一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因及其应用

摘要

本发明提供了一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因及其应用，属于基因工程技术领域，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明提供的基因能够使萝卜晚抽薹开花。

权利要求

1.一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的基因在鉴别萝卜早抽薹或晚抽薹性状中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴别萝卜抽薹性状的方法，包括以下步骤：将待测萝卜的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物，所述PCR扩增使用的引物为1F和

1R，所述1F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述1R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

当所述扩增产物的片段为2417bp，且包含权利要求1所述的基因时，所述萝卜抽薹性状为晚抽薹性状；

当所述扩增产物的片段为790bp，且不包含权利要求1所述的基因时，所述萝卜抽薹性状为早抽薹性状。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系每30μL包括：

100ng 基因组DNA，2μL 10×PCR Buffer，1.6μL dNTPs，浓度为10μM的1F 0.4μL，浓度为10μM的1R 0.4μL，1.5μL Taq酶，24.1μL ddH2O。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94 ℃预变性

4min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸l0min；4℃保存。

6.权利要求1所述的基因在萝卜育种中的应用，所述萝卜育种的方法包括：利用权利要求3所述的步骤，选择基因组中包含权利要求1所述基因的待测萝卜作为亲本进行育种。

说明书

一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因及其应用。

背景技术

[0002] 萝卜起源于我国，是我国重要的蔬菜作物，长期以来是我国城乡居民的“当家菜”。年播种面积1600万亩，占我国整个蔬菜生产的6％。萝卜是长日照植物，通过低温春化后在长日照条件下由营养生长转向生殖生长，从而抽薹开花。未熟抽薹开花对萝卜生产最重要的影响是营养生长向生殖生长的转变，抑制肉质根的膨大，导致产量和品质下降。发现萝卜晚抽薹基因以及培育萝卜晚抽薹品种是解决这一问题的根本途径。

[0003] 基于高通量RNA测序技术，在萝卜中鉴定了与晚抽薹开花性状相关的基因，发现了大量差异表达基因及控制抽薹开花的关键基因如FT、CO、SOC1、FLC和LFY。通过转录组分析，发现3个同源FLC基因(RsFLC1、RsFLC2和RsFLC3)，分别位在Rs7、Rs2和Rs3染色体上(Yi et al.2014；Kitashiba et al.2014)。RsFLC基因位点上存在明显的序列变异，但是未找到与萝卜晚抽薹性状相关的新的基因序列。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因，该基因能够使萝卜晚抽薹开花。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

[0007] 本发明还提供了上述技术方案所述的基因在鉴别萝卜抽薹性状中的应用。

[0008] 优选的，所述鉴别萝卜抽薹性状的方法，包括以下步骤：

[0009] 将待测萝卜的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物，所述PCR扩增使用的引物为1F和1R，所述1F具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述1R具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

[0010] 当所述扩增产物的片段为2417bp，且包含上述技术方案所述的基因时，所述萝卜抽薹性状为晚抽薹性状；

[0011] 当所述扩增产物的片段为790bp，且不包含上述技术方案所述的基因时，所述萝卜抽薹性状为早抽薹性状。

[0012] 优选的，所述PCR扩增的反应体系每30μl包括：100ng基因组DNA，2μl 10×PCR Buffer，1.6μl dNTPs，浓度为10μM的1F 0.4μl，浓度为10μM的1R 0.4μl，1.5μl Taq酶，24.1μl ddH2O。

[0013] 优选的，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。本发明还提供了上述技术方案所述的基因序列在萝卜育种中的应用，所述萝卜育种的方法包括：利用上述技术方案所述的步骤，选择基因组中包含上述技术方案所述基因的待测萝卜作为亲本进行育种。

[0014] 本发明提供了一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因，该基因与萝卜晚抽薹开花性状相关。萝卜为两年生作物，抽薹开花鉴定时间较长，利用本发明作为鉴定萝卜品种抽薹性状和辅助选择育种亲本应用时，能够在苗期对待测品种进行抽薹性鉴定，节省植株田间管理成本和时间。

[0015] 本发明实施例的结果显示：本发明提供的基因能够使萝卜晚抽薹开花。

附图说明

[0016] 图1为萝卜抽薹开花时间性状QTL定位信息，A：抽薹开花时间初步定位于InDel162和InDel170标记之间；B：局部加密的萝卜R02染色体，候选基因RsFLC2位于标记InDel520和InDel535之间；

[0017] 图2为琼脂糖凝胶电泳检测基因分型情况。

具体实施方式

[0018] 本发明提供了一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因，具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列具体如下所示：

[0019]

[0020]

[0021] 上述技术方案所述基因与萝卜的抽薹性状相关，含有上述技术方案所述基因的萝卜的抽薹性状表现为晚抽薹性状。

[0022] 本发明还提供上述技术方案所述的基因在鉴别萝卜抽薹性状中的应用。

[0023] 在本发明中，所述鉴别萝卜抽薹性状的方法，包括以下步骤：

[0024] 将待测萝卜的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物，所述PCR扩增使用的引物为1F和1R，所述1F具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述1R具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

