小麦磷脂在烘烤应用中的改善的酶促修饰

摘要

本发明涉及一种制作面团的方法，所述方法包括混合面团组分、在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶。还教导了一种食物酶组合物，所述食物酶组合物包含：能够在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶；在sn1位置处作用于极性脂质的酶。

权利要求

1.一种制作面团的方法，所述方法包括混合面团组分、在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的如SEQ ID NO:4所示的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的如SEQ ID NO:1所示的磷脂酶A1酶；

其中，将磷脂酶A2酶和磷脂酶A1酶以有效量混合到面团组分中，相对于除了未添加要求保护的酶以外在相同条件下制作的烘烤产品或蒸制产品或煮制产品或油炸产品，所述有效量导致由所述面团生产的烘烤产品或蒸制产品或煮制产品或油炸产品的比容增加至少

10％。

2.在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的如SEQ ID NO:4所示的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的如SEQ ID NO:1所示的磷脂酶A1酶在制造面团或烘烤产品中的用途，用于改善烘烤产品的比容；

其中，将磷脂酶A2酶和磷脂酶A1酶以有效量混合到面团组分中，相对于除了未添加要求保护的酶以外在相同条件下制作的烘烤产品或蒸制产品或煮制产品或油炸产品，所述有效量导致由所述面团生产的烘烤产品或蒸制产品或煮制产品或油炸产品的比容增加至少

10％。

3.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的磷脂酶A1酶被同时或顺序地混合或使用。

4.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述磷脂酶A2酶是在面团状态下将N‑酰基磷脂酰乙醇胺转化为N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺的酶，其中所产生的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺的脂肪酸部分含有14‑20个碳原子。

5.根据权利要求4所述的方法或用途，其中所述脂肪酸部分是饱和脂肪酸部分。

6.根据权利要求5所述的方法或用途，其中所述脂肪酸部分是饱和脂肪酸部分并且包含16个碳原子。

7.根据权利要求1所述的方法或根据2所述的用途，其中所述方法或用途进一步包含添加卵磷脂。

8.根据权利要求7所述的方法或用途，其中所述卵磷脂是基于大豆的卵磷脂。

9.根据权利要求7所述的方法或用途，其中所述卵磷脂是酶修饰的卵磷脂。

10.根据权利要求9所述的用途或方法，其中所述卵磷脂由具有磷脂酶A2活性的酶进行酶修饰。

11.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述方法或用途进一步包括对面团进行烹制来产生产品。

12.根据权利要求11所述的用途或方法，其中所述对面团进行烹制是对面团进行烘烤或蒸、煮或油炸。

13.根据权利要求11所述的用途或方法，其中所述产品是烘烤产品或蒸制产品或煮制产品或油炸产品。

14.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述面团是选自由以下组成的组的面团：面包面团、意大利面食面团、面条面团、蛋糕面团、糕点面团或面糊。

15.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述磷脂酶A2酶以

50‑7500ePLU/kg面粉的浓度存在。

16.根据权利要求15所述的方法或用途，其中所述磷脂酶A2酶以150‑2000ePLU/kg面粉的浓度存在。

17.根据权利要求16所述的方法或用途，其中所述磷脂酶A2酶以500‑1000ePLU/kg面粉的浓度存在。

18.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述在sn1位置处作用于极性脂质的磷脂酶A1酶以100至2000TIPU/kg面粉的浓度存在。

19.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中将另外的酶添加到所述组合物或面团中。

20.根据权利要求19所述的方法或用途，其中所述另外的酶是选自由以下组成的组中的一种或多种：脂肪酶、淀粉降解酶、半纤维素酶、纤维素酶、氧化还原酶、脂质酰基转移酶、脱支酶、乳糖酶和蛋白酶。

21.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中与不添加酶的面团相比，所述面团中C16:0N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺的量增加至少1.5倍。

22.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中在中种法中，磷脂酶A2酶被添加到中种面团(sponge)中并且所述在sn1位置处作用于极性脂质的磷脂酶A1酶被添加到面团中。

说明书

小麦磷脂在烘烤应用中的改善的酶促修饰

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请是国际PCT申请，要求于2016年4月7日提交的美国临时申请号62/319,399和于2015年12月22日提交的英国专利申请号GB 1522681.4的权益，所有这些申请通过援引以其全文并入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及新型酶组合及其在制造面团或烘烤产品中的用途。本发明进一步涉及使用新型酶组合制作面团或烘烤产品的方法。

背景技术

[0004] 脂质占小麦粉的大约2％，并且这些脂质被认为对小麦粉的烘烤质量非常重要。小麦粉脂质可分为非极性脂质和极性脂质，并且已经表明改善的烘烤和面包特性主要归因于极性脂质。

[0005] 在过去的几十年中，对稳定和更高质量烘烤食品的需求的增加引起大范围的添加剂的应用。在烘烤工业中，已知用天然极性脂质(例如卵磷脂)或其他酶(例如脂肪酶)补充内源性脂质。

[0006] 小麦粉中最丰富的磷脂之一是N‑酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)，其通过酶水解转化为N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(NALPE)。NALPE的进一步水解产生N‑酰基甘油磷酸‑乙醇胺(NAGPE)。

发明内容

[0007] 因此，本发明的第一方面提供了一种食物酶组合物，该食物酶组合物包含：在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶；和在sn1位置处作用于极性脂质的酶。

[0008] 在一个另外的方面，提供了一种制作面团的方法，所述方法包括混合面团组分、在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶。

[0009] 在又另外的方面，本发明提供了在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶在制造面团或烘烤产品中的用途，用于改善烘烤产品的比容；改善面团性质(例如面团延展(dough development)；面团拉伸性)；改善烘烤产品的外皮脆度；改善面包心结构(例如改善烘烤产品的面包心孔径或改善烘烤产品的面包心孔均一性)；改善柔软性(例如改善烘烤产品的柔软性)；改善烘烤产品的烤焙弹性；增加面团和/或烘烤产品中的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(优选增加具有含有14‑20个碳原子的脂肪酸部分的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺、优选增加具有含有14‑20个碳原子的饱和脂肪酸部分的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺)；增加面团和/或烘烤产品中的溶血磷脂；增加面团和/或烘烤产品中的二半乳糖甘油单酯和/或单半乳糖甘油单酯；增加面团和/或烘烤产品中的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺，和增加溶血磷脂和/或二半乳糖甘油单酯和/或单半乳糖甘油单酯。

[0010] 在又另外的方面，提供了一种套装件(kit)，该套装件包含能够在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶；在sn1位置处作用于极性脂质的酶；以及一组使用说明书。

[0011] 本发明又进一步提供了通过根据本发明的方法可获得(优选通过根据本发明的方法获得)的面团或通过根据本发明的方法可获得(优选通过根据本发明的方法获得)的烘烤产品。

[0012] 生物学序列简述

[0013] 以下序列遵循37C.F.R.§§1.821‑1.825(“包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求‑序列规则”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和欧洲专利公约(EPC)以及专利合作条约(PCT)法规第5.2和49.5(a‑bis)条，以及行政章程第208款和附件C关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中所述的条例。

[0014] SEQ ID NO:1是 4080和 4090中的、在sn1位置处作用于极性脂质的酶的氨基酸序列(与来自美国专利8,012,732的SEQ ID NO:6相同；特此通过援引并入本文)。已知该酶具有半乳糖脂酶和磷脂酶活性。

[0015] SEQ ID NO:2是源自杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(参见美国专利9,175,271)。

[0016] SEQ ID NO:3是在 A2中发现的在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶的氨基酸序列。

[0017] SEQ ID NO:4是在sn2位置处作用于NAPE(N‑酰基磷脂酰乙醇胺)的磷脂酶A2酶(CRC08335)的氨基酸序列。

[0018] SEQ ID NO:5是在sn2位置处作用于NAPE(N‑酰基磷脂酰乙醇胺)的磷脂酶A2酶(CRC08335)的核苷酸序列。

[0019] SEQ ID NO:6是CRC08335的N端预测的信号肽序列。

附图说明

[0020] 图1显示了来自Pomeranz,Y.于Modern Cereal Science and Technology[现代谷物科学与技术]((1987)VCH Publishers[VCH出版社],New York[纽约],NY)中的面粉(特别是小麦粉)中发现的极性和非极性脂质的列表。

[0021] 图2显示了当在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶(SEQ ID NO:3)( )；和在sn1位置处作用于极性脂质的酶( 4090)组
合用于烘烤模制白面包(white pan bread)时，观察到的柔软性效应。

[0022] 图3显示了当在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶()；和在sn1位置处作用于极性脂质的酶( 4090)组合用
于烘烤100％全小麦面包时，观察到的柔软性效应。

[0023] 图4显示了 4080和 4090(均可商购自杜邦营养生物科学有限公司(DuPont Nutrition Biosciences ApS))的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。

[0024] 图5显示了CRC08335的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。

[0025] 图6显示了CRC08335的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。

[0026] 图7显示了携带CRC08335的合成基因的pZKY512‑1的质粒图谱。

[0027] 缩写

[0028] NAPE‑N‑酰基磷脂酰乙醇胺

[0029] NALPE‑N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺

[0030] NAGPE‑N‑酰基甘油磷酸乙醇胺

[0031] DGDG‑二半乳糖甘油二酯

[0032] DGMG‑二半乳糖甘油单酯

[0033] MGDG‑单半乳糖甘油二酯

[0034] MGMG‑单半乳糖甘油单酯

[0035] PC‑磷脂酰胆碱

[0036] PLA‑磷脂酶A

[0037] 发明详述

[0038] 本发明的重要发现是通过使用在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶的组合可以实现食料(例如面团和/或烘烤产品)中的有利特性。

[0039] 诸位发明人首次显示了能够在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶的组合在食料(例如面团或烘烤产品)中提供的协同效应。

[0040] 基于这些发现，提供了能够在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶；和在sn1位置处作用于极性脂质的酶在制备面团或从面团可获得的产品中的方法和用途。本发明又进一步提供了一种食物酶组合物，该食物酶组合物包含能够在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶；和在sn1位置处作用于极性脂质的酶。

[0041] 本发明涉及在面团和从面团可获得的食物产品中以特异性方式溶解特异性极性脂质。

[0042] 包含在大多数谷物粉中的极性脂质包括磷脂和半乳糖脂。

[0043] 面粉(特别是小麦粉)中的大量磷脂可以是N‑酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)。Schafferczyk等人(J.of Agricultural and Food Chemistry[农业和食品化学杂志](2014)62:8229‑8237)教导了与0.02％磷脂酰胆碱(PC)相比，小麦粉平均含有0.1％的NAPE。

[0044] 面粉(特别是小麦粉)可以包含半乳糖脂。半乳糖脂(例如二半乳糖甘油二酯(DGDG)或单半乳糖甘油二酯(MGDG))是面粉(特别是小麦粉)中天然存在的(或内源性)脂质组分。

[0045] 优选地，本发明中使用的酶作用于其的磷脂和/或半乳糖脂是面粉中天然存在的磷脂和/或半乳糖脂。

[0046] 根据本发明在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶是在本文教导的“用于确定磷脂酶活性和对NAPE的位置特异性的测定”中具有PLA2活性的酶。

[0047] 用于确定磷脂酶活性和对NAPE的位置特异性的测定：

[0048] 底物：将0.6％16:0‑18:1 NAPE(N‑亚油酰基‑(1‑棕榈酰基‑2‑油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺)(根据要求获得自Avanti公司(Avanti)或根据J.L.Newman等人，Chemistry TMand Physics of Lipids[脂质的化学和物理学](1986)42:240‑260产生)，0.4％TRITON ‑X 
100(西格玛‑奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，圣路易斯，密苏里州；X‑100)和5mM CaCl2溶于0.05M HEPES缓冲液(pH 7.0)中。对于胰酶，还添加了0.003M脱氧胆酸盐。

