玉米蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1基因家族及其应用

摘要

本发明提供玉米蔗糖非发酵‑1相关蛋白激酶1基因家族及其应用，本发明首次报道了玉米蔗糖非发酵‑1相关蛋白激酶1(SnRK1)基因家族包括以下3个成员：ZmSnRK1.1基因，ZmSnRK1.2基因和ZmSnRK1.3基因；并从组织表达、亚细胞定位、过表达拟南芥的表型特征等方面对3个基因的功能进行了研究。本发明揭示了玉米SnRK1成员在感知能量信号、调节碳水化合物代谢、调控开花期和株型方面的功能特征，这为作物高产育种提供了潜在有价值的性状特征和基因资源。

权利要求

1.玉米蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1基因家族在延迟植株衰老，增加植株生物量和种子产量方面的应用，所述玉米蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1基因家族包括3个成员：ZmSnRK1.1基因，ZmSnRK1.2基因和ZmSnRK1.3基因；所述ZmSnRK1.1基因的cDNA序列如SEQ ID No.1所示；所述ZmSnRK1.2基因的cDNA序列如SEQ ID No.3所示；所述ZmSnRK1.3基因的cDNA序列如SEQ ID No.5所示，将所述ZmSnRK1.2基因和ZmSnRK1.3基因转入玉米中获得优质青贮玉米。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是，将所述ZmSnRK1.3基因转入玉米中获得高产玉米，具体为：构建ZmSnRK1.3过表达载体转化入农杆菌菌株AGL1中，通过农杆菌介导的幼胚遗传转化方法获得转玉米ZmSnRK1.3基因的植株；

所述ZmSnRK1.3过表达载体是将ZmSnRK1.3基因序列两端加上BamHI与KpnI接头，连接至载体CUB，获得CUB-pUBI::ZmSnRK1s-p35S::bar骨架载体。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述ZmSnRK1.3基因序列为全长cDNA序列。

说明书

玉米蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1基因家族及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及到玉米蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1基因家族成员的基因克隆、表达分析、功能鉴定及其应用。

背景技术

[0002] 蔗糖非发酵-1(SNF1)相关蛋白激酶1(SnRK1)是一个在进化上保守的重要的能量调节因子(Emanuelle et al.,2016)。它是酵母蔗糖非发酵1蛋白(Hedbacker and Carlson,2008)和哺乳动物AMP-激活蛋白激酶(Hardie et al.,2012)在植物中的同源基因。SNF1/AMPK/SnRK1蛋白激酶作为关键能量传感器，在调控细胞新陈代谢和维持能量平衡过程中发挥重要作用(Polge and Thomas,2007；Hey et al.,2010)。植物中，SnRK1在调控生长发育以及非生物和生物胁迫耐受性过程中发挥至关重要作用(Polge and Thomas,2007；Baena-González and Sheen,2008；Halford and Hey,2009；Hulsmans et al.,
2016)。SnRK1通过对关键酶的直接磷酸化或对基因表达水平的广泛调控来发挥其对下游过程的调节作用(Broeckx et al.,2016)。结构上，SnRK1由N端催化结构域和C端调节结构域组成，并通过与β和γ亚基形成异源复合物来行使功能(Ghillebert et al.,2011；
Emanuelle et al.,2015)。

