一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法

摘要

本发明提供了一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，具体包括以下步骤：切下腋芽作为外植体；对腋芽进行灭菌，清洗；将腋芽置于芽增殖培养基上进行培养；将外植体上增殖的芽切下，蘸取IBA溶液，在非琼脂固体培养基中进行不定根诱导；将再生苗转入花盆基质中置于室温下，给予自然光照培养。本发明以大白菜腋芽为外植体，对增殖培养基中植物生长调节物质的使用浓度进行了优化。利用已有的芽原基进行个体增殖，提高了大白菜组织培养的再生效率，成芽速度快，且受基因型影响较小。培养过程简单，可以在短时间内对优异的育种材料和种质资源及时扩繁与利用，大大加速育种进程，为解决AA基因组作物的再生难题提供了新的途径。

权利要求

1.一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，其特征在于包括以下步骤：

1）选取结球期大白菜，剥去叶球外叶，将叶柄基部与短缩茎连接处的腋芽切下；

2）在无菌条件下，先用酒精进行表面消毒，无菌水漂洗；再倒入NaClO溶液灭菌，无菌水漂洗；漂洗结束后，吸干腋芽的多余水分；灭菌后，将腋芽基部多余的短缩茎组织切除；

3）将腋芽的芽尖向上置于芽增殖培养基上进行培养；

4）腋芽在培养基中培养28d后，转入新的芽增殖培养基中继代培养；将外植体上增殖的长度大于1.5cm的具有独立生长点的再生芽切下；

5）将切下的再生芽基部在过滤灭菌的IBA溶液中浸蘸后，插入装有固体生根基质的培养瓶中，封好瓶盖，进行生根培养；

6）当再生芽高度大于3cm时，打开培养瓶盖炼苗，将再生苗连同瓶中的基质一同转入花盆基质中，将再生植株置于室温下，给予自然光照培养；

所述腋芽的切割处位于腋芽基部以下3 mm-4mm，包含部分短缩茎组织；

所述步骤3）中的芽增殖培养基为MS培养基+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+2mg/L AgNO3+

30g/L蔗糖+0.8mg/L琼脂，pH为5.8；

所述步骤5）中固体生根基质的制备为：将蛭石、草炭及蒸馏水按1:1:0.5的体积比搅拌均匀后分装入培养瓶灭菌。

2.根据权利要求1所述的以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，其特征在于：所述步骤2）中选择质量浓度为5%的NaClO消毒15min。

3.根据权利要求1所述的以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，其特征在于：所述步骤3）的培养条件为：光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃。

4.根据权利要求1所述的以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，其特征在于：所述步骤5）中生根培养条件为：光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃。

5.根据权利要求1所述的以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，其特征在于：所述步骤5）中所述IBA溶液的浓度为2.0g/L，浸蘸2秒。

6.根据权利要求1所述的以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，其特征在于：所述步骤6）花盆基质采用蛭石和草炭按照体积比1：1混合而成。

说明书

一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法。

背景技术

[0002] 起源于中国的大白菜(Brassica rapa L.)由于种植面积广和消费量巨大，一直以来是亚洲最重要的蔬菜之一。随着生活水平和蔬菜生产水平的提高，消费者对于大白菜品种多样化的需求越来越迫切(张凤兰等，2017)。提高育种效率是加快育成大白菜新品种的关键。组织培养作为一种重要的生物技术工具，对于快速繁殖大白菜育种过程中的各种材料(优良变异株、自交系、杂交组合和地方品种等)具有不可替代的作用。迄今为止，国内外研究者通过采用不同外植体及不同培养基组成建立了多种类型的大白菜再生体系。从带子叶的子叶柄(Zhang等，1998；Zhao等，2013；Ma等，2017)、下胚轴(Zhu等，2005；Jung等，2012；Baskar等，2016)和真叶等(Liu等，2018)均可以较高频率再生不定芽(Zhang等，1998)。此外，采用小孢子(Han等，2014；Huang等，2016)，花药(Yasuhisa等，1997；Choi等，1998)和原生质体(Glimelius等，1984)诱导体细胞胚的方式也可以获得再生植株。然而，由于操作过程复杂，对技术要求较高，以上诱导胚的方法在快速扩繁植株方面应用较少。