[0049] 测定程序：

[0050] 将2mL底物在30℃下孵育并添加在0.05M HEPES缓冲液中的0.1mL酶溶液(大约5TIPU/mL或对应于在10分钟反应后消耗2％‑5％底物的酶量)，并在30℃下在磁力搅拌下孵育10分钟。添加40μL 4M HCl来终止反应并使游离脂肪酸质子化。添加1mL 99％乙醇并在涡旋混合器上混合。添加含有0.5mg C17:0脂肪酸(十七烷酸)的5mL MTBE(甲基叔丁基醚)。将样品再次在涡旋混合器上混合5秒，并在Rotamix上以25rpm提取30min。将样品在1520g下离心10min。

[0051] 将一个500mg胺(NH2)‑Bond  Elut  SPE柱(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，圣克拉拉，加利福尼亚州)置于Bond Elut真空系统上。将该柱用8mL石油醚调节。将来自提取的MTBE相施用到柱上并用以下洗脱：

[0052] 1.馏分8mL溶剂A：MTBE：2‑丙醇，2:1

[0053] 2.馏分8mL溶剂B：丙酮：甲酸100:2

[0054] 将溶剂以大约0.25mL/min洗脱。

[0055] 将收集的脂肪酸馏分(馏分2)蒸发至干，并通过GLC分析脂肪酸含量。

[0056] 基于内标C17:0脂肪酸，确定C16:0和C18:1脂肪酸的量。

[0057] 将对NAPE的酶活性计算为测定条件下产生的μmol脂肪酸/分钟

[0058]

[0059] 其中

[0060] A＝％C16:0脂肪酸+％C18:1脂肪酸

[0061] 2＝mL底物

[0062] 1000000＝mol转化为μmol

[0063] D＝酶稀释因子

[0064] MV＝产生的C16:0和C18:1脂肪酸的平均分子量

[0065] 10＝分钟反应时间

[0066] 0.1＝添加到测定中的mL酶

[0067] 如下计算酶特异性：

[0068]

[0069]

[0070] 在sn2位置处优先裂解(例如水解)NAPE的磷脂酶A2酶将是在本文教导的“用于确定磷脂酶活性和对NAPE的位置特异性的测定”中对NAPE具有至少高50％的相对PLA2活性的酶。具有高50％相对PLA2活性的酶意指该酶具有小于25％的sn1活性和大于75％的sn2活性。优选地，在sn2位置处优先裂解(例如水解)NAPE的磷脂酶A2酶将是在本文教导的“用于确定磷脂酶活性和对NAPE的位置特异性的测定”中，与相对PLA1活性相比，具有至少高10％的相对PLA2活性的酶。

[0071] 优选地，为了确定在sn2位置处优先裂解(例如水解)NAPE的磷脂酶A2酶，使用本文教导的“用于确定磷脂酶活性和对NAPE的位置特异性的测定”。然而，在一些实施例中，这可以使用来自英杰公司(Invitrogen)目录号E10217的EnzChek磷脂酶A2测定套装件，任选地与面团测试(其分析酶是否通过增加面团中NALPE的形成来降低NAPE)一起来确定。

[0072] 关于在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶的术语“特异性”意指该酶将仅催化一种特定的反应，例如，在sn2位置处裂解(或水解)NAPE以产生1‑NALPE。在sn2位置处特异性裂解(例如水解)NAPE的磷脂酶A2酶将是在本文教导的“用于确定磷脂酶活性和对NAPE的位置特异性的测定”中与PLA1活性相比，具有至少高80％的相对PLA2活性的酶。在一个实施例中，根据本发明的在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶具有以下酶活性中的一种或多种：磷脂酶A2活性(例如E.C.3.1.1.4)或脂质酰基转移酶活性(例如E.C.2.3.1.43)。

[0073] 根据另一个实施例，根据本发明的在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶是能够在面团状态下将NAPE转化为1‑NALPE的酶。

[0074] 根据另一个实施例，根据本发明的在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶是将NAPE转化为1‑NALPE的酶，其中所产生的NALPE的脂肪酸部分含有14‑20个碳原子。

[0075] 在一个实施例中，根据本发明的在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶是将NAPE转化为1‑NALPE的酶，其中所产生的NALPE的脂肪酸部分是饱和的并且含有14‑20个碳原子。

[0076] 在一个另外的实施例中，根据本发明的在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶是将NAPE转化为1‑NALPE的磷脂酶A2酶，其中所产生的NALPE的脂肪酸部分是饱和的并且含有16个碳原子(C16:0)。将NAPE转化成1‑NALPE的磷脂酶A2酶(其中所产生的NALPE的脂肪酸部分是饱和的并且含有16个碳原子)可以使用本文教导的“用于确定磷脂酶活性和对NAPE的位置特异性的测定”和/或使用本文教导的“用于分析从面团提取的磷脂的HPLC/MS方法”来确定。

[0077] 在一个实施例中，与不添加酶的面团相比，根据本发明的酶组合的使用导致面团中的C16:0NALPE的量增加了至少1.5倍。例如，面团中C16:0NALPE的量可以增加至少2.0倍，优选至少3.0倍。

[0078] 在一个实施例中，与不添加酶的面团相比，根据本发明的酶组合的使用导致面团中的C16:0NALPE的量增加约1.5倍至约4.0倍。

[0079] 面团状态是本领域技术人员熟知的。这些可以包括面团组分混合期间或面团静置和储存期间的状态。合适地面团状态包括面团混合、面团静置、面团称量(scaling)和模制(moulding)、以及面团发酵。

[0080] 根据本发明的另一方面，在sn2位置处作用于NAPE的要求保护的磷脂酶A2酶不能或基本上不能作用于N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(NALPE)。

[0081] 如本文所使用，术语“基本上不能作用于N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺”意指在“用于确定磷脂酶活性和对NAPE的位置特异性的测定”以及在“用于确定溶血磷脂酶对N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(NALPE)的活性的测定”两者中测试的相同剂量中的酶，相比于对NAPE的活性，对NALPE的活性小于20％。更优选地，基本上不能作用于N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺的酶与对NAPE的活性相比，对NALPE具有小于10％的活性，更合适地对NALPE具有小于5％的活性，甚至更优选地具有小于1％的NALPE活性。脂肪酸部分饱和度和长度的确定可以通过本领域已知的方法进行。作为非限制性实例，气相层析法(GC)或液相层析法‑质谱法(HPLC/MS)如本文教导。

[0082] 用于确定溶血磷脂酶对N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(NALPE)活性的测定：

[0083] 底物：将0.6％18:1 NALPE(N‑亚油酰基‑(1‑油酰基‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺)(根据要求获得自Avanti或根据“Synthesis of N‑acyl lysophosphatidylethanolamine(NALPE)TM[N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(NALPE)的合成]”生产)，0.4％TRITON ‑X 100(西格玛公司(Sigma)，X‑100)和5mM CaCl2溶于0.05M HEPES缓冲液(pH 7.0)中。对于胰酶，还添加了
0.003M脱氧胆酸盐。

[0084] 测定程序：

[0085] 将2mL底物在30℃下孵育并添加在0.05M HEPES缓冲液中的0.1mL酶溶液(大约5TIPU/mL或对应于在10分钟反应后消耗2％‑5％底物的酶量)，并在磁力搅拌下孵育10分钟。添加40μL 4M HCl来终止反应并使游离脂肪酸质子化。添加1mL 99％乙醇并在涡旋混合器上混合。添加含有0.5mg C17:0脂肪酸(十七烷酸)的5mL MTBE(甲基叔丁基醚)。将样品再次在涡旋混合器上混合5秒，并在Rotamix上以25rpm提取30min。将样品在1520g下离心
10min。将一个500mg胺(NH2)‑Bond Elut SPE柱(安捷伦公司(Agilent))置于Bond Elut真空系统上。将该柱用8mL石油醚调节。将来自提取的MTBE相施用到柱上并用以下洗脱：

[0086] 1.馏分8mL溶剂A：MTBE：2‑丙醇，2:1

[0087] 2.馏分8mL溶剂B：丙酮：甲酸，100:2

[0088] 将溶剂用大约0.25mL/min洗脱。

[0089] 将收集的脂肪酸馏分(馏分2)蒸发至干，并通过GLC分析脂肪酸含量。

[0090] 基于内标C17:0脂肪酸，确定C18:1脂肪酸的量。

[0091] 将对NALPE的酶活性计算为测定条件下每分钟产生的μmol脂肪酸

[0092]

[0093] 其中

[0094] A＝％C18:1脂肪酸

[0095] 2＝mL底物

[0096] 1000000＝mol转化为μmol

[0097] D＝酶稀释因子

[0098] MV＝C18:1脂肪酸的分子量

[0099] 10＝分钟反应时间

[0100] 0.1＝添加到测定中的mL酶

[0101] N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(NALPE)的合成

[0102] 将1.5克1‑油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油基‑3‑磷酸乙醇胺(来自Avanti的18:1 Lyso PE)溶于50mL氯仿中，并添加550μL三乙醇胺并在氮气下覆盖。将溶液在冰浴上冷却并在搅拌期间逐滴添加1.9g亚油酸酐。在氮气覆盖下，将该溶液在22℃下反应20小时。将粗反应产物通过在真空下蒸发氯仿来浓缩并通过柱层析法纯化。将反应产物N‑亚油酰基‑1‑油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇酰胺(NALPE)分离，并通过NMR和HPLC/MS证实结构。

[0103] 在一个实施例中，根据本发明的在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶可以是来自生物催化剂公司(Biocatalysts)的 油、胰PLA2、Lipomod 699L。

[0104] 根据本发明的在sn1位置处作用于极性脂质的酶是如使用以下测定中的一种或两种来确定的、在sn1位置处作用于极性脂质的酶：“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质的酶(磷脂酶)的测定”和/或“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质(半乳糖脂；MGDG)的酶的测定”。

[0105] 用于确定在sn1位置处作用于极性脂质的酶(磷脂酶)的测定：

[0106] 使用PED‑A1(N‑((6‑(2,4‑DNP)氨基)己酰基)‑1‑( FL C5)‑2‑己基‑Sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(来自赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)的A10070)作为底物来测量磷脂酶A1活性(PLA1)。

[0107] 底物对PLA1具有特异性，并且是具有在sn1位置处的 FL染料标记的酰基链和二硝基苯基淬灭剂修饰的头部基团的染料标记的甘油磷酸乙醇胺。通过在sn1位置处切割 FL戊酸取代基和在sn2位置处采用酶抗性醚键来降低淬灭效率。结果是
在515nm处检测到荧光发射的PLA1依赖性增加。

[0108] 程序：

[0109] 通过将在乙醇中的30μL 10mM二油酰磷脂酰胆碱、在乙醇中的30μL 10mM二油酰磷脂酰甘油和在DMSO中的30μL 2mM PED‑A1混合来制备“脂质混合物”。

[0110] 向20mL烧杯中添加5mL缓冲液50mM Tris HCl、0.14mM NaCl和2mM CaCl2(pH 7.4)。用磁力搅拌器搅动以形成涡流。在1分钟内，将50μL脂质混合物用配备有窄孔口凝胶装载端头的100μL移液管缓慢添加到旋涡侧，以形成底物脂质体混合物。

[0111] 向微量滴定板孔中添加50μL酶样品(或标准品或对照)和50μL底物脂质体混合物。在室温下孵育30分钟，同时避光。使用具有在470nm处激发和515nm处发射的微量滴定板读数器来测量荧光。

[0112] 基于许多不同酶浓度(从0至10U/mL)的标准PLA1溶液构建校准曲线。酶标准是已知活性的PLA1(来自西格玛公司的L3295)。基于标准溶液的荧光测量，构建荧光强度作为酶浓度U/mL的函数的校准曲线。基于标准曲线，测量未知样品的活性(U/mL)。

[0113] 用于确定在sn1位置处作用于极性脂质(半乳糖脂；MGDG)的酶的测定

[0114] 底物：将0.6％1‑亚油基‑2‑油烯基‑3‑O‑(‑D‑半乳糖吡喃基)‑sn甘油(C18:2，C18:TM
1MGDG)0.4％TRITON ‑X 100(西格玛公司，X‑100)和5mM CaCl2溶于0.05M HEPES缓冲液(pH 
7)中。对于胰酶，还添加了0.003M脱氧胆酸盐。