[0003] 植物中第一个被鉴定的SnRK1基因是从黑麦克隆中出来的(Alderson et al.，1991)，此后，该基因在多个植物物种中的同源基因被鉴定出来(Halford and Hardie,
1998；Halford et al.,2003)，并且其在糖的感知信号传递及碳水化合物代谢等方面的机制逐渐被揭示。拟南芥SnRK1基因家族包括两个有功能的成员，SnRK1.1(或AKIN10)和SnRK1.2(或AKIN11)。拟南芥kin10kin11双突变体无法开启响应饥饿胁迫的转录开关，从而影响夜间淀粉动员，导致叶片中积累了大量的淀粉(Baena-Gonzalez et al.，2007)。与此相反，土豆中反义表达SnRK1基因，导致其蔗糖合成酶基因表达下调，从而降低了块茎中淀粉含量(Purcell et al.,1998)；而过表达SnRK1基因则激活了淀粉合成相关的2个关键酶的活性：蔗糖合成酶和ADP-glucose焦磷酸化酶，从而增加了块茎中淀粉含量(McKibbin et al.,2006)。大麦中反义表达SnRK1基因导致其花粉发育受阻，花粉中只含有少量或不含有淀粉(Zhang et al.，2001)。而豌豆中抑制SnRK1基因表达导致其胚在后期成熟过程中发育受阻并积累了较少的淀粉(Radchuk et al.,2010)。此外，在番茄中过表达MhSnRK1基因使得番茄叶片和成熟果实中淀粉含量的增加(Wang et al.,2012)。以上结果表明，SnRK1在源和库组织之间分配的进行淀粉的资源至关重要。

[0004] 现在越来越多的研究证明了SnRK1参与植物生长发育和开花期调控，这将生长发育、生育期转变与新陈代谢调节和环境因子联系起来。转SnRK1.1(KIN10)基因拟南芥植株表现为开花期和叶片衰老过程延迟(Baena-Gonzalez et al.,2007)，同时发育早期莲座叶叶片变小。与此相反，过表达SnRK1.2(KIN11)拟南芥表现为开花提前，并且莲座叶叶片较大，这与SnRK1.1过表达表型相反(Williams et al.,2014)。推测造成这种差异的原因，可能是两个成员对开花相关基因的调控不同或它们与不同的蛋白协同作用参与不同生物过程(Williams et al.,2014)。最近的报道显示，SnRK1s与开花调控因子可以直接相互作用。FUSCA3编码B3结构域转录因子，调控植物器官发育(如胚胎、子叶、角果和花器官)及生育期转变，SnRK1.1(AKIN10)通过直接互作和磷酸化调控FUSCA3的稳定性，来推迟营养生长和开花(Gazzarrini et al.,2004；Tsai and Gazzarrini,2012)。IDD8是一个包含INDETERMINATE DOMAIN(IDD)-结构域的转录因子，并通过调节SUC(蔗糖合成)基因表达影响开花期。IDD8缺陷突变体表现为开花提前，而过表达则开花推迟(Seo et al.,2011)。
SnRK1.1(AKIN10)可以磷酸化IDD8以降低其转录激活活性，暗示了SnRK1.1通过拮抗IDD8功能来控制开花时间(Jeong et al.，2015)。此外，bZIP63突变体在黑暗诱导的衰老过程中表现出延迟，而SnRK1.1可以直接磷酸化bZIP63并在饥饿诱导的衰老过程中抑制其表达(Mair et al.,2015)。乙烯-EIN3信号途径在衰老过程的调节中发挥重要作用，SnRK1.1通过磷酸化抑制EIN3活性，从而导致叶片衰老延迟(Kim et al.,2017)。

[0005] 玉米是重要的经济作物，其中青贮玉米可以直接用于养殖业也可以经发酵制成饲料或工业原料。因此，加大生物技术在玉米种质创新和品种培育中的力度是十分必要的。但是，目前，在玉米中蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶基因家族尚未有相关报道。因此，克隆、鉴定玉米中的SnRK1基因家族，研究不同SnRK1蛋白在玉米生长发育和代谢中的作用机理，揭示玉米SnRK1成员感知能量信号、调节碳水化合物代谢、调控开花期和株型方面的功能特征，将为玉米高产育种及提高玉米经济效益等具有重要意义。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供玉米蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1(SnRK1)基因家族及其应用。本发明利用同源克隆的方法，从玉米基因组中克隆出了3个SnRK1基因家族成员ZmSnRK1s，并从组织表达、亚细胞定位、过表达拟南芥表型特征、及转基因玉米的表型特征等方面对3个基因的功能进行了研究，为玉米高产育种及提高玉米经济效益等提供选择。