[0003] 上述研究中用于不定芽再生的外植体均需要经过较长时间的脱分化和再分化过程才能诱导形成不定芽。并且基因型对再生频率的影响是上述各种再生方法中都存在的问题。芽组织是植物细胞分裂较活跃的部位，木本植物的芽在休眠之后会抽生新的枝叶或形成花。作为食用器官的大白菜叶球也是一种变态的顶芽(柯桂兰，2009)，因大白菜具有特殊的短缩营养茎的结构，其顶芽生长锥上分化的叶原基和芽原基往往被忽视而得不到有效利用。经过申请人对10个大白菜品种的调查发现，收获期的大白菜(包括娃娃菜)单个叶球基部通常有25-45个长度≥2mm的腋芽。如能对数量众多的腋芽进行培养，就可以省略组织培养的脱分化过程，直接利用已有的芽原基获得新的植株，并且这些外植体具有完全相同的遗传组成。这对于珍贵育种材料的大量保存和繁殖具有重要意义。而根据现有报道，目前没有涉及成熟大白菜腋芽的大白菜植株快繁研究。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供了一种取材便利、成本低、不需要经过脱分化的一种以大白菜腋芽为外植体的快速扩繁方法。本发明省去以往大白菜组织培养过程中通过外植体脱分化-再分化过程形成不定芽的环节。通过直接培养已经形成的腋芽组织，使已经分化的叶原基和芽原基快速生长发育从而获得幼芽。该方法可以在短时间内使优良珍贵的育种材料得到及时保存和扩繁，从生物技术方面为提高大白菜育种效率提供新的技术途径。

[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

[0006] 本发明提供了一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，包括以下步骤：

[0007] 1)选取结球期大白菜，剥去叶球外叶，将叶柄基部与短缩茎连接处的腋芽切下；

[0008] 2)在无菌条件下，先用酒精进行表面消毒，无菌水漂洗；再倒入NaClO溶液灭菌，无菌水漂洗；漂洗结束后，吸干腋芽的多余水分；灭菌后，将腋芽基部多余的短缩茎组织切除；

[0009] 3)将腋芽的芽尖向上置于芽增殖培养基上进行培养；

[0010] 4)腋芽在培养基中培养28d后，转入新的芽增殖培养基中继代培养；将外植体上增殖的长度大于1.5cm的具有独立生长点的再生芽切下；

[0011] 5)将切下的再生芽基部在过滤灭菌的IBA溶液中浸蘸后，插入装有固体生根基质的培养瓶中，封好瓶盖，进行生根培养；

[0012] 6)当再生芽高度大于3cm时，打开培养瓶盖炼苗，将再生苗连同瓶中的基质一同转入花盆基质中，将再生植株置于室温下，给予自然光照培养。

[0013] 进一步的：所述腋芽的切割处位于腋芽基部以下3mm-4mm，包含部分短缩茎组织。

[0014] 进一步的：所述步骤2)中选择质量浓度为5％的NaClO消毒15min。

[0015] 进一步的：所述步骤3)中的芽增殖培养基为MS培养基+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+2mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+0.8mg/L琼脂，pH为5.8。

[0016] 进一步的：所述步骤3)的培养条件为：光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃。

[0017] 进一步的：所述步骤5)中固体生根基质的制备为：将蛭石、草炭及蒸馏水按1:1:0.5的体积比搅拌均匀后分装入培养瓶灭菌。

[0018] 进一步的：所述步骤5)中生根培养条件为：光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃。

[0019] 进一步的：所述步骤5)中所述IBA溶液的浓度为2.0g/L，浸蘸2秒。

[0020] 进一步的：所述步骤6)花盆基质采用蛭石和草炭按照体积比1：1混合而成。

[0021] 与现有技术相比，本发明的优点和有益技术效果是：本发明以大白菜腋芽为外植体，对增殖培养基中植物生长调节物质的使用浓度进行了优化。利用已有的芽原基进行个体增殖，提高了大白菜组织培养的再生效率，成芽速度快，且受基因型影响较小。培养过程简单，可以在短时间内对优异的育种材料和种质资源及时扩繁与利用，大大加速育种进程，为解决AA基因组作物的再生难题提供了新的途径。