[0115] 测定程序：

[0116] 将2mL底物在30℃下孵育并添加在0.05M HEPES缓冲液中的0.1mL酶溶液(大约2‑5TIPU/mL或对应于10min反应消耗的大约5％底物的酶)，并在30℃下磁力搅拌下孵育10分钟。添加40μL 4M HCl来终止反应并使游离脂肪酸质子化。添加1mL 99％乙醇并在涡旋混合器上混合。添加含有0.5mg C17:0脂肪酸的5mL MTBE(甲基叔丁基醚)。将样品再次在Wortex混合器上混合5秒，并在Rotamix上以25rpm提取30min。将样品在1520g下离心10min。

[0117] 将一个500mg胺(NH2)‑Bond Elut SPE柱(安捷伦公司(Agilent))置于Bond Elut真空系统上。将该柱用8mL石油醚调节。将来自提取的MTBE相施用到柱上并用以下洗脱：

[0118] 1.馏分8mL溶剂A：MTBE：2‑丙醇，2:1

[0119] 2.馏分8mL溶剂B：丙酮：甲酸，100:2

[0120] 将溶剂用大约0.25mL/min洗脱。

[0121] 将收集的脂肪酸馏分(馏分2)蒸发至干，并通过GLC分析脂肪酸。基于内标C17:0脂肪酸，确定C18:2和C18:1脂肪酸的量。

[0122] 将酶活性计算为测定条件下每分钟产生的μmol脂肪酸

[0123]

[0124] 其中

[0125] A＝％C18:2脂肪酸+％C18:1脂肪酸

[0126] 2＝mL底物

[0127] 1000000＝mol转化为μmol

[0128] D＝酶稀释因子

[0129] MV＝产生的C18:2和C18:1脂肪酸的平均分子量

[0130] 10＝分钟反应时间

[0131] 0.1＝添加到测定中的mL酶

[0132] 酶特异性计算如下：

[0133]

[0134]

[0135] 1‑亚油基‑2‑油烯基‑3‑O‑(‑D‑半乳糖吡喃基)‑sn甘油(C18:2，C18:1MGDG)的合成。

[0136] 1‑亚油基‑2‑油烯基‑3‑O‑(‑D‑半乳糖吡喃基)‑sn甘油(C18:2，C18:1 MGDG)[0137] 根据Selmair和Koehler(J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志](2008)56:6691‑6700)合成1‑单亚油基‑2‑羟基‑3‑O‑(‑D‑2′,3′,4′,6′‑四‑O‑乙酰基半乳糖吡喃基)[0138] 将1‑单亚油基‑2‑羟基‑3‑O‑(_‑D‑2′,3′,4′,6′‑四‑O‑乙酰基半乳糖吡喃基)‑sn‑甘油分离，并通过柱层析法纯化至超过99％纯度。

[0139] 根据Gaffney和Reese的方法(J.Chem.Soc.[化学学会期刊],Perkin Trans.[珀金学报](2001)1:192‑205)使用油酸作为酰基供体来进行1‑单亚油基‑2‑羟基‑3‑O‑(‑D‑2′,3′,4′,6′‑四‑O‑乙酰基半乳糖吡喃基)‑sn‑甘油在sn2位置处的酰化。

[0140] 用甲醇中的肼进行1‑亚油基‑2‑油烯基‑3‑O‑(‑D‑2′,3′,4′,6′‑四‑O‑乙酰基半乳糖吡喃基)‑sn‑甘油的脱酰化，然后通过柱层析法纯化，并且通过质谱法和NMR分析来证实结构。

[0141] 在一个实施例中，根据本发明的在sn1位置处作用于极性脂质的酶是在题为“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质的酶(磷脂酶)的测定”的测定中与相对sn2活性相比，具有至少高20％的相对sn1活性的酶。在一个实施例中，根据本发明的在sn1位置处作用于极性脂质的酶是在题为“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质的酶(磷脂酶)的测定”的测定中与相对sn2活性相比，具有至少高50％的相对sn1活性的酶。

[0142] 在一个实施例中，根据本发明的在sn1位置处作用于极性脂质的酶是在题为“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质的酶(MGDG)的测定”的测定中与相对sn2活性相比，具有至少高20％的相对sn1活性的酶。在一个实施例中，根据本发明的在sn1位置处作用于极性脂质的酶是在题为“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质的酶(MGDG)的测定”的测定中与相对sn2活性相比，具有至少高50％的相对sn1活性的酶。

[0143] 在一个实施例中，根据本发明的在sn1位置处作用于极性脂质的酶是在面团中可以使用面团脂质的HPTLC分析来水解至少10％的DGDG的酶。

[0144] 在本发明的一个实施例中，在sn1位置处作用于极性脂质的酶是具有磷脂酶活性、半乳糖脂酶活性或其组合的酶。

[0145] 术语“极性脂质”意指在面粉(优选小麦粉)中发现的极性脂质。Pomeranz,Y.(同上；参见图1)定义了在小麦粉中发现的极性脂质。在一个实施例中，术语“极性脂质”意指由以下组成的组中的一种或多种：磷脂、半乳糖脂或其组合。磷脂可以是磷脂酰胆碱、N‑酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇中的一种或多种。在一个实施例中，优选磷脂可以是磷脂酰胆碱。半乳糖脂可以是二半乳糖甘油二酯、神经酰胺甘油二酯、6‑o‑乙酰基甾醇葡糖苷或神经酰胺二葡糖苷中的一种或多种。在一个实施例中，优选半乳糖脂可以是二半乳糖甘油二酯。在一个实施例中，在sn1位置处作用于极性脂质的酶是磷脂酶A1，例如具有磷脂酶A1活性并可以分类为E.C.3.1.1.32。

[0146] 在sn1位置处作用于极性脂质的酶可以作用于半乳糖脂(例如二半乳糖甘油二酯(DGDG)或单半乳糖甘油二酯(MGDG))。这可能包括其磷脂酶A1活性。

[0147] 因此，在一个实施例中，在sn1位置处作用于极性脂质的酶是半乳糖脂肪酶，例如并且可以分类为E.C.3.1.1.26。

[0148] 在一个另外的实施例中，在sn1位置处作用于极性脂质的酶在sn1位置处作用于DGDG。

[0149] 如本文所使用，关于在sn1位置处作用于极性脂质的酶的术语“作用于”意指该酶从极性脂质的sn1位置处(例如通过水解)除去脂肪酸，例如从而释放游离脂肪酸。

[0150] 关于在sn1位置处作用于极性脂质的酶的术语“优先”意指例如与在sn2位置处催化极性脂质的裂解相比，该酶优选在sn1位置处催化极性脂质的水解。在sn1位置处作用于极性脂质的酶可以使用以下一种或多种测定来确定：“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质的酶(磷脂酶)的测定”和/或“用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”和/或“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质(半乳糖脂；MGDG)的酶的测定”。

[0151] 用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定

[0152] 底物：将0.6％16:0‑18:1 PC,1‑棕榈酰基‑2‑油酰基‑sn‑甘油‑3‑胆碱磷酸(Avanti Polar Lipids Inc.[Avanti极性脂质有限公司],Alabaster[阿拉巴斯特],TM
Alabama[阿拉巴马州]；目录号850457)0.4％TRITON ‑X 100(西格玛公司，X‑100)和5mM CaCl2溶于0.05M HEPES缓冲液(pH 7)中。

[0153] 对于胰酶，还添加了0.003M脱氧胆酸盐。

[0154] 测定程序：

[0155] 将2mL底物在30℃下孵育并添加在0.05M HEPES缓冲液中的0.1mL酶溶液(大约2‑5TIPU/mL或对应于在10分钟反应后消耗2％‑5％底物的酶量)，并在30℃下在磁力搅拌下孵育10分钟。添加40μL 4M HCl来终止反应并使游离脂肪酸质子化。添加1mL 99％乙醇并在涡旋混合器上混合。添加含有0.5mg C17:0脂肪酸(十七烷酸)的5mL MTBE(甲基叔丁基醚)。将样品再次在涡旋混合器上混合5秒，并在Rotamix上以25rpm提取30分钟。将样品在1520g下离心10min。

[0156] 将一个500mg胺(NH2)‑Bond Elut SPE柱(安捷伦公司(Agilent))置于Bond Elut真空系统上。将该柱用8mL石油醚调节。将来自提取的MTBE相施用到柱上并用以下洗脱：

[0157] 1.馏分8mL溶剂A：MTBE：2‑丙醇，2:1

[0158] 2.馏分8mL溶剂B：丙酮：甲酸，100:2

[0159] 将溶剂用大约0.25mL/min洗脱。

[0160] 将收集的脂肪酸馏分(馏分2)蒸发至干，并通过GLC分析脂肪酸。基于内标C17:0脂肪酸，确定C16:0和C18:1脂肪酸的量。

[0161] 将酶活性计算为测定条件下每分钟产生的μmol脂肪酸

[0162]

[0163] 其中

[0164] A＝％C16:0脂肪酸+％C18:1脂肪酸

[0165] 2＝mL底物

[0166] 1000000＝mol转化为μmol

[0167] D＝酶稀释因子

[0168] MV＝产生的C16:0和C18:1脂肪酸的平均分子量

[0169] 10＝分钟反应时间

[0170] 0.1添加到测定中的mL酶

[0171] 酶特异性计算如下：

[0172]

[0173]

[0174] 关于在sn1位置处作用于极性脂质的酶的术语“优先”意指例如与在sn2位置处催化极性脂质的裂解相比，该酶优选在sn1位置处催化极性脂质的水解。在sn1位置处作用于极性脂质的酶可以使用以下一种或多种测定来确定：“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质的酶(磷脂酶)的测定”和/或“用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”和/或“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质(半乳糖脂；MGDG)的酶的测定”。

[0175] 在sn1位置处优先作用于极性脂质的酶意指当使用“用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”和/或“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质(半乳糖脂；MGDG)的酶的测定”确定时，相对PLA1/sn1活性至少为60％。

[0176] 在一个实施例中，在sn1位置处优先作用于极性脂质的酶意指当使用“用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”和/或“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质(半乳糖脂；MGDG)的酶的测定”确定时，相对PLA1/sn1活性至少为70％。

[0177] 关于在sn1位置处作用于极性脂质的酶的术语“特异性”意指该酶将仅在sn1位置处催化极性脂质的水解。

[0178] 在sn1位置处特异性作用于极性脂质的酶意指当使用“用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”和/或“用于确定在sn1位置处作用于极性脂质(半乳糖脂；MGDG)的酶的测定”确定时，该酶具有至少60％(合适地至少70％)的相对PLA1/sn1活性。

[0179] 根据一个实施例，在sn1位置处作用于极性脂质的酶可以包括如WO 02/03805(其通过援引并入本文)中教导的酶。在一个实施例中，在sn1位置处作用于极性脂质的酶包括TM4080、 4090、 LIPOPAN F 和
TM
Lipopan Extra 。

[0180] 在一个实施例中，在sn1位置处作用于极性脂质的酶可以是来自尖孢镰刀菌TM
(Fusarium oxysporum)的磷脂酶A1(例如LIPOPAN F )。在一个实施例中，来自尖孢镰刀菌的磷脂酶A1可以是WO 98/26057(其通过援引并入本文)中教导的酶。

[0181] 在一个实施例中，根据本发明的在sn1位置处作用于极性脂质的酶是与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性，更优选至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的酶。

[0182] 优选地，在sn1位置处作用于极性脂质的酶对NAPE具有低活性。

[0183] 本发明的一个优点是使用在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶的组合。

[0184] 在sn1和sn2位置处的磷脂和半乳糖脂的脂肪酸组合物在脂肪酸长度和饱水平两方面都显著不同。

[0185] 出人意料地发现，通过组合在sn1位置处或sn2位置处起作用的酶，可以获得对面团和获得自面团(例如通过烹制，如通过烘烤、蒸、煮或油炸)的产品提供显著益处的极性脂质(例如溶血磷脂和溶血半乳糖脂(例如MGMG或DGMG))的有益组合。