[0007] 本发明所述玉米蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1(SnRK1)基因家族包括以下3个成员：ZmSnRK1.1基因，ZmSnRK1.2基因和ZmSnRK1.3基因；其中，所述ZmSnRK1.1基因的cDNA序列如SEQ ID No.1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述ZmSnRK1.2基因的cDNA序列如SEQ ID No.3所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述ZmSnRK1.3基因的cDNA序列如SEQ ID No.5所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

[0008] ZmSnRK1.1、ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3编码蛋白分别包括509、503和499个氨基酸。与拟南芥AKIN10相比，分别有73％、75％和74％的同源性(图1)。ZmSnRK1.1与高粱SbSnRK1b同源性最高，全蛋白序列有96％的同源性。而ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3与水稻OSK1最为相似，分别具有90％和85％的同源性。

[0009] ZmSnRK1s的表达模式分析及其亚细胞定位结果表明，ZmSnRK1s家族成员ZmSnRK1.1，ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3在所有检测的组织中广泛表达，并在幼嫩雌穗中表达最高。三种ZmSnRK1蛋白在细胞核和细胞质中都有定位。

[0010] 对ZmSnRK1s逆境响应和诱导表达模式分析，表明三个成员中，只有ZmSnRK1.1受饥饿胁迫(黑暗)诱导而高表达，并且添加葡萄糖可以抑制由于黑暗诱导的ZmSnRK1.1的高表达，说明ZmSnRK1.1是玉米中感知和响应体内能量水平的重要因子。

[0011] 拟南芥中异源过表达3个ZmSnRK1s基因表现出对葡萄糖和蔗糖的超敏感，转基因拟南芥植株叶片和成熟种子中积累的较多的蔗糖，而葡萄糖含量降低。与野生型相比，过表达ZmSnRK1.1拟南芥植株开花期提前，而过表达ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3使植株开花期推迟，且转基因植株衰老延迟，植株生物量和种子产量增加。进一步研究发现，ZmSnRK1通过调控一些碳水化合物代谢、开花和衰老相关的基因的表达水平来控制拟南芥生长发育。

[0012] 本发明揭示了玉米SnRK1成员在感知能量信号、调节碳水化合物代谢、调控开花期和株型方面的功能特征，这为作物高产育种提供了潜在有价值的性状特征和基因资源。

[0013] 本发明另一方面，还提供包含所述玉米SnRK1基因家族的重组表达载体；所述重组表达载体分别包含ZmSnRK1.1基因，ZmSnRK1.2基因和ZmSnRK1.3基因的全长cDNA序列。将所述基因序列两端分别加上BamHI与KpnI接头，连接至载体CUB，获得CUB-pUBI::ZmSnRK1s-p35S::bar骨架载体。

[0014] 本发明的重组表达载体可以用于玉米ZmSnRK1s基因的过量表达、反义抑制、RNA干扰和CRISP/CAS9基因编辑等。

[0015] 本发明还提供，含有所述重组表达载体的转化体。将所述重组表达载体转化入农杆菌中得到。该转化体用于获得转基因植株。

[0016] 研究表明ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3使植株开花期推迟，且转基因植株衰老延迟，植株生物量和种子产量增加。其中，ZmSnRK1.3分别与轴重、轴粗、粒宽和株高显著关联，由此说明该基因的自然变异能够影响玉米果穗性状的生长和发育。

[0017] 因此，本发明再一方面，还提供所述玉米SnRK1基因家族在延迟植株衰老，增加植株生物量和种子产量方面的应用。

[0018] 例如，将所述ZmSnRK1.2基因和ZmSnRK1.3基因转入玉米中获得优质青贮玉米。

[0019] 例如，将所述ZmSnRK1.3基因转入玉米中获得高产玉米。

[0020] 本发明具有如下有益效果：

[0021] 本发明首次公开了玉米蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1基因家族的三个成员及其核苷酸、编码氨基酸序列，揭示了其进化关系、表达的器官组织特异性和诱导特性等。并采用转基因方法在拟南芥中研究了该基因家族成员对碳水化合物代谢、开花和衰老的影响。并在玉米中进行转基因实验，获得了生育期延长的玉米植株。