[0025] 当所述扩增产物的片段为2417bp，且包含权利要求1所述的基因时，所述萝卜抽薹性状为晚抽薹性状；

[0026] 当所述扩增产物的片段为790bp，且不包含权利要求1所述的基因时，所述萝卜抽薹性状为早抽薹性状。

[0027] 本发明对所述待测萝卜的基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规使用的提取方法即可，如CTAB法。

[0028] 在本发明中，所述PCR扩增使用的引物为1F和1R，所述1F具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体如下所示：

[0029] 5’-ATGGGAAGAAAAAAACTAGAGAT-3’；

[0030] 所述1R具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体如下所示：

[0031] 5’-TGCATTAATCCGTGGTAAATT-3’。

[0032] 在本发明中，所述PCR扩增的反应体系每30μl优选包括：100ng基因组DNA，2μl 10×PCR Buffer，1.6μl dNTPs，浓度为10μM的1F 0.4μl，浓度为10μM的1R 0.4μl，1.5μl Taq酶，24.1μl ddH2O。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

[0033] 在本发明中，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。本发明还提供了上述技术方案所述的基因在萝卜育种中的应用，所述萝卜育种的方法包括：利用上述技术方案所述的步骤，选择包含上述技术方案所述基因的育种材料作为亲本。

[0034] 下面结合实施例对本发明提供的一种与萝卜晚抽薹性状相关的基因及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0035] 实施例1

[0036] 与萝卜耐抽薹性状相关的基因序列的获得

[0037] 本发明利用常规的图位克隆的方法对萝卜耐抽薹性状相关的基因进行鉴定和克隆。

[0038] 1、遗传分离群体构建与表型鉴定

[0039] 以来自日本晚抽薹材料“Ninengo”和中国早抽薹材料“Maer”为双亲，构建包含183个单株的F2群体。于2016年春对亲本、F1、F2群体单株进行抽薹和开花性状调查。调查方法为：每隔一天调查单株的现蕾和开花情况。现蕾时间为从定植到肉眼可见花蕾所需的天数；开花时间为从定植到第一朵花开放所需的天数。晚抽薹材料“Ninengo”的现蕾时间和开花时间分别为91天和110天，早抽薹材料“Maer”的现蕾时间和开花时间分别为44天和66天。F2群体单株的抽薹时间变异为43～105天，平均81.27天；开花时间变异为70～121天，平均
96.7天；表现为连续分布数量性状遗传的特点。

[0040] 2、遗传连锁图谱构建与数量性状定位(QTL)

[0041] 插入缺失标记(InDel)的开发：利用Illumina Hiseq 2500测序平台对亲本“Ninengo”和“Maer”进行全基因组重测序，以‘Aokubi DH’参考基因组(The radish genome and comprehensive gene expression profile of tuberous root formation and development，Scientific Reports(2015)5：10835)为参照检测双亲的多态性。初步设计500对InDel标记，InDel标记设计原则为每个标记在‘Aokubi DH’参考基因组中的间隔距离为300～800kb，退火温度为58～60℃，双亲间的碱基差异为3～8bp，扩增片段大小为100～
200bp，以便利用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

[0042] 遗传连锁图谱构建与QTL分析：取亲本及F2群体各单株的幼嫩叶片，利用常规的CTAB法提取总DNA。利用已公开的626对EST-SSR(Shirasawa K等，An EST-SSR linkage map of Raphanus sativus and comparative genomics of the Brassicaceae，DNA Research，(2011)18：221-232)和本发明初步设计的500对InDel标记检测亲本“Ninengo”和“Maer”之间的多态性。通过对双亲PCR扩增与8％聚丙烯酰胺凝胶电泳获得131对多态性引物用于183个F2群体单株的标记分型。利用Joinmap 4.0软件构建一张含有9条连锁群的遗传图谱。利用MapQTL4.0软件将萝卜耐抽薹相关基因定位在萝卜R02染色体InDel170和InDel162之间，结果见图1A。

[0043] 萝卜耐抽薹性状相关的基因精细定位：根据‘Aokubi DH’参考基因组信息(The radish genome and comprehensive gene expression profile of tuberous root formation and development，Scientific Reports(2015)5：10835)和‘XYB36-2’参考基因组信息(Zhang Xiaohui等，A de novo Genome of a Chinese Radish Cultivar，Horticultural Plant Journal，2015，1(3)：155-164)，对初步定位区间InDel170-InDel162进行标记加密，共设计43个InDel标记，见表1。构建了局部加密的连锁图谱，结果见图1中的B，QTL分析将萝卜抽薹和开花时间性状定位在R02染色体InDel520和InDel535之间。

[0044] 表1 43对InDel标记的序列

[0045]

[0046]

[0047]