[0186] 即使在NAPE中，存在于sn1或sn2位置处的脂肪酸也非常不同，通常来说，在sn2位置处存在更多的不饱和脂肪酸。磷脂酶A1可以水解sn‑1位置上的NAPE以产生2‑NALPE(例如其中脂肪酸处于sn‑2位置)(参见Structural Analysis of Wheat Flour Glycerolipids[小麦粉甘油脂质的结构分析].Lipids[脂质],第6卷，第10期第768‑776页)。

[0187] 因此，本发明涉及在sn2位置处裂解(例如水解)NAPE与用在sn1位置处起作用的酶修饰极性脂质(例如另外的极性脂质)的组合的影响。

[0188] 我们首先表明了选择性裂解(例如水解)NAPE和另一种极性脂质的重要性。

[0189] 根据本发明，将磷脂酶A2酶和作用于极性脂质的酶以有效量混合到面团组分中，这些有效量导致相对于除了未添加要求保护的酶以外在相同条件下制作的烘烤产品，烘烤产品的比容增加至少10％。

[0190] 根据本发明，将在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶以有效量混合到面团组分中，这些有效量导致相对于除了未添加要求保护的酶以外在相同条件下制作的烘烤产品，烘烤产品的柔软性增加至少5％、优选至少10％、更优选至少20％、最优选至少30％。

[0191] 如本文所使用，术语“改善的柔软性”和“增加的柔软性”被认为是同义，并且可以指烘烤产品中每比容的力的降低。

[0192] 当将脂质组分从面团或烘烤产品中提取(例如并进行气相层析法(GC)或液相层析法‑质谱法(HPLC/MS)分析或HPTLC分析)时，认为食物酶组合物合适地增加面团或烘烤产品中的单半乳糖甘油单酯含量，显示与未添加酶的相同面团或烘烤产品相比，基于干面团重量的单半乳糖甘油单酯增加超过约0.005％w/w，基于干面团重量的单半乳糖基甘油单酯含量合适地增加超过0.01％w/w(基于干面团重量的单半乳糖甘油单酯)、合适地增加超过0.025％w/w、合适地增加超过0.05％w/w、合适地增加超过0.075％w/w。

[0193] 当将脂质组分从面团或烘烤产品中提取(例如并进行气相层析法(GC)或液相层析法‑质谱法(HPLC/MS)分析或HPTLC分析)时，认为食物酶组合物合适地增加面团或烘烤产品中的单半乳糖甘油单酯含量，显示与未添加酶的相同面团或烘烤产品相比，单半乳糖甘油单酯含量增加约0.005％w/w至0.1％w/w(基于面团干面团)。

[0194] 根据本发明，当将脂质组分从面团或烘烤产品中提取(例如并进行气相层析法(GC)或液相层析法‑质谱法(HPLC/MS)分析或HPTLC分析)时，认为食物酶组合物降低面团或烘烤产品中的二半乳糖甘油二酯含量，显示与其中没有混合食物酶组合物的相同面团或烘烤产品相比，二半乳糖甘油二酯含量降低至少5％，优选至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％、合适地至少40％。

[0195] 根据本发明，认为食物酶组合物降低面团或烘烤产品中的二半乳糖甘油二酯含量。当将脂质组分从完全醒发(proofed)的面团或烘烤产品中提取(例如并进行气相层析法(GC)或液相层析法‑质谱法(HPLC/MS)分析或HPTLC分析)时，分析显示与其中没有混合食物酶组合物的相同面团或烘烤产品相比，相对二半乳糖甘油二酯含量降低约5％至50％(例如基于干面团，约0.01％w/w至0.1％w/w DGDG)。

[0196] 在一个实施例中，本发明的磷脂酶A2酶以100‑7500ePLU/kg面粉之间的浓度存在。在一个实施例中，磷脂酶A2酶以150‑2000ePLU/kg面粉给予。

[0197] 在一个实施例中，本发明的在sn1位置处作用于极性脂质的酶以50‑2000TIPU/kg面粉之间的浓度存在。在一个实施例中，本发明的在sn1位置处作用于极性脂质的酶以200‑800TIPU/kg面粉给予。

[0198] ePLU测定：

[0199] 磷脂酶A2酶活性(ePLU)可以使用以下测定(使用蛋黄作为底物)来确定。

[0200] 该测定根据食品化学品法典(FCC，第8版，附录5第1328页)进行。底物：

[0201] 向44g蛋黄(1个烧杯中有2个蛋黄)中添加200mL水并用Ultra Turrax混合器均化。添加10mL 0.3M氯化钙。将10mL底物转移至滴定玻璃并添加10mL水和5mL 0.016M脱氧胆酸钠。将底物在40℃下孵育，并使用pH stat滴定仪用0.05M NaOH将pH调节至pH 8。添加0.1mL酶并收集滴定数据5分钟。滴定剂是0.05M NaOH。使用滴定剂消耗作为时间函数的斜率(70秒至170秒)来计算活性(ePLU)，如测定条件下每分钟释放的μmol脂肪酸。

[0202] TIPU测定：

[0203] 磷脂酶活性(TIPU)可以使用以下测定来确定：

[0204] 底物：0.6％L‑α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti公司，目录号#441601)，0.4％TMTRITON ‑X 100(西格玛公司，X‑100)和5mM CaCl2溶于0.05M HEPES缓冲液(pH 7)中。

[0205] 测定程序：

[0206] 将样品、校准样品和对照样品在含有0.1％TRITONTMX‑100的10mM HEPES(pH 7.0)中稀释。使用Konelab Autoanalyzer(赛默(Thermo)，芬兰)进行分析。该测定在30℃下进行。在添加4μL酶样品之前，将34μL底物在30℃下恒温180秒。将酶化持续600秒。使用NEFA套装件(获得自WakoChemicals股份有限公司(WakoChemicals GmbH)，德国)测量在酶化期间释放的游离脂肪酸的量。

[0207] 该测定套装件由两种试剂组成

[0208] NEFA‑HR(1)：

[0209] 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，其含有

[0210] 0.53U/mL酰基‑辅酶A合酶(ACS)

[0211] 0.31mM辅酶A(CoA)

[0212] 4.3mM腺苷5‑三磷酸二钠盐(ATP)

[0213] 1.5mM 4‑氨基‑安替比林(4‑AA)

[0214] 2.6U/mL抗坏血酸氧化酶(AOD)

[0215] 0.062％叠氮化钠

[0216] NEFA‑HR(2)：

[0217] 2.4mM 3‑甲基‑N‑乙基‑N‑(E‑羟乙基)‑苯胺(MEHA)

[0218] 12U/mL酰基‑辅酶A氧化酶(ACOD)

[0219] 14U/mL过氧化酶(POD)

[0220] 在酶化后，添加113μL NEFA‑HR(1)，并将混合物孵育300秒。此后，添加56μL NEFA‑HR(2)，并将混合物孵育300秒。然后测量OD 520nm。基于由油酸制作的校准曲线来计算酶活性(μmol FFA/min·mL)。将酶活性TIPU pH 7计算为测定条件下每分钟产生的微摩尔脂肪酸。

[0221] 面粉面团可以不含足够量的本发明的组合物的全部脂质底物。因此，在本发明的范围内，用半乳糖脂、磷脂或其组合中的至少一种来补充面团以为一种或多种酶提供足够的底物。将理解，表述“足够的底物”暗示没有一种脂质底物对于获得如上所述的面团改善或烘烤产品改善效果有限制。

[0222] 本发明的酶的补充脂质底物可以是极性脂质。在这一点上，特别有用的脂质是来源于谷物如燕麦油的油或脂肪。除甘油三酯外，燕麦油通常含有5％‑25％的磷脂和5％‑12％的糖脂。燕麦油可以被分馏以产生具有高含量的极性脂质的馏分。

[0223] 因此，预期可以将一种或多种磷脂添加到面团中。在这一点上，有用的磷脂包括磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰胆碱(PC)。

[0224] 在一个实施例中，本发明的组合物进一步包含卵磷脂。

[0225] 在一个另外的实施例中，根据本发明使用的组合物进一步包含卵磷脂。

[0226] 在另一个实施例中，本发明的方法进一步包括混合卵磷脂。

[0227] 在一个实施例中，本发明的卵磷脂是大豆来源的卵磷脂。

[0228] 在另一个实施例中，本发明的卵磷脂已经被酶修饰。

[0229] 合适地，本发明的卵磷脂已被具有磷脂酶A2活性的酶进行酶修饰。

[0230] 优选地，本发明的卵磷脂已经被能够在N‑乙酰基磷脂酰乙醇胺的sn2位置处起作用的磷脂酶A2修饰。

[0231] 本发明又进一步提供了在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶在制造面团或烘烤产品中的用途，用于：改善烘烤产品的比容；改善面团性质(例如面团延展；面团拉伸性)；改善烘烤产品的外皮脆度；改善面包心结构(例如改善烘烤产品的面包心孔径或改善烘烤产品的面包心孔均一性)；改善柔软性(例如改善烘烤产品的柔软性)；改善烘烤产品的烤焙弹性；增加面团和/或烘烤产品中的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(优选增加具有含有14‑20个碳原子的脂肪酸部分的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺、优选增加具有含有14‑20个碳原子的饱和脂肪酸部分的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺)；增加面团和/或烘烤产品中的溶血磷脂；增加面团和/或烘烤产品中的二半乳糖甘油单酯和/或单半乳糖甘油单酯；增加面团和/或烘烤产品中的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺，和增加溶血磷脂和/或二半乳糖甘油单酯和/或单半乳糖甘油单酯。

[0232] 本发明可以进一步有利地提供用于获得如下烘烤产品的方法：所述烘烤产品具有改善的质量性质(例如改善的比容、改善的烘烤产品的外皮脆度；改善的面包心结构(例如改善的焙烤产品的面包心孔径或改善的焙烤产品的面包心孔均一性)；改善的柔软度(例如改善的烘烤产品的柔软度)；改善的烘烤产品的包覆(capping)；改善的烘烤产品的烤焙弹性)。

[0233] 因此，在一个实施例中，本发明的方法包括作为进一步的步骤，将面团烘烤以获得烘烤产品。烘烤面包产品的一个特别需要的特性是如实施例中定义的高比容。因此，相对于在除了不添加酶之外的相同条件下制备的烘烤产品，添加本发明的酶优选导致烘烤产品的比容增加至少10％。更优选地，比容的增加至少20％，例如至少30％，例如至少40％。

[0234] 本领域已知除脂肪酶以外的酶可以有助于改善面团特性和烘烤产品的质量。在本发明的范围内，除了本发明的组合物之外，还可以添加至少一种另外的酶。这些另外的酶包括：脂肪酶、淀粉降解酶(例如淀粉酶或淀粉葡糖苷酶)、半纤维素酶(例如木聚糖酶)、纤维素酶、氧化还原酶(例如葡萄糖氧化酶，如己糖氧化酶)、脂质酰基转移酶、脱支酶(例如支链淀粉酶)、乳糖酶和蛋白酶。

[0235] 根据另一个实施例，要求保护的方法包括进一步的步骤，其中将另外的酶与面团组分混合。

[0236] 比容

[0237] 烘烤产品的比容可以定义为产品的体积除以其重量。(g/mL或g/ccm)

[0238] 本发明涉及改善烘烤产品的比容。

[0239] 面团特征

[0240] 本发明可以涉及改善面团特性，如面团延展；面团拉伸性。本发明不会不利地影响面团黏性。

[0241] 这些可以在面团中如下进行测量：

[0242]

[0243]

[0244] 外皮脆度

[0245] 本发明可以涉及改善烘烤产品的外皮脆度。

[0246] 这可以在烘烤产品(例如，面包或面包卷)中如下进行测量：

[0247]

[0248] 面包心结构

[0249] 本发明可以涉及改善面包心结构(例如改善烘烤产品的面包心孔径或改善烘烤产品的面包心孔均一性)。

[0250] 这些可以在烘烤产品(例如，面包或面包卷)中如下进行测量：

[0251]

[0252] 柔软性

[0253] 本发明可以涉及改善柔软性(例如改善烘烤产品的柔软性)。

[0254] 柔软性可以通过本领域已知的任何方法测量。

[0255] 这可以在烘烤产品(例如，面包或面包卷)中如下进行测量：

[0256]