[0022] 本发明揭示了玉米SnRK1成员在感知能量信号、调节碳水化合物代谢、调控开花期和株型方面的功能特征，这为作物高产育种提供了潜在有价值的性状特征和基因资源。

[0023] 本发明为进一步理解玉米SnRK1基因在调控碳水化合物代谢、开花和衰老中的调控机制提供了理论基础，并对培育衰老延迟和高产转基因新品种均有重要指导意义。

附图说明

[0024] 图1为高等植物的SnRK1蛋白序列的进化树。用ClustalX2将SnRK1蛋白序列进行比对，利用MEGA7.0中的邻接法构建系统进化树。

[0025] 图2为玉米ZmSnRK1s转录分析和亚细胞定位。其中，图2a表示通过qRT-PCR对ZmSnRK1.1，ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3基因的组织特异性表达分析。使用FPGS转录物作为内部对照，并将幼穗中ZmSnRK1.1的转录丰度用作校准。数值是具有三个生物学重复的标准偏差(SD)的平均值。图2b表示三种ZmSnRK1蛋白的亚细胞定位，标尺＝10μm。

[0026] 图3为糖、ABA和黑暗处理对玉米ZmSnRK1.1，ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3表达水平的影响。

[0027] 图4为拟南芥中过表达ZmSnRK1基因后对糖敏感影响。a转基因植株的PCR鉴定。OE1.1，OE1.2和OE1.3分别为转ZmSnRK1.1，ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3基因拟南芥植株。M：
DL200marker；1：阳性质粒对照；2：野生型对照；3-11：转基因植株。b野生型及转基因株系的半定量RT-PCR分析。AtUBQ10为内参。c葡萄糖(Glc)、蔗糖(Suc)及山梨醇(Sorb)对野生型及转基因植株苗期表型及根长的影响。标尺＝1cm.

[0028] 图5为拟南芥中过表达ZmSnRK1基因对开花期、衰老及碳水化合物代谢的影响。a野生型及转基因植株整体表型。标尺＝10cm。b、c为野生型及转基因植株开花期、莲座叶数目、叶绿素含量比较。d-f为叶片及种子中葡萄糖(d)、蔗糖(e)和淀粉(f)含量。图中所示数据为3次实验重复的平均值±标准差。*和**分别表示与野生型相比“ANOVA”测验差异显著(0.01

[0029] 图6为拟南芥中碳代谢、衰老和开花期相关基因的qRT-PCR分析。a碳代谢相关基因。b衰老相关基因。c开花期相关基因。AtUBQ10为内参。图中所示数据为3次实验重复的平均值±标准差。

[0030] 图7为营养生长期拟南芥表型及碘化钾染色结果。a营养生长期野生型及转基因植株表型。b拟南芥植株在黑暗后及光照后的碘化钾染色结果。图中标尺为5厘米。

[0031] 图8为成熟期野生型及转基因拟南芥植株整体表型。图中标尺为10厘米。

[0032] 图9为368份玉米自交系中的三个基因的基因型和表型TASSEL软件分析结果。

[0033] 图10和图11为转ZmSnRK1s基因玉米植株的PCR鉴定结果。

[0034] 图12为转ZmSnRK1.3基因玉米植株的苗期表型。

[0035] 图13为转ZmSnRK1.3基因玉米植株的田间成熟期表型。

具体实施方式

[0036] 下面结合具体实验和附图对本发明技术方案和技术效果做进一步说明，下述说明仅用于解释本发明，不应理解为对本发明保护范围的限制。下述实验中如无特殊说明，所用方法均为本领域常规方法，如《分子克隆实验指南》记载的方法。本发明中所用试剂，如无特殊说明，均为本领域常规试剂，可以从商业途径获得。本发明所用仪器、设备等，如如无特殊说明，均为本领域常规仪器、设备。