[0022] 本发明的快速繁殖方法对于组培芽生根采用直接在无菌环境中蘸取高浓度植物生长素，在非琼脂的固体基质中直接培养生根的方法。而且采用的固体基质和驯化培养及后期生长采用的基质相同，避免了以往组培苗在含有生长素的琼脂固体培养基培养后，需要彻底清洗根系中的琼脂后再进行驯化栽培的步骤。琼脂的去除过程会对根系造成损伤，不利于组培苗的驯化成活。组培苗转入蛭石草炭等新的固体基质中时往往需要1周左右的缓苗时间，如果根系损伤较重，需要的时间则会延长。而本发明的技术方案从诱导生根到大苗移栽始终保持相同的基质。最大程度避免了根系的损伤。

附图说明

[0023] 图1为大白菜在叶球基部短缩茎上着生的腋芽(箭头所指)。

[0024] 图2消毒后的腋芽外植体接种于芽增殖培养基中。

[0025] 图3腋芽外植体在芽增殖培养基中培养3d的图片，腋芽外植体转绿。

[0026] 图4腋芽外植体在芽增殖培养基中培养6d的图片，腋芽外部叶片开始展开。

[0027] 图5腋芽外植体在芽增殖培养基中培养10d的图片，腋芽外部叶片进一步伸展。

[0028] 图6腋芽外植体在芽增殖培养基中培养20d的图片，腋芽基部膨大并形成新的芽点。

[0029] 图7腋芽外植体在芽增殖培养基中培养30d的图片，形成多个不定芽。

[0030] 图8腋芽增殖的再生植株在固体基质中培养15d后的图片。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。

[0032] 实施例1

[0033] 本发明提供了一种以大白菜腋芽为外植体的快速繁育方法，具体包括以下步骤：

[0034] 1)选取结球期大白菜，剥去叶球外叶。将叶柄基部与短缩茎连接处的腋芽用手术刀切下，如图1所示，切割处位于腋芽基部以下约3mm，包含部分短缩茎组织。

[0035] 2)在无菌条件下，先用体积分数70％的酒精表面消毒30s，无菌蒸馏水漂洗一遍。再倒入质量浓度5％的NaClO溶液灭菌15min，无菌蒸馏水漂洗5-6次，每次3min。漂洗结束后，用灭菌吸水纸将腋芽吸附的多余水分吸干。灭菌后，将腋芽基部多余的短缩茎组织切除。

[0036] 3)将芽尖外植体向上置于芽增殖培养基上，如图2所示。在光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃条件下进行培养(如图3-6所示)。所述的芽增殖培养基为MS+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+2mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+0.8mg/L琼脂，pH为5.8。

[0037] 4)腋芽外植体在培养基中培养28天后，转入新的芽增殖培养基中继代。如图7所示，将外植体上长度≥1.5cm的具有独立生长点的再生芽切下进行不定根诱导。

[0038] 5)生根采用不含琼脂的固体基质培养，将蛭石、草炭及蒸馏水按1:1:0.5的体积比(v/v)搅拌均匀后分装入培养瓶灭菌，基质装入量为培养瓶体积的1/2。培养瓶瓶盖设有无菌通气孔，培养瓶直径6.5cm，高9cm。

[0039] 在超净工作台中进行如下操作：将切下的芽基部在过滤灭菌的2.0g/L IBA溶液中浸蘸2秒，插入装有固体基质的培养瓶中，封好瓶盖，进行生根培养。

[0040] 以上培养条件均为：光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃。

[0041] 6)当再生芽高度大于3cm时，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再生苗连同培养瓶中的基质一同转入盛有固体基质的塑料花盆中。花盆基质采用蛭石和草炭体积比1：1混合而成。如图8所示，将再生植株置于室温下培养，给予自然光照。