[0257] 在一个实施例中，面包切片的柔软性(或硬度)是使用来自稳定微系统公司(Stable Microsystems)的质地分析仪TAXTplus从质地剖面分析法(TPA)确定的。举例来说，可以使用35mm的金属探针来测量第1天(D1)和第3天(D3)的柔软性。

[0258] 包覆

[0259] 本发明不会不利地影响烘烤产品的包覆；

[0260] 一种常见的烘烤特征，被称为“包覆”，是常见的并且是特别不希望的。当顶部凝固(set)(即硬化)时发生包覆，然后顶部被向上推起，使得烘烤产品(例如，松饼或面包卷)内部的面糊渗出到侧面。结果导致不希望的烘烤产品(例如，松饼或面包卷)。

[0261] 通过检查烘烤产品来主观地评估包覆，并且将观察到的包覆量指定为定性数字。

[0262] 这可以在烘烤产品中如下进行测量：

[0263]

[0264] 烤焙弹性

[0265] 本发明可以涉及改善烘烤产品的烤焙弹性；

[0266] 如本文所使用，术语“烤焙弹性”意指当烘烤产品(例如面包)被放入烘烤炉时，它们的体积快速增加(上升)。

[0267] 这可以在烘烤产品中如下进行测量：

[0268]

[0269] 增加或改善

[0270] 如本文所使用，术语增加或改善意指与相同面团(但不添加根据本发明的酶)或从所述面团可获得的产品(例如烘烤产品)相比的增加或改善。

[0271] 本发明的另外的技术效果包括：增加面团和/或烘烤产品中的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(优选增加具有含有14‑20个碳原子的脂肪酸部分的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺、优选增加具有含有14‑20个碳原子的饱和脂肪酸部分的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺)；增加面团和/或烘烤产品中的溶血磷脂；增加面团和/或烘烤产品中的二半乳糖甘油单酯和/或单半乳糖甘油单酯。

[0272] 在一个优选的实施例中，本发明涉及增加面团和/或烘烤产品中的N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(NALPE)(优选1‑NALPE)，和增加面团和/或烘烤产品中的溶血磷脂和/或二半乳糖甘油单酯和/或单半乳糖甘油单酯。

[0273] 协同作用/协同效应

[0274] 诸位发明人首次显示了能够在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶的组合在食料(例如面团或烘烤产品)中提供的协同效应。

[0275] 术语“协同作用”或“协同效应”意指使用酶时效果(例如面包体积)增加，该增加大于单个或分别地以相同剂量使用每种酶时获得的增加。

[0276] 食物或食料

[0277] 本发明的方法、用途或组合物可以用于制备食料。此处，术语“食料(foodstuff)”以广义使用‑并且涵盖用于人类的食料以及用于动物的食料(即饲料(feedstuff))。在一个优选的方面，该食料用于人类消费。

[0278] 在本发明中，术语“面团组分”意指面粉(例如谷物粉，优选小麦粉)、水或酵母中的任何一种，或包含面粉、水和/或酵母中的一种或多种的任何组合物。

[0279] 优选将本发明的一种或多种酶与面团组分混合。

[0280] 优选地，将本发明的一种或多种酶与面粉或与包含面粉的组合物混合。

[0281] 在一个实施例中，食料是面团或由面团产生的产品(例如通过烹制，如通过烘烤、蒸、煮或油炸)。

[0282] 在一个实施例中，烘烤产品从面团可获得(优选从面团获得)。

[0283] 在一个实施例中，蒸制产品从面团可获得(优选从面团获得)。

[0284] 在一个实施例中，煮制产品从面团可获得(优选从面团获得)。

[0285] 在一个实施例中，油炸产品从面团可获得(优选从面团获得)。

[0286] 在一个实施例中，食料是烘烤产品。

[0287] 在一个实施例中，食料是蒸制产品。

[0288] 在一个实施例中，食料是煮制产品。

[0289] 在一个实施例中，食料是油炸产品。

[0290] 本发明的方法、用途或组合物可以用于制备面团或由面团产生的产品(例如通过烹制，如通过烘烤、蒸、煮或油炸)。

[0291] 优选地，烘烤产品是通过烘烤根据本发明生产的面团而生产的。

[0292] 优选地，煮制产品是通过煮制根据本发明生产的面团而生产的。

[0293] 优选地，蒸制产品是通过蒸制根据本发明生产的面团而生产的。

[0294] 优选地，油炸产品是通过油炸根据本发明生产的面团而生产的。

[0295] 对于某些方面，优选地，食料是烘烤产品，例如面包(例如白面包、粗面粉面包或黑麦面包；通常是以下形式：面包条或面包卷、法式长棍类型面包、皮塔饼、面饼、脆面包或比萨面包)、玉米粉圆饼、薄煎饼、松饼、馅饼皮、糕点(pastry)、丹麦甜糕饼、蛋糕、饼干或曲奇。

[0296] 在一个方面，食料是蒸制食品，例如馒头、饺子。

[0297] 在一个方面，食料是煮制食品，例如面条或意大利面食。

[0298] 在一个方面，食料是油炸产品，例如甜甜圈。

[0299] 如本文所定义的，“食物酶组合物”可以是适于添加到面团中或适于与面团组分混合的任何组合物。

[0300] 作为本发明的食物产品的非限制性实例包括烘烤产品和面团产品。

[0301] 如本文所使用，术语“面团”意指面粉和液体(例如水)的稠的、可塑的混合物。面团可以包括酵母或其他发酵剂。面团可以进一步包含其他面团组分，例如脂肪或一种或多种调味剂或盐或糖。

[0302] 根据本发明的面团可以由一种或多种选自以下的面粉制作：小麦粉、玉米粉、米粉、黑麦粉、豆类粉、杏仁粉或其他谷物粉。

[0303] 在一个实施例中，面团由小麦粉制作。

[0304] 本发明的方法和用途可以是任何面包制作过程的一部分。本发明的组合物可以用于任何面包制作过程。举例来说，面包制作方法可以是选自由以下组成的组中的一个或多个方法：中种(sponge‑and‑dough)法；直接(straight)法；快速和连续面包制作。

[0305] “中种”法

[0306] 不受理论束缚，中种混合法可以由两个不同阶段组成，中种面团(sponge)阶段和面团阶段。在第一阶段(中种面团阶段)，制作中种面团并使其发酵一段时间；并且在第二阶段(面团阶段)，将中种面团添加到最终的面团配料中，以形成总配方。“中种面团”的其他术语包括酵母起子(yeast starter)或酵母预发酵。在法式烘烤中，中种法可以被称为“levain‑levure”。

[0307] 在第一阶段，称为中种面团的混合物可以含有大约三分之一到四分之三的面粉、酵母、酵母食物(例如糖)和麦芽，以及足够的水来制作坚硬的面团或更多液体酿造物。可以在此阶段添加起酥油，但通常是在之后添加起酥油，并且可以添加三分之一至四分之三的盐以控制发酵。

[0308] 中种面团可以在任何合适的混合装置中混合，适当地进行温度控制。合适地，这可以是大型的水平面团混合器，每批处理大约一吨，并且任选地具有热交换夹套构造，从而允许温度控制。

[0309] 混合的目的是通过将面筋形成细长和交错的蛋白网络而形成面包的基本结构，从而使配料和“延展的”面团几乎均匀混合。由于必须避免强烈的剪切作用，通常的面团混合器具有若干个水平条，这些水平条平行于混合器的主体定向，以每分钟35至75转的速度缓慢旋转，通过它们的作用拉伸和揉捏面团。通常混合周期为大约为12分钟。

[0310] 将混合的中种面团倒入槽(在轮子上的浅矩形金属罐)中，并放置在受控温度和湿度(例如27℃和75％相对湿度)的区域中，在那里发酵直至其体积开始下降。这个过程(称为下降或中断)所需要的时间取决于变量如温度、面粉类型、酵母量、吸收量和麦芽量，这些变量经常被调整以在大约三至五小时内产生下降。

[0311] 在第二阶段或面团阶段，将中种面团送回混合器，并添加剩余的配料。面团延展到最佳的一致性，然后返回发酵室或允许“停机时间(floor time)”用于进一步成熟。

[0312] 在一个实施例中，在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶可以在中种面团阶段或面团阶段(优选在中种面团阶段)添加。这些可以同时或顺序地添加。

[0313] 在另一个实施例中，在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶可以在中种面团阶段(例如在混合面粉和其他面团配料期间)添加。可替代地地或另外地(例如在混合期间)，可以将在sn1位置处作用于极性脂质的酶添加到面团阶段。

[0314] 在一个实施例中，将能够作用于NAPE的磷脂酶A2酶添加到中种面团中，并将在sn1位置处作用于极性脂质的酶添加到面团中。

[0315] 在一个实施例中，可以在中种面团阶段(例如在混合面粉和其他面团配料期间)另外地添加卵磷脂，优选添加基于大豆的卵磷脂。合适地，卵磷脂可与至少一种在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶一起添加。合适地，卵磷脂可以是酶修饰的卵磷脂。在一个实施例中，卵磷脂可以通过用具有磷脂酶A2活性的酶进行酶修饰(优选卵磷脂可以通过用在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2进行酶修饰)。

[0316] 在一个实施例中，在中种面团阶段期间添加磷脂酶A2或其一部分。

[0317] “直接发酵面团(Straight dough)”法

[0318] 直接发酵面团法可以是制作面包的单混合过程。所有用于制作面团的组分(例如配料)都放在一起并在一次揉捏或混合过程中进行混合。混合后，在分裂之前进行大量团块发酵静置。

[0319] 在一个实施例中，在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶可以与面团组分混合。这些可以同时或顺序地添加。

[0320] 在一个实施例中，可以另外地添加卵磷脂，优选基于大豆的卵磷脂。合适地，卵磷脂可以是酶修饰的卵磷脂。在一个实施例中，卵磷脂可以通过用具有磷脂酶A2活性的酶进行酶修饰(优选卵磷脂可以通过用在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2进行酶修饰)。

[0321] “快速”法

[0322] “快速”法是直接发酵面团法的一个特殊子集。作为非限制性实例，增加量的酵母和快速作用的氧化剂(例如抗坏血酸和偶氮二甲酰胺)使得能够消除大部分直接发酵面团的发酵期。

[0323] 连续面包制作

[0324] 常规面团制备和构造中的许多步骤已经完全自动化，但没有一个过程是真正连续的。在连续的系统中，面团从将配料混合直到其沉积在盘中开始不中断地进行处理。最初的发酵过程基本上仍然是一个批程序，但在连续面包制作线中，传统的中种面团被液体预发酵(称为肉汤(broth)或酿造物)所取代。酿造物由水、酵母、糖和部分面粉以及其他配料的混合物组成，在发酵数小时后混合入面团。

[0325] 在酿造物完成发酵后，将其与干配料一起送入混合装置，该混合装置将所有配料混合成均一物质。将面糊状材料通过调节流动的面团泵并将混合物递送到延展装置(在此施加揉捏工作)。延展器(developer)是连续生产线中的关键设备。大约50公斤(100磅)的处理可以每90秒发生一次，其将面糊从具有无组织的结构、很小的拉伸性和不充分的气体保持的流体物质改变成光滑、有弹性的成膜面团。然后将面团从延展器中移出到计量装置中，该计量装置不断地挤出面团并间歇地提供面包大小的片，这些片落入下方连通的盘中。

[0326] 在一个实施例中，在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶和在sn1位置处作用于极性脂质的酶可以例如在发酵后和在面团混合期间被添加到液体预发酵或面团中。这些可以同时或顺序地添加。

[0327] 在另一个实施例中，在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶可以添加到液体预发酵中。可替代地地或另外地，例如在发酵后和面团混合期间，可以将在sn1位置处作用于极性脂质的酶添加到面团中。