[0037] 1.玉米蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1(SnRK1)基因ZmSnRK1s克隆和进化树分析[0038] 利用拟南芥Akin10/Akin11氨基酸序列，通过在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或Maize GDB(https://www.maizegdb.org/)数据库中进行同源搜索，从玉米自交系B73中鉴定出SnRK1的同源基因。然后，从玉米叶片cDNA文库中克隆得到三个基因的全长，分别命名为ZmSnRK1.1(GRMZM2G107867),ZmSnRK1.2(GRMZM2G077278)和ZmSnRK1.3(GRMZM2G180704)。其cDNA序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示。

[0039] ZmSnRK1.1、ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3编码蛋白分别包括509、503和499个氨基酸。序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示，与拟南芥AKIN10相比，分别有73％、75％和74％的同源性(图1)。N末端激酶催化域在不同的真核生物中是保守的，例如玉米SnRK1s、拟南芥AKIN10、水稻OSK1、高粱SbSnRK1b和酵母SNF1。但是，C末端调控区域在植物蛋白质中显示高度差异。ZmSnRK1.1与高粱SbSnRK1b同源性最高，全蛋白序列有96％的同源性。而ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3与水稻OSK1最为相似，分别具有90％和85％的同源性。

[0040] 2.ZmSnRK1s基因重组表达载体构建

[0041] 以三个基因序列的cDNA区设计引物，分别在两端加上BamHI与KpnI接头，将扩增片段回收酶切，连接至载体CUB，即获得CUB-pUBI::ZmSnRK1s-p35S::bar骨架载体。接头及扩增引物序列如下表1：

[0042] 表1

[0043]

[0044] 3.ZmSnRK1s的表达模式分析及其亚细胞定位

[0045] 在幼穗(长 )、旗叶、丝、苞片、未成熟雄穗和成熟雄蕊等各种玉米组织中研究了ZmSnRK1s的组织特异性转录丰度。三个ZmSnRK1s家族成员基因在幼穗中的表达量最高，在旗叶和苞片表达量中等水平。ZmSnRK1.1和ZmSnRK1.2的转录水平在雄蕊中较低，而ZmSnRK1.3在雄蕊和雄蕊中转录水平较高。如图2a所示。

[0046] ZmSnRK1蛋白的亚细胞定位与其生物学功能高度相关。我们将GFP融合到三个ZmSnRK1的C末端并在玉米原生质体中瞬时表达。绿色荧光信号表明所有三种蛋白在细胞核和细胞质中都有定位。如图2b所示。

[0047] 4.ZmSnRK1s受糖、ABA和黑暗处理的诱导表达分析

[0048] 已有研究表明，SnRK1在能量感知和ABA信号途径中发挥了重要作用(Baena-González et al.,2007；Radchuk et al.,2010)，因此我们研究了糖、ABA及黑暗处理对玉米ZmSnRK1s 3个基因表达水平的影响。将2周大的玉米幼苗分别转移到含6％(w/v)葡萄糖、6％(w/v)蔗糖、6％(w/v)山梨醇、10μM ABA的1/2MS培养基中，另取2组(不含葡萄糖和含6％葡萄糖)进行黑暗处理，在处理的0，1，2和4小时取材，提取RNA并利用qRT-PCR方法检测ZmSnRK1.1，ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3基因的表达水平变化。

[0049] 结果如图3所示，与未处理对照和6％山梨醇(渗透胁迫对照)相比，3个基因受葡萄糖诱导表达均不显著。ABA可以抑制3个基因的表达，但均未达到显著水平。在黑暗处理条件下，ZmSnRK1.1表达水平受黑暗处理(饥饿胁迫)高诱导表达，在处理4小时时增加了30倍，而这种高表达又受到葡萄糖的显著抑制。与此相反，ZmSnRK1.2表达水平受黑暗处理的抑制，而这种抑制作用可以被葡萄糖缓解。