[0048] 3、萝卜耐抽薹性状相关基因鉴定与序列分析

[0049] 萝卜耐抽薹性状相关候选基因鉴定：根据萝卜基因组基因注释(The radish genome and comprehensive gene expression profile of tuberous root formation and development，Scientific Reports(2015)5：10835)，在定位区域InDel520与InDel535区间，RSG31600(Rs_scaf675：106，055-109，484)被注释为RsFLC2基因，该基因是重要的开花调控基因。

[0050] RsFLC2基因序列分析：根据已公开的RsFLC2基因序列(Yi等，Identification of three FLOWERING LOCUS C genes responsible for vernalization response in radish(Raphanus sativus L.)，Hort Environ Biotechnol，2014，55：548-556)设计引物1F和1R，1F的序列如SEQ ID No.2所示，具体为5’-ATGGGAAGAAAAAAACTAGAGAT-3’，1R的序列如SEQ ID No.3所示，具体为5’-TGCATTAATCCGTGGTAAATT-3’，以及设计引物2F和2R，2F的序列如SEQ ID No.90所示，具体为5’-AATTTACCACGGATTAATGCA-3，2R的序列如SEQ ID No.91所示，具体为5’-CTAATAAAGCAGTGGGAGAGTTAC-3’，通过常规的PCR扩增、克隆和测序技术分别获得晚抽薹亲本‘Ninengo’和早抽薹亲本“Maer”RsFLC2基因序列，晚抽薹亲本‘Ninengo’RsFLC2基因序列如SEQ ID No.92所示，具体为：

[0051]

[0052]

[0053]

[0054] 早抽薹亲本“Maer”RsFLC2基因序列如SEQ ID No.93所示，具体为：

[0055]

[0056]

[0057]

[0058] 序列对比，发现在‘Ninengo’中，RsFLC2基因的第一个内含子中有一个1627bp片段的插入，插入位点位于翻译起始位置的434bp处。

[0059] RsFLC2基因序列同源性分析：进一步将“Ninengo”和“Maer”RsFLC2基因序列与NCBI公布的7份萝卜材料的RsFLC2基因序列(KP027027～KP027032，KP027034，序列来自文献，Yi等，Identification of three FLOWERING LOCUS C genes responsible for vernalization  response in radish(Raphanus sativus L.)，Hort Environ Biotechnol，2014，55：548-556)进行多重比对，未发现在其他材料中存在该1627bp插入序列。另外为了鉴定‘Ninengo’RsFLC2中1627bp插入序列的同源序列，利用BLASTn(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)比对后显示，在e-100阈值下3条序列(来自B.napus或B.oleracea)具有83-84％序列相似性，但覆盖度仅为48.7％。

[0060] 实施例2

[0061] RsFLC2中1627bp插入序列在鉴定萝卜晚抽薹和早抽薹材料中的应用

[0062] 1、RsFLC2中1627bp插入序列在晚抽薹和早抽薹萝卜中的鉴定

[0063] 1)DNA提取

[0064] 常规CTAB法分别提取表2中183种待测萝卜材料的基因组DNA，表2中的183种待测萝卜材料是利用亲本Ninengo和Maer杂交获得F1代，F1自交获得的F2单株。

[0065] 2)PCR扩增与检测

[0066] 利用1F(5’-ATGGGAAGAAAAAAACTAGAGAT-3’)和1R(5’-TGCATTAATCCGTGGTAAATT-3’)引物对待测萝卜材料进行PCR扩增。

[0067] PCR反应体系：包含100ng基因组DNA，2μl 10×PCR Buffer，1.6μl dNTPs，上述上下游引物各0.4μl(10μM)，1.5UTaq酶，加ddH2O至30μl。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。扩增结束后，利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测基因分型情况，结果见图2。

[0068] 从图2中可以得出，F2群体中晚抽薹材料均扩增获得2417bp的片段，其中包含1627bp的插入片段，在早抽薹材料中均扩增获得790bp的片段。

[0069] 2、萝卜抽薹性状鉴定

[0070] 以现蕾时间作为萝卜抽薹早晚的指标，调查标准为从定植到肉眼可见花蕾所需的天数，结果见表2。

[0071] 调查的分级标准如下：

[0072] 早抽薹：现蕾时间为43天至69天；

[0073] 中抽薹：现蕾时间为70天至91天；

[0074] 晚抽薹：现蕾时间为92天至105天。

[0075] 表2 183份材料RsFLC2基因分型及病情指数统计表

[0076]

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[0079]

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[0081]

[0082]

[0083] 从表2中可以得出，在31份田间检测为早抽薹材料中，分子标记鉴定为纯合790bp扩增片段；在31份田间检测为晚抽薹材料中，分子标记鉴定为纯合2417bp扩增片段，本发明方法的鉴定准确度为100％。

[0084] 由以上实施例可知，本发明提供的与萝卜晚抽薹相关的基因能够使萝卜晚抽薹开花。

[0085] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。