[0328] 在一个实施例中，可以将卵磷脂(优选基于大豆的卵磷脂)在预发酵阶段中另外地添加或将其另外地添加到面团中(例如在发酵后和在面团混合期间)。合适地，卵磷脂可与至少一种在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶一起添加。合适地，卵磷脂可以是酶修饰的卵磷脂。在一个实施例中，卵磷脂可以通过用具有磷脂酶A2活性的酶进行酶修饰(优选卵磷脂可以通过用在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2进行酶修饰)。

[0329] 除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第20版，John Wiley and Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。

[0330] 本公开并不受本文披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指明，否则分别地，任何核酸序列都从左向右以5'到3'方向书写；氨基酸序列都从左向右以氨基到羧基方向书写。

[0331] 本文提供的标题并不是对本公开的各方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把说明书作为一个整体参考时，以下即将定义的术语得以更全面地定义。

[0332] 在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。

[0333] 如本文所使用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。

[0334] 如本文所使用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

[0335] 术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。在本公开和权利要求书中，可以使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)的定义。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。

[0336] 术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本公开并不限于所描述的具体实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本公开的范围仅由所附权利要求限定。

[0337] 在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体披露。在所陈述的范围中的任何规定值或中间值与所陈述的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个极限值被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开中，但依据所陈述的范围中的任何被具体排除的极限值而定。在所陈述的范围包含极限值的一个或两个的情况下，将那些所包含的极限值的一个或两个排除在外的范围也包含在本公开中。

[0338] 必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。因此，例如提及“酶”包括多个这样的候选试剂，并且提及“面团配料”包括提及一个或多个面团配料以及本领域技术人员已知的其等同物等。

[0339] 本文讨论的出版物只是针对它们在本申请的提交日之前的公开而提供。本文中的内容都不应理解为承认此类出版物构成所附权利要求书中的现有技术。

[0340] 现仅以举例的方式参照以下实例来描述本发明。

[0341] 实例

[0342] 材料与方法：

[0343] 材料：

[0344] ●在sn2位置处特异性作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶‑#4313，可商购自DSM公司(DSM)，荷兰(10000ePLU/mL)

[0345] ●LIPOMODTM699L是在sn2位置处作用于NAPE的磷脂酶A2酶，这是一种胰腺磷脂酶A2，可商购自生物催化剂公司(Biocatalysts)(12000ePLU/mL)。

[0346] ● 4080是一种在sn1位置处作用于极性脂质的酶(可商购自杜邦公司(DuPont))，已知该酶具有半乳糖脂酶和磷脂酶活性两者(10000TIPU/g)，并具有如SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列。

[0347] ● 4090是一种在sn1位置处作用于极性脂质的酶(可商购自杜邦公司(DuPont))，已知该酶具有半乳糖脂酶和磷脂酶活性两者(15,500TIPU/g)，并具有如SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列( 4090是与
4080相同的酶，但在 4090中酶更浓)。

[0348] ● 油，即甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(GCAT)，也称为脂质酰基转移酶(SEQ ID NO:2；可商购自杜邦公司(DuPont))。该酶可以在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺。酶活性1000TIPU/g。

[0349] ●LipopanTMF是一种在sn1位置处作用于极性脂质的酶，被称为磷脂酶A1。该酶可商购自诺维信公司(Novozymes DK)(18500TIPU/g)。

[0350] ● Golden Conc.,#4240是一种在sn1位置处作用于极性脂质的酶，被称为磷脂酶A1。该酶可商购自DSM公司(DSM)，荷兰(29000TIPU/g)。

[0351] ● 800，是来自杜邦公司的己糖氧化酶(HOX)。

[0352] TLC分析

[0353] 装置：

[0354] ●施加器：自动TLC取样器4，编程为7cm的洗脱时间的CAMAG ADC2自动显影室。

[0355] ●HPTLC板：来自默克公司(Merck)的10x20cm二氧化硅板no.1.05641.0001。使用前在160℃下在CAMAG TLC片式加热器III上激活10分钟。

[0356] ●延展：将HPTLC二氧化硅板在CAMAG TLC片式加热器III上在160℃下干燥10分钟、冷却、并浸入在16％H3PO4中的6％乙酸铜中。另外在160℃下干燥6分钟并直接评估。

[0357] 面团脂质分析：

[0358] ●将溶于0.5mL庚烷:异丙醇为3:2中的5μL面团脂质(来自200mg干面团)样品施加于HPTLC板。

[0359] 标准品1A：将溶于庚烷:异丙醇3:2中的0.1％DGDG(二半乳糖二酰甘油)(Avanti公司(Avanti)，目录号#840524)以不同量(0.5‑1‑2‑3和5μL)通过自动TLC施加器施加于HPTLC板中。

[0360] ●运行缓冲液4‑1：氯仿:甲醇:水192:78:12(用于面团脂质的标准运行缓冲液)[0361] ●运行缓冲液6：乙酸甲酯:氯仿:1‑丙醇:甲醇:0.25％KCl于水25中25:25:10:9(用于更好地分离磷脂)

[0362] ●在板室中10mL运行缓冲液和在滤纸室中25mL运行缓冲液

[0363] ●显影后，扫描TLC色谱图，并使用CAMAG TLC扫描仪计算不同组分的面积。

[0364] ●基于DGDG标准品的面积构建校准曲线，并基于该校准曲线计算面粉脂质的单个组分的浓度。

[0365] P‑NMR分析：

[0366] 将卵磷脂样品(40±5mg)溶于1mL 4:2:3CDCl3:MeOH:CsCDTA(水溶液)(氘代氯仿:甲醇:铯‑1,2‑二氨基环己烷四乙酸，v/v)。在milli‑Q‑水中制备浓度为1M的CDTA溶液。然后添加CsOH·H2O(氢氧化铯水)以将pH调节至10.5。将样品涡旋10秒，并在20℃下以4500rpm离心10分钟，然后使用1000μL汉密尔顿注射器(Hamilton syringe)将550μL转移至5mm NMR管并置于NMR仪器中用于分析。使用三异丁酸磷酸酯作为内标(2mg)。我们发现在5℃下获得的NMR光谱产生了具有最佳峰宽和信号分散的理想谱。

[0367] 使用Bruker  Advance III光谱仪( 公司( )，瑞士)，SampleJet样品转换器(Bruker公司(Bruker)， 公司，瑞士)和5mm BBO(宽带观
察公司(Broadband Observe))探针(调整为磷)(Bruker公司， 公司，瑞士)，在
14.1T自动化下采集NMR光谱)。光谱是在定量条件下采集的。

[0368] 从面团提取的磷脂的LC/MS分析：

[0369] 将面团脂质样品通过在全扫描m/z 50‑1500中用与三重四极质谱仪(其中具有在正模式和负模式下的热电喷雾)在线联机的液相层析法进行分析。NALPE以负模式形成去质‑子化离子[M‑H]。

[0370] 柱为正相柱(DIOL)，并且流动相为乙腈/丙酮80/20，并添加1L中的20mL水。该水中含有5mM甲酸铵。

[0371] 将样品溶于2mL乙腈/丙酮(80:20)中。提取痕量的所选择的NALPE并且比较面积。

[0372] 仪器

[0373] 安捷伦(Agilent)1100

[0374] 二元泵(G1312B)+μ‑真空脱气器(G1379B)

[0375] 高性能自动取样器ALS(G1367E)+恒温器1290(G1330B)

[0376] 柱室(G1316A)

[0377] TSQ Vantage，来自赛默芬尼根(Thermo Finnigan)的三重四极杆质谱仪

[0378] 具有热电喷雾界面(HESI‑II)(MS7)

[0379] 柱：YMC Pack Diol 120 S‑5μm，12nm 4.6*50mm(#526)

[0380] 层析条件

[0381]自动取样器温度： 25℃ 注射体积 40μL
柱温： 30℃    

[0382] 样品制备

[0383] 向来自0.2克干面团的脂质添加2mL乙腈/丙酮(80:20)并超声处理10min。

[0384] 在16,000g离心3分钟，并将上清液原样注入。

[0385] 计算：基于HPLC/MS分析，确定具有不同脂肪酸的NALPE组分的量，并且计算C16:0 NALPE、C18:0 NALPE、C18:1 NALPE、C18:2 NALPE、C18:3 NALPE的相对含量。

[0386] 面团脂质的提取。

[0387] 将完全醒发的面团的样品立即在液氮中冷冻。然后将面团冷冻并冻干。将干面团磨碎并筛分。将1.0g样品称量至具有盖子的15ml离心管中。添加7.5mL水饱和丁醇(WSB)并在涡旋上混合。将样品置于90℃的水浴中10分钟，然后置于RotaMix(25rpm)上30分钟。将样品再次置于90℃的水浴中10分钟，然后置于RotaMix上30分钟。将样品在2000rcf下离心10分钟。将1.5mL有机相取出到dram玻璃制品中并在氮气流下蒸发至干燥并用于进一步分析。

[0388] 实例1.

[0389] 测试 4080与 油的组合的烘烤实验

[0390] 在这个实验中， 4080与 油在一个配方中组合使用，用于硬皮面包卷(Hard Crust Roll)。

[0391]

[0392] 在Diosna螺旋混合器上揉捏。根据分析，面粉吸水率为：400BU‑2％

[0393] 程序

[0394] 将所有配料混合在一个碗中，慢速添加水1分钟，并缓慢揉捏2分钟，快速揉捏6.5分钟。面团温度必须接近26℃。将1350g面团称量并手工模制成圆形。将面团在30℃下放置在加热箱中10分钟。

[0395] 将面团用“GlimikTM搓圆机”(根据机器上的表格进行设置)模制成30个面团球。

[0396] 将面团在34℃、85％相对湿度下醒发45分钟，并在200℃/2l蒸汽+5分钟风门打开(MIWE烤箱程序1)下烘烤13分钟。烘烤后，在环境温度下将面包卷冷却25分钟，然后称重并测量体积。

[0397] 由本领域技术人员评估面团和面包的特征

[0398]

[0399]

[0400] 来自烘烤评估的实验设置和结果显示于表1中。

[0401] 表1.用 4080和 油烘烤面包的烘烤结果

[0402]

[0403] *面团+面包总分数＝加上校正(黏性分数以(10‑实际分数)加和)的单个分数的总和

[0404] 实例1：面团+面包总分数＝6+(10‑6)+5+(10‑6)+6+6+6+7＝44

[0405] 将完全发酵的面团冷冻、冻干，并将干面团中的脂质用水饱和的丁醇提取并通过HPTLC分析。

[0406] 基于在相同板上分析的DGDG的校准曲线对HPTLC分析的组分进行定量，结果如表2所示。

[0407] 表2.面团脂质组分二半乳糖甘油二酯(DGDG)、二半乳糖甘油单酯(DGMG)、单半乳糖甘油单酯(MGMG)、N‑酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)、N‑酰基溶血磷脂酰乙醇胺(NALPE)、N‑酰基甘油磷脂酰乙醇胺(NAGPE)的HPTLC分析。

[0408]

[0409]

[0410] 表1中的烘烤结果说明了将 4080添加到面团中对面包体积的强烈作用。然而，添加 油与30ppm Powerbake的组合可以进一步增加面包
体积，并且可以看到明显的协同效应。该协同效应也被认为是面团和面包分数的改善。
100ppm 油具有最强的协同效应，HPTLC分析证实 4080
在形成单半乳糖甘油单酯(MGMG)和双半乳糖甘油单酯(DGMG)期间对单半乳糖甘油二酯(MGDG)和二半乳糖甘油二酯(DGDG)具有强烈的活性。这种酶在NALPE形成期间对NAPE也具有强烈的活性。在形成NALPE期间， 油对NAPE也具有活性。
油的一些活性也可在面团中的半乳糖脂上看到。

[0411] 不希望被理论所束缚， 4080和 油之间的协同烘烤性能归因于以下事实： 油在NAPE的sn2位置处是活性的，而
在极性脂质(包括MGDG和DGDG以及磷脂酶，包括NAPE)的sn1位置处中是
活性的。

[0412] 实例2.

[0413] 以25ppm至200ppm剂量测试 油的烘烤实验

[0414] 在实例1中，显示与 4080组合的 油的最佳剂量为100ppm。为了进一步研究剂量响应，以25ppm至200ppm剂量，与 4080
组合对 油进行测试。结果显示于表3中。

[0415] 表3.