[0050] 以上结果表明，黑暗处理诱导ZmSnRK1.1的高表达，并且这种高表达受葡萄糖的抑制；而黑暗处理抑制ZmSnRK1.2的表达水平，并且这种抑制可以被葡萄糖缓解。而葡萄糖和ABA对3个基因的表达水平均没有显著影响。

[0051] 5.拟南芥中ZmSnRK1s过表达使得转基因植株对葡萄糖变得敏感

[0052] 分别将构建的ZmSnRK1s基因重组表达载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导转化法获得转玉米ZmSnRK1.1，ZmSnRK1.2或ZmSnRK1.3基因的拟南芥植株，并利用PCR方法对阳性植株进行鉴定(图4a)，每个转基因实验至少获得20个阳性株系，各取一个株系开展以下实验并对3个基因的功能进行研究分析，分别将这3个株系分别命名为OE1.1，OE1.2和OE1.3。半定量RT-PCR结果表明，3个株系中分别表达了较高水平的ZmSnRK1.1，ZmSnRK1.2或ZmSnRK1.3，而野生型中未有表达(图4b)。

[0053] 植物中，SnRK1可以感知体内能量水平并通过调节代谢来维持植物生长发育及生殖所必需的能量供应((Baena-Gonzalez et al.,2007；Zhang et al.,2001)。当将野生型和转基因拟南芥植株分别在含有或不含有4％葡萄糖的1/2MS培养基上培养时，转基因株系表现出生长受抑制，根长变短(图4c)。经测量根长，与野生型相比，转SnRK1基因株系表现出显著减小的根长，即对葡萄糖敏感性增加。而当生长在含4％山梨醇的培养基上时，野生型与转基因株系在根长上没有显著差异，因此排除了由于渗透胁迫导致的根长的差异。以上结果与拟南芥中过表达AKIN10及水稻中过表达OsSnRK1表现出的对高糖处理敏感的结果一致(Jossier et al.,2009；Cho et al.,2012)。

[0054] 6.拟南芥中ZmSnRK1s过表达影响碳水化合物代谢

[0055] 我们检测了生长45天的野生型和转基因植株的莲座叶及成熟种子中葡萄糖、蔗糖和淀粉含量的变化(图5)。结果表明，与野生型相比，转基因植株OE1.1，OE1.2和OE1.3中葡萄糖的含量均显著下降，叶片中葡萄糖含量降低为野生型的67％-77％，成熟种子中降低为野生型的53％-65％(图5d)。相反，转基因株系中蔗糖含量显著增加，与野生型相比，叶片中分别增加了134％，151％和167％，成熟种子中分别增加了74％，106％和133％(图5e)。转基因植株叶片和种子中的淀粉含量有所增加，但与野生型相比，无显著差异(图5f)。对营养生长期野生型及转基因植株叶片碘化钾的染色结果表明，经过一晚上的黑暗后，转基因植株叶片染色为深棕色，而野生型为浅棕色，说明经过一晚上的淀粉消耗，转基因植株仍然积累了较多的淀粉；而经过一天的光照之后，野生型和转基因植株均染色为深棕色，表型无显著差异(图7)。7.拟南芥中ZmSnRK1s过表达影响开花和衰老

[0056] 已有研究表明，过表达AKIN10/SnRK1.1拟南芥植株开花期推迟，而过表达AKIN11/SnRK1.2则使拟南芥开花期提前(Baena-Gonzalez et al.,2007；Williams et al.,2014)。目前，对过表达玉米ZmSnRK1基因对开花期的影响还不清楚。本研究中，对转ZmSnRK1基因拟南芥的研究表明，当在正常生长条件下(12小时光照/12小时黑暗)培养时，与野生型相比，转ZmSnRK1.1基因拟南芥植株开花期提前了3天，而转ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3基因拟南芥植株开花期分别推迟了5天和17天(图5a,b)。开花时莲座叶的数目在不同株系间达到差异显著，其中转ZmSnRK1.3基因拟南芥植株开花时的莲座叶数目显著增加(图5b)。叶绿素含量是叶片衰老程度的一个指标，对生长45天的野生型及转基因植株莲座叶中叶绿素含量的检测结果表明，相比野生型，转ZmSnRK1.1，ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3基因植株叶片中积累了较多的叶绿素含量，叶片具有更长的持绿期，暗示了较长时间的光合作用。

