹电化学传感器的选择性验证：为了考察所发明分子印迹电化学传感-1 -1器的选择性，在0.1mol L 磷酸缓冲溶液(PBS，pH 6.0)中，添加0.2ng mL 展青霉素或者其干扰物，比较了实施例1的分子印迹电化学传感器对0.2ng mL-1展青霉素及其干扰物(5-HMF， AOH，AME，CIT，ALT，AFB1，AFB2，AFM1和OTA)的电化学相应信号变化，以ΔIP/IP0表示，其中IP0为传感器在空白溶液中峰电流值，ΔIP为在溶液中加入一定浓度展青霉素或者干扰物时峰电流变化值。ΔIP/IP0越大，表示干扰性越大。

[0072] 如附图4所示，加入0.2ng mL-1展青霉素时，ΔIP/IP0为0.065。而加入其它干扰物时，ΔIP/IP0变化较小，其中ALT及AFB1引起的变化可忽略不计。以上结果表明所发明的分子印迹电化学传感器具有良好的选择性。这是由于当模板分子印迹到MIP/Th-Pt-NGE/GCE表面后，模板分子特有的结构决定了印迹膜表面所形成的的印迹孔穴的形状和尺寸大小，以展青霉素为模板分子制备的分子印迹聚合物只能较好的选择性识别溶液中的展青霉素分子，对其它干扰物响应较小。

[0073] (4)分子印迹电化学传感器的稳定性验证：根据上述检测方法，同一分子印迹电化学传感器在工作液中连续扫描25圈，仅有少于1％的信号降低；

[0074] (5)分子印迹电化学传感器的重现性验证：用实施例1同样的方法制造5根分子印-1迹电化学传感器，检测同一批的含0.2ng mL 展青霉素的样品，结果的相对标准偏差(RSD)为 4.68％；

[0075] (6)检测方法的回收率验证：采用基质加标法对方法的回收率进行考察，取空白苹果汁和葡萄汁样本，分别添加低、中、高三个浓度水平(0.005ng mL-1，0.05ng mL-1和0.5ng -1mL ) 的展青霉素标准品，回收率结果为91.0-109.6％之间。

[0076] 综上可见，实施例1中制备的，以硫堇为聚合单体，以展青霉素为模板分子，在 Th-PtNPs-NGEs复合纳米材料修饰的玻碳电极表面，电聚合形成的展青霉素印迹的分子印迹电化学传感器，可以有效地放大信号，获得高灵敏度，同时选择性好，回收率高，重现性好。与现有检测方法相比，无需依赖昂贵的大型仪器，前处理简单，且在保证结果准确性的同时，实现了快速检测，极大的节省了成本，提高了检测效率。

[0077] 本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改都属于本发明的保护范围。