[0416]

[0417]

[0418] 烘烤结果证实了30ppm 4080与 油组合的协同效应。需要至少75ppm 油以发现协同效应并且100ppm为最佳剂量。

[0419] 将完全发酵的面团冷冻、冻干，并将干面团中的脂质用水饱和的丁醇提取并通过HPTLC分析(表4)。

[0420] 表4.面团脂质的HPTLC分析。

[0421]

[0422] 面团脂质的分析证实了 油对NAPE的活性，但也可以看出，NALPE的量随着 油剂量的增加而降低，并且NAGPE形成。25ppm至200ppm的
油的剂量对半乳糖脂几乎没有作用。

[0423] 将面团脂质也通过P‑NMR进行分析，重点在于NALPE的异构体组成，如表5所示。表5的结果表明，随着 油剂量的增加，由于这种酶的sn2特异性，产生更多的1‑NALPE。

[0424] 表5.面团脂质中磷脂的P‑NMR分析。

[0425]

[0426] 实例3.

[0427] 测试 4080与 的组合的烘烤实验

[0428] 在这个实验中，将 4080与 或油组合在硬皮面包卷配方中进行了测试。

[0429] 是一种具有高PLA2特异性的磷脂酶。

[0430] 实验设置和烘烤结果显示于表6中。

[0431] 表6.用 4080、 油和 进行烘烤实验基于面粉的酶剂量。

[0432]

[0433]

[0434] 面团和面包总分数被计算为除了以(10‑黏性)加和的黏性分数之外，单独分数的总和

[0435] 实验1：总分数＝7+(10‑7)+4+(10‑6)+5+5+4+5+5＝42

[0436] 表6的结果清楚地表明， 4080与Maxapal的组合在面包体积方面产生明显的协同效应，并且面团和面包特征也得到改善。还观察到 对于
不同剂量具有很强的耐受性，其中从100ppm至750ppm剂量的 可见增加的
效果。

[0437] 将完全发酵的面团冷冻、冻干，并将干面团中的脂质用水饱和的丁醇提取并通过HPTLC分析。

[0438] 基于在相同板上分析的DGDG的校准曲线对HPTLC分析的组分进行定量，结果如表7所示。

[0439] 表7.面团脂质的HPTLC分析。

[0440]

[0441] HPTLC分析证实，在形成NALPE期间， 在NAPE上非常活跃。该酶对NAPE具有高特异性，并且没有观察到NAGPE的显著形成。这也许可以解释为什么Maxapal耐受不同的剂量。 对DGDG没有活性，但显示当MGMG形成时MGDG活性小。不希
望被理论所束缚，关于NAPE水解成NALPE， 的特异性解释了为什么该酶与
4080的组合具有积极的协同效应，并且这也解释了为什么
不易超剂量。然而，可以看出 4080和
的组合产生少量的NAGPE。这可以通过以下事实解释： 生产sn1‑NALPE，这
是对于 4080来说是比sn2‑NALPE更优选的底物，因为
4080对sn1位置处的脂肪酸具有活性。

[0442] 为了进一步详细研究酶的特异性和对面团中NALPE的脂肪酸组成的影响，通过HPLC/MS分析从面团中提取脂质，并且对NALPE的C16:0、C18:0、C18:1、C18:2和C18:3脂肪酸组成的相对组成进行分析。基于在面团中的NALPE的脂肪酸组成和基于从面团脂质的TLC分析计算的NALPE的量，计算面团中C16:0_NALPE的相对量，如表8的表中所示。(将对照面团中C16:0_NALPE的相对量定义为100％)。

[0443] 表8：经酶处理的面团中C16:0 NALPE的相对量。

[0444]

[0445] 表7和表8中的结果证实 4080在面团中产生大量的NALPE，但C16:0_NALPE的量仅边际增长(3％至8％)。这可以通过以下事实来解释：
4080在NAPE的sn1位置处水解脂肪酸。当用 处理面团
时，面团中NALPE的量也增加，并且在这里观察到C16:0_NALPE的量强烈增加(340％)，因为水解NAPE在sn2位置处的脂肪酸。

[0446] 当 4080与 组合时，可以增加C16:0_NALPE的量，并且如表7所示，该酶组合在生产DGMG和MGMG期间对面团中的半乳糖脂(像DGDG和MGDG)也有活性。

[0447] 4080和 对烘烤性能的积极协同效应可以解释为在DGMG、MGMG和16:0_NALPE形成期间对半乳糖脂和NAPE的组合作用。
对面团中的其他磷脂(像PC和PE)也有活性，并且已知这些组分在sn1位置处也含有更多的饱和脂肪酸。因此预计在面团中产生的LPC和LPE也具有更高量的饱和(c16:0)脂肪酸。

[0448] 实例4.

[0449] 用硬皮面包卷进行烘烤实验

[0450] 该实验的目的是测试来自生物催化剂公司(Biocatalysts)的另一种PLA2，TM
LIPOMOD 699L，并研究与sn1特异性酶 4080组合的效果。

[0451] 根据硬皮面包卷的程序(实例1)测试酶，并评估面包比容以及面团和面包特性。

[0452] 如表9中概述的对酶进行测试，烘烤结果也显示在表9中。TM

[0453] 表9.使用 4080和LIPOMOD 699L进行烘烤实验。基于面粉重量的酶剂量。

[0454]

[0455] 表9的结果清楚地显示了通过将PLA2、LIPOMODTM699L与sn1特异性糖脂肪酶TM
4080组合的协同效应。LIPOMOD 699L本身增加少量面包体积，并且
4080还可以明显增加面包体积。然而，两种酶的组合比单独的酶更多
地增加面包体积。另外，通过组合这两种酶明显改善了面团和面包总分数。

[0456] 实例5.

[0457] 用硬皮面包卷进行烘烤实验。

[0458] 在早期的烘烤测试中，显示PLA2酶与sn1特异性酶 4080结合显示出协同效应。该酶也具有sn1特异性磷脂酶活性。在该测试中，其他sn1特异性磷脂酶与PLA2组合进行测试，如表10所示。

[0459] 按照硬皮面包卷的程序(实例1)测试酶，唯一改变是使用新的改良面粉(Reform flour(DK2015‑00040))。TM

[0460] 表10.用 LIPOPAN F 和 进行烘烤实验；基于面粉的酶剂量。

[0461]TM

[0462] 通过 与 和LIPOPAN F 的组合获得的烘烤效果清楚地显示出对面包体积的协同效应。

[0463] 实例6.

[0464] 用硬皮面包卷进行烘烤实验

[0465] 烘烤实验表明，sn1特异性酶 4080和sn2特异性酶的组合在用于烘烤时对面包体积具有积极的协同效应。然而，已知面粉中
磷脂的量是相当有限的。该试验的目的是研究当面团富含大豆卵磷脂时这些酶的作用。

[0466] 如表11所示，根据硬皮面包卷的程序(实例1)用酶和卵磷脂进行烘烤实验。

[0467] 表11.用卵磷脂与酶组合进行烘烤测试。基于面粉的酶剂量。

[0468]

[0469] 表11中显示的对面包体积的作用清楚地证实了 4080和在含有0.2％或0.5％卵磷脂的面团中的协同效应。

[0470] 实例7.

[0471] 用硬皮面包卷进行烘烤实验

[0472] 在此烘烤实验中，使用称为北极熊(Polar Bear)的美国面粉(DK2015‑00071)在硬皮面包卷中测试 PLA2和糖脂肪酶 4080的作用。根据硬皮面包卷的程序(实例1)(除了没有添加真菌α淀粉酶之外)进行烘烤实验。实验设置和结果显示于表12中。

[0473] 表12.用 4080和 在北极熊面粉中进行烘烤实验。基于面粉的酶剂量。

[0474]

[0475]

[0476] 当在美国面粉中测试这些酶时，表12的烘烤结果证实了通过组合PLA2和糖脂肪酶 的协同效应。

[0477] 实例8.

[0478] 用中种面包进行烘烤实验

[0479] 烘烤实验已经表明，可能在面团中获得具有对NAPE活性的sn1和sn2磷脂酶的积极协同效应。积极的作用可以通过在甘油部分用饱和脂肪酸(C16:0_NALPE)生产NALPE来解释。然而，当添加到面团中时，这两种类型的酶将竞争NAPE底物，并且因此已经观察到这两种酶的组合产生的C16:0_NALPE比单独使用sn2特异性磷脂酶 时产生的C16:0_NALPE更少。

[0480] 然而，在某些面包制作程序如中种程序中，可以在中种面团侧和面团侧都添加酶。当单独将sn2特异性磷脂酶添加到中种面团侧时，不会对NAPE底物产生竞争。在此设想可以在面团侧添加sn1特异性糖脂肪酶。

[0481] 在中种面团侧添加酶的另一方面是在中种面团发酵期间形成的功能极性组分在面团混合期间可用。

[0482] 根据L.Gerits等人(Food Chemistry[食品化学]172(2015)613‑621)，向面团添加乳化剂(像DATEM)对面团流变性有影响，而添加脂肪酶则没有该影响，因为水解脂质在发酵期间仅释放至显著水平。在中种面包制作程序中向中种面团中添加酶形成对面团具有积极有效流变特性的水解脂质。

[0483] 在接下来的烘烤测试中，将 添加到中种面团中，并在面团侧添加4080。根据以下教导的中种程序使用改良面粉(DK2015‑00040)进行烘
烤实验：

[0484] 配方

[0485]

[0486] 中种面团：

[0487] 1)在Hobart混合器上将所有配料以第一速度混合1分钟，以第二速度混合3分钟[0488] 2)中种面团温度必须是大约25.5℃

[0489] 3)在30℃、85％相对湿度下发酵中种面团3小时‑未加盖的碗

[0490] 面团：

[0491] 1)在Hobart混合器(使用冰水)上将中种面团和所有剩余配料(除盐之外)低速混合2分钟‑中速混合5分钟

[0492] 2)添加盐‑中速混合8分钟

[0493] 3)称量550g面团

[0494] 4)在环境温度下将面团静置10min

[0495] 5)在Glimek塑模机上进行模制：1:4‑2:3‑3:15‑4:12‑宽度：两侧都是8

[0496] 6)将模制的面团放入罐中

[0497] 7)在43℃、95％相对湿度下醒发60min

[0498] 8)在200℃(Miwe烤箱程序4)中烘烤26min

[0499] 9)从罐中取出面包并冷却70分钟，然后称量和测量体积

[0500] 酶剂量和烘烤结果显示于表13中。

[0501] 表13.用 4080和 在中种程序中进行烘烤实验。基于面粉的酶剂量。

[0502]

[0503] 表13中的结果证实，可以在中种面包程序(其中 被添加到中种面团并且 被添加到面团中)中获得 和
4080的积极协同效应。

[0504] 实例9.

[0505] 用中种面包进行烘烤实验

[0506] 中种面包制作程序是传统上使用并且仍然在美国烘烤工业中广泛使用。中种程序的特征在于两步面团混合。中种面团是通过将面粉(总面粉的70％)、水和酵母混合，发酵相当长时间(3小时)而制作的。然后将中种面团与剩余面粉、水、糖、盐和其他配料混合。通常还将酶添加到面团中，但是在添加将竞争相同底物的两种酶的情况下，可以在中种面团侧添加一种酶，然后在面团侧添加另一种酶。

[0507] 在以下实验中，使用美国面粉(北极熊#DK2015‑00071)在中种面包制作程序中测试 和 4080，测试的酶及结果如表14所示。

[0508] 表14.用 4080和 以中种程序使用北极熊面粉进行烘烤实验。基于面粉的酶剂量。

[0509]

[0510] 当添加到中种面团中的 与添加到面团中的4080组合时，表14的结果证实了对面包体积的协同效应。

[0511] 实例10.