[0057] 8.拟南芥中ZmSnRK1s过表达对农艺性状的影响

[0058] 表2.野生型(Col)及转ZmSnRK1.1，ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3基因植株成熟期农艺性状检测结果

[0059]

[0060] 以上数值均为6次试验重复的平均值±标准差。*和**分别表示与野生型相比，“ANOVA”测验差异显著(0.01

[0061] 由于转基因植株衰老延迟及维持了较长时间的光合作用，因此，成熟期转基因植株获得了较高的生物量(表2；图8)。尽管转ZmSnRK1.1植株拟南芥开花期稍提前，但其整体株型比野生型大，因此生物量和千粒重(增加了11％)均显著增加，每株角果数和每角果中种子数均有增加，但未达到显著差异水平。由于转ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3基因植株具有显著的开花期、衰老延迟及增大的株型，因此，与野生型相比，OE1.2和OE1.3成熟期生物量分别增加了75％和95％。每株角果数分别增加了41％和62％。另外，OE1.3每角果中的种子数目比野生型增加了16％。与野生型相比，OE1.2和OE1.3的千粒重分别增加了14％和16％(表2)。

[0062] 9.拟南芥中ZmSnRK1基因过表达影响碳代谢、衰老和开花期相关基因的表达[0063] 为了进一步理解过表达ZmSnRK1基因对拟南芥表型影响的分子机制，我们提取了生长45天的野生型及转基因植株莲座叶的RNA并进行了RNA-seq分析，以期在全基因组转录本变化水平上对ZmSnRK1可能调控的信号途径进行解析。我们将转基因植株的RNA-seq数据分别与野生型进行比较，并筛选出表达差异倍数在2倍以上的基因。与野生型相比，转ZmSnRK1.1基因株系中分别有42个表达上调的基因和105个表达下调的基因；与此相反，转ZmSnRK1.2基因植株中上调的基因数为102，而下调的基因数为66；转ZmSnRK1.3基因植株中上调的基因数为210，下调的基因数为101，上调基因的数目均大于下调基因的数目，表现出与OE1.1不同。在各株系所有差异表达的基因中，23个下调基因和5个上调基因是在3个转基因株系中同时存在且均有相同的表达趋势的。这些共同的差异表达基因按生物学功能分别归类到防御相应、代谢、开花和衰老等过程，我们对其中一些基因进行了进一步的qRT-PCR验证。

[0064] AMY1(At4g25000)属于在各转基因株系间均下调表达的基因。该基因编码α-淀粉酶，在衰老和处于生物、非生物胁迫的叶片中诱导表达，可能参与细胞死亡后淀粉的降解过程(Doyle et al.,2007)。与RNA-seq结果一致，该基因在转ZnSnRK1.1，ZnSnRK1.2和ZnSnRK1.3基因株系中的表达水平分别降低了4倍、7倍和9倍。(图6a)。拟南芥DIN6/ASN1(AT3G47340)编码天冬酰胺依赖的谷氨酰胺合成酶，该基因受各种胁迫的诱导表达而受糖的抑制。DIN6受KIN10/KIN11的激活并且可以作为体内KIN10/KIN11活性的指示剂(Baena-Gonzalez et al.,2007)。与野生型相比，3个转基因株系中DIN6的表达水平增加了2.7-4倍，表明，转基因拟南芥植株中具有较高的SnRK1活性，且玉米SnRK1在调控DIN6表达水平上，表现出与拟南芥KIN10/KIN11功能上的保守性。

[0065] 与过表达株系表现出的衰老延迟的表型相一致，我们在RNA-seq数据中发现了一些与叶片衰老相关的基因的表达水平发生明显变化，如SAG13和WRKY53。SAG13是拟南芥中衰老相关基因(SAGs)成员之一，该基因在衰老叶片中特异上调表达(Weaver,et al.,1998；Chen et al.,2017)。与野生型相比，转基因植株中SAG13表达水平显著下调，且在OE1.2和OE1.3中下调倍数达到3和4。WRKY53是第一个被鉴定到的正向调控叶片衰老的WRKY转录因子(Miao et al.,2004)。转基因植株OE1.2和OE1.3中，该基因表达水平显著下降，与野生型植株相比，分别下降了4.2倍和2.5倍，而该基因的OE1.1中的表达水平变化小于2倍。

[0066] 开花过程是高等植物由营养生长向生殖生长转变并受到精细调控的过程。转ZmSnRK1.2和ZmSnRK1.3拟南芥表现出不同程度的开花延迟，与此相符，我们在OE1.3上调表达的基因中，发现一些与开花和生物周期节律相关的基因发生明显的表达变化(图6c)。FLC编码一个MADS-box转录因子，是开花的抑制因子(Michaels and Amasino,1999)。拟南芥ATXR7/SDG25编码H3K4甲基化酶，通过H3K4甲基化修饰来激活FLC表达，从而抑制开花过程(Tamada etal.,2009；Berr et al.,2009)。SUPPRESSOR OF FRIGIDA 4(SUF4)编码一个含锌指结构转录因子，它可以通过直接结合FLC启动子并激活其表达来抑制开花过程(Kim et al.,2006；Kim and Michaels 2006)。在转基因拟南芥OE1.3植株中，ATXR7/SDG25和SUF4的表达水平均显著上调，表达倍数变化分别达到10和19，而在OE1.1和OE1.2中，两个基因的表达水平均未有显著变化(图6c)。通过对FLC表达水平进行检测，发现OE1.3中该基因表达水平上升了3倍，暗示了上调表达的ATXR7/SDG25和SUF4对FLC表达起激活作用，从而抑制了开花，使开花延迟。此外，在RNA-seq数据中，我们发现了一些参与生物周期节律和光周期依赖的开花过程的基因的表达发生明显变化，例如FIONA1(FIO1)和NIGHT LIGHT–INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED2(LNK2)(Kim et al.,2008；Rugnone et al.,2013)。两个基因在OE1.3中分别上调表达了2.5倍和2.4倍。以上结果说明，参与开花期和生物周期调控的基因在ZmSnRK1介导的开花期控制中发挥了重要作用。

[0067] 10.ZmSnRK1s候选基因关联分析结果

[0068] 为推测ZmSnRK1s基因对玉米生长发育的调控的作用，我们利用已有数据库http://modem.hzau.edu.cn/maizego/中的368份来自世界各地的玉米自交系中的三个基因的基因型和表型下载并利用TASSEL软件进行分析，结果如图9所示，当阈值P<0.01时，ZmSnRK1.3分别与轴重、轴粗、粒宽和株高等显著关联，由此说明该基因的自然变异能够影响玉米果穗性状的生长和发育。

[0069] 11.ZmSnRK1s过表达玉米的分子证据

[0070] 为进一步研究ZmSnRK1s对玉米生长发育的调控的作用，本发明将构建的ZmSnRK1.3过表达载体转化入农杆菌菌株AGL1中，通过农杆菌介导的幼胚遗传转化方法获得转玉米ZmSnRK1.3基因的植株，并利用PCR和Southern杂交方法对阳性植株进行鉴定。图10、图11可见本发明成功得到了转基因玉米阳性植株，外源筛选标记基因的拷贝数是单拷贝。

[0071] 12.ZmSnRK1s过表达玉米的表型

[0072] 转基因玉米温室种植材料苗期和田间成熟期观测结果分别见图12和13，图中可见转入ZmSnRK1.3基因的玉米，较对照相比，生育期延长，植株生物量增加。该发现为进一步理解玉米SnRK1基因在调控碳水化合物代谢、开花和衰老中的调控机制提供了理论基础，并对培育衰老延迟和高产转基因新品种均有重要指导意义。