[0512] 用中种法进行烘烤实验

[0513] 在中种面包程序(其中 被添加到中种面团侧或面团侧)中进一步研究组合添加 与 4080的作用。实验设置和结果显示
于表15中。

[0514] 表15.用 4080和 以中种程序使用北极熊面粉进行烘烤实验。酶剂量是基于面粉。

[0515]

[0516] 表15中的面包体积结果证实通过添加 和4080的组合可以获得积极的协同效应。观察到在中种面团侧和面团侧都添加
的协同效应。结果表明 被添加到中种面团侧时有更强的
协同效应。

[0517] 实例11.

[0518] 使用在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶与在sn1位置处作用于极性脂质的酶的组合，在白面包(中种法)中观察测试柔软性的烘烤实验

[0519] 添加在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶( )与在sn1位置处作用于极性脂质的酶( 4090)的组合的作用进一步在白
面包(中种面包程序)(其中在中种面团阶段添加 并在面团阶段添加
4090)中进行研究。

[0520] 4090是一种在sn1位置处作用于极性脂质的酶。具体地，它是对极性脂质具有PLA1活性并且具有本文公开的SEQ ID NO:1的真菌脂肪分解酶。使用具有
15500 TIPU酶活性的 4090。

[0521] 实验设计：

[0522]

[0523] 800(HOX)和抗坏血酸的使用在所有实验中分别保持恒定为50ppm和60ppm。

[0524] 测试来自每个测试变量的两片面包，并且面包切片的柔软性(或硬度)是使用来自稳定微系统公司(Stable Microsystems)的质地分析仪TAXTplus从质地剖面分析法(TPA)确定的。第1天和第3天使用35mm金属探针。

[0525] 柔软性结果：

[0526] 分别测试 和 4090，分别显示与对照相比(不添加 或 4090)需要较高的力，表明面包较硬。
和 4090的组合提供了最佳柔软性。相同的组合也表现
出相对于体积的最高协同作用(数据未在此处提供)。如图2所示，面包柔软性结果证实通过添加 和 4090的组合可以获得积极的协同效应。在白
面包的生产中观察到这种协同效应。

[0527] 实例12.

[0528] 使用在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶与在sn1位置处作用于极性脂质的酶的组合，在100％全小麦面包(中种法)中观察测试柔软性的烘烤实验[0529] 添加在sn2位置处作用于N‑酰基磷脂酰乙醇胺的磷脂酶A2酶( )与在sn1位置处作用于极性脂质的酶( 4090)的组合的作用进一步在
100％全小麦(中种)面包程序(其中在中种面团阶段添加 并在面团阶段
添加 4090)中研究。

[0530] 实验设计：

[0531]

[0532] 800(HOX)和抗坏血酸的使用在所有实验中分别保持恒定为100ppm和100ppm。

[0533] 测试来自每个测试变量的两片面包，并且面包切片的柔软性(或硬度)是使用来自稳定微系统(Stable Microsystems)的质地分析仪TAXTplus从质地剖面分析法(TPA)确定的。第1天和第3天使用35mm金属探针。

[0534] 柔软性结果：

[0535] 在第1天和第3天，单独的PLA2显示与对照(不添加 或4090)相比增加的柔软性。

[0536] 4090比对照(不添加 或4090)显示出同一(或更低)水平的柔软性。

[0537] 和 4090的组合显示出增加的柔软性。

[0538] 如图3所示，在100％全小麦中显示的面包柔软性结果显示与对照(不添加或 4090)相比 单独增加柔软性。然
而，与单独使用 或单独使用 4090或对照相比，
与 4090的组合进一步提高了柔软性。

[0539] 实例13

[0540] sn2特异性、NAPE活性PLA2的特性和烘烤性能

[0541] 这些实验的目的是验证在与sn1特异性酶 4080组合时，具有sn2特异性和NAPE活性的另一种磷脂酶(CRC08335)在烘烤应用中的协同性能。

[0542] 方法：

[0543] 气相层析法(GLC)

[0544] 通过GLC分析游离脂肪酸作为三甲基甲硅烷基衍生物(TMS)。

[0545] 仪器

[0546] ●Perkin Elmer Clarus 600毛细管气相层析仪，其配备有WCOT熔合硅胶柱12.5mx0.25mm ID x 0.1μ膜厚度5％苯基‑甲基‑硅酮(来自Chrompack的CP Sil 8 CB)。

[0547] ●载气：氦。

[0548] ●注射器：PSSI冷分割注射(初始温度90℃，加热至395℃)，体积1.0μl

[0549] ●检测器FID：395℃

[0550]

[0551] 样品制备：

[0552] 将蒸发的样品溶于1.5ml庚烷:吡啶(2:1)中。将500μl样品溶液转移到弯曲小瓶中，添加100μl MSTFA(N‑甲基‑N‑三甲基甲硅烷基‑三氟甲酰胺)并在60℃下反应15分钟[0553] CRC08335的克隆

[0554] 编码真菌磷脂酶A2型‑2的合成基因(CRC08335)从捷瑞公司(Generay(http://www.generay.com.cn/english/))订购，作为用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达的密码子优化的基因。CRC08335的蛋白序列(SEQ ID NO.4)(图5)由内部嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophile)菌株鉴定，并与NCBI数据库(来自Thermothelomyces thermophila ATCC 42464的分泌型磷脂酶A2，NCBI登录号XP_003666499.1)中其最接近的同源物共享95％的同一性。CRC08335具有N端信号肽序列/通过SignalP 4.0(SignalP 4.0：区分来自跨膜区域的信号肽，Thomas Nordahl Petersen,  Brunak,Gunnar von 
Heijne&Henrik Nielsen.Nature Methods[自然方法],8:785‑786,2011)的预测，这表明它是一种胞外酶。

[0555] 将保留其N端天然信号肽的CRC08335的合成基因(SEQ ID NO.5)(图6)克隆到pGXT中(与公开的PCT申请WO 2015/017256中描述的pTTTpyr2载体相同，通过援引并入本文)。在pTTTpyr2载体中，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)pyrG基因被红褐肉座菌pyr2基因取代。pTTT‑pyr2表达载体含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域，这允许感兴趣的基因的强烈诱导表达。构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记赋予乙酰胺作为唯一氮源的转化体的生长，并且里氏木霉端粒区域允许在真菌细胞中维持非染色体质粒。在克隆CRC08335后，将所得质粒标记为pZKY512‑1。图7中提供了pZKY512‑1的质粒。

[0556] 从内部嗜热毁丝霉菌株鉴定的CRC08335的蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。预测的信号肽的多肽序列是MKFLSTALCLASSVLA(SEQ ID NO:6)。

[0557] CRC08335的转化

[0558] 使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物方法杂志]51:393‑99)将质粒pZKY512‑1转化到合适的里氏木霉菌株(方法描述于公开的PCT申请WO 05/
001036中)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的固体培养基上选择转化体。在乙酰胺板上生长5天后，收集转化体并在250mL摇瓶中在含有葡萄糖和槐糖混合物的定义的培养基中发酵。

[0559] 结果：

[0560] SN1/SN2特异性：

[0561] CRC08335的酶特异性根据“用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”来确定。该测定使用具有定制的FFA(游离脂肪酸)组合物的PC底物，通过GLC分析分析释放的FFA。结果概述于表16。

[0562] 表16. 4080、 和CRC08335的酶sn1/sn2特异性。

[0563]

[0564] 表16中的数据清楚地表明 和CRC08335与“％相对PLA1活性”相比具有sn2特异性，如通过高“％相对PLA2活性”所示。此外，数据清楚地反映出
4080具有sn1特异性。

[0565] NAPE活性：

[0566] 通过添加和不添加酶进行烘烤试验的面团的脂质质地分析来评估CRC08335的NAPE活性。根据硬皮面包卷的程序(实例1)进行烘烤应用。

[0567] 通过面团脂质的HPLC分析来验证NAPE活性。根据从面团提取脂质的程序，从完全醒发的、冻干的面团中提取面团脂质。通过使用HILIC DIOL柱1.7μm，50*2.1mm(富通技术有限公司(Fortis Technologies Ltd)，英国)的HPLC来分析分离的脂质。所使用的溶剂是溶剂A：96％丙酮、4％甲醇、1mM甲酸铵，以及溶剂B：60％丙酮、34％甲醇、6％MiliQ水、1mM甲酸铵，具有以下梯度：0‑20分钟100％溶剂A至100％溶剂B，20‑30分钟100％溶剂B，30‑40分钟100％溶剂A。使用带电荷的气溶胶检测器和1‑棕榈酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺‑N‑亚油酰基(Avanti Polar Lipids公司(Avanti Polar Lipids)，阿拉巴马州(Alabama)，美国)作为内标来定量NAPE和NALPE。来自HPLC分析的结果显示于表17中。

[0568] 表17.在硬皮面包卷中测试 4080和CRC08335(基于面粉重量的酶剂量；改良面粉)的烘烤实验DK22102‑43

[0569]

[0570] 表17中的结果清楚地显示CRC08335具有如NAPE水解和产生更多乳化组分NALPE所示的NAPE活性。 4080还显示NAPE活性，如NAPE水解和产生更多乳化组分NALPE所示。除产生NALPE之外， 4080还显示产生NAGPE(数据未显示)。

[0571] 应用性能：

[0572] 通过进行添加和不添加酶的烘烤试验来评估sn2特异性NAPE活性酶CRC08335与4080组合使用时的协同应用性能。根据硬皮面包卷的程序(实例1)进行
烘烤应用。

[0573] CRC08335和 4080的协同应用性能通过增加相对比容来显示，如表18所概述。

[0574] 表18.测试sn2特异性NAPE活性酶CRC08335与sn1特异性 4080组合的烘烤应用性能的烘烤实验DK22102‑43和DK22102‑52。

[0575]

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[0578] 表18中的结果显示当作为单一组分使用时，sn2特异性NAPE活性酶CRC08335对比容的作用有限。CRC08335与 4080(以各自剂量)的组合，并且因此来自磷脂和半乳糖脂水解的乳化组分的产生对比容显示出明显的协同效应。

[0579] 结论

[0580] 基于烘烤实验和面团脂质分析，出人意料地发现， 4080或4090与 PLA2磷脂酶或 油的组合在
烘烤中产生了积极的协同效应。这可以通过改善面包体积以及改善面团和面包性质(包括柔软性)来证实。

[0581] 当 与其他PLA1酶(像LIPOPAN FTM和 )组合使用时，也可以观察到对面包体积的积极协同效应。

[0582] 用其他PLA2酶(LIPOMODTM699L和CRC08335)进行的烘烤测试也显示出与4080组合具有积极的协同效应。

[0583] 在使用不同类型的小麦粉进行的不同烘烤实验中证实了该协同效应。

[0584] 4080和 4090是一种对面团中的半乳糖脂和磷脂具有sn1活性的糖脂肪酶。在生产sn1‑NALPE期间，PLA2磷脂酶 在
sn2位置处水解NAPE(和其他磷脂)，但不会显著程度地水解NALPE。NAPE在sn1和sn2位置处具有不同的脂肪酸组成，并且在sn1位置处通常具有更多的饱和脂肪酸(C16:0和C18:0)。通过HPLC/MS分析，显示Maxapal有助于面团中C16:0_NALPE的强烈增加。

[0585] 不受理论束缚，预期C16:0_NALPE对面团稳定性的改善比C18:2NALPE更强，因为根据脂肪酸组成，水生动物系统中的NALPE形成不同的介晶相。

[0586] 然而， 本身对面包体积的作用不大，但当与4080或 4090组合使用时，会形成强烈的协同效应。这可以通过由这两
种酶的组合产生的反应产物C16:0_NALPE、MGMG和DGMG来解释。

[0587] 在 某些 系 统中 ，当 和 4 0 80 ( 或和 4090)组合使用时会竞争NAPE底物。这可以在某些
面包制作程序(其中面团以两步混合，例如在所谓的中种程序中)中得到缓解。在这种类型的面包制作中，可以在中种面团侧添加 (或其他对NAPE具有活性的PLA2)，
以最佳生产C16:0_NALPE，然后在面团侧添加 4080或
4090，以生产DGMG和MGMG。在中种面团侧添加 的另一
个优点是反应产物(例如NALPE)在面团混合期间容易获得，这有助于改善面团特性。