[0042] 实施例2

[0043] 本实施例通过实验比较不同质量浓度的NaClO溶液消毒不同时间对外植体生长的影响，具体实验步骤如下：

[0044] 1)选取‘西白4号’结球期大白菜，剥去叶球外叶。将叶柄基部与短缩茎连接处的腋芽用手术刀切下，切割处位于腋芽基部以下约3mm，包含部分短缩茎组织。

[0045] 2)在无菌条件下，先用体积分数70％的酒精表面消毒30s，无菌蒸馏水漂洗一遍。再倒入不同质量浓度的NaClO溶液消毒不同时间(如表1所示)，无菌蒸馏水漂洗5-6次，每次
3min。漂洗结束后，用灭菌吸水纸将腋芽吸附的多余水分吸干，将腋芽基部多余的短缩茎组织切除，接入MS基本培养基(表2)。在光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃条件下培养。每个处理25-30个外植体，重复三次。培养15d后调查外植体生长情况。

[0046] 表1 NaClO溶液对大白菜腋芽外植体消毒效果的影响

[0047]

[0048] 注：采用LSD法进行多重比较，同列数据后字母相同者表示在5％水平上差异不显著。

[0049] 本实施例所用的培养基为MS基本培养基+30g/L蔗糖+0.8mg/L琼脂，pH为5.8。MS基本培养基配方见表2。

[0050] 外植体存活率(％)＝转绿生长的外植体个数/接种外植体总数×100％；

[0051] 外植体污染率(％)＝染菌的外植体个数/接种外植体总数×100％。

[0052] 由表1的方差分析结果可知，质量浓度2％的NaClO消毒10min和15min以及质量浓度5％的NaClO消毒10min和15min时，腋芽外植体的存活率最高。浓度5％的NaClO消毒15min及浓度10％的NaClO分别消毒10min、15min和20min时外植体污染率最低。综合上述结果，选择质量浓度5％的NaClO消毒15min用于后续的外植体消毒处理。

[0053] 表2 MS基本培养基配方

[0054]

[0055] 实施例3

[0056] 本实施例通过实验比较不同TDZ(Thidiazuron，噻二唑苯基脲)与NAA(1-naphthylacetic acid，α-萘乙酸)浓度配比对大白菜腋芽再生的影响，具体实验步骤如下：

[0057] 1)选取‘西白4号’和‘87-114’结球期大白菜，剥去叶球外叶。将叶柄基部与短缩茎连接处的腋芽用手术刀切下，切割处位于腋芽基部以下约3mm，包含部分短缩茎组织。

[0058] 2)在无菌条件下，先用体积分数70％的酒精表面消毒30s，无菌蒸馏水漂洗一遍。再倒入质量分数5％的NaClO溶液灭菌10min，无菌蒸馏水漂洗5-6次，每次3min。漂洗结束后，用灭菌吸水纸将腋芽吸附的多余水分吸干。灭菌后，将腋芽基部多余的短缩茎组织切除。

[0059] 3)将芽尖向上置于不同TDZ/NAA激素配比(表3)，附加2.0mg/L AgNO3的芽增殖培养基上。在光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃条件下进行培养。每个处理20-25个外植体，重复三次外植体在培养基中培养28天后，转入新的芽增殖培养基中继代。
接种5周后统计芽再生情况。

[0060] 表3 不同TDZ与NAA浓度配比对大白菜腋芽再生的影响

[0061]

[0062] 注：采用LSD法进行多重比较，同列数据后字母相同者表示在5％水平上差异不显著。

[0063] 芽增殖培养基固定组成为MS基本培养基(见表2)+2.0mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+0.8mg/L琼脂，pH均为5.8。

[0064] 增殖率(％)＝增殖出新芽的腋芽外植体个数/接种的腋芽总数×100％；

[0065] 增殖系数＝增殖出的新芽个数/接种的腋芽总数；

[0066] 成苗率(％)＝获得驯化苗的腋芽外植体数目/接种腋芽外植体总数。

[0067] 由表3可知，培养基中不添加生长调节剂时，‘西白4号’和‘87-114’接种的腋芽也可以培养获得再生植株，但成苗率较低(分别为54.06％和53.77％)，且芽增殖率显著低于添加TDZ和NAA的培养基。培养基中TDZ/NAA的浓度配比为0.5/0.1，1.0/0.1和1.0/0.5时，‘西白4号’和‘87-114’两个品种腋芽增殖率和成苗率均达到最高。当TDZ为0.5mg/L，NAA为0.1mg/L时，两个品种的增殖系数最高，显著高于其他浓度组合。实验中还发现，当培养基中添加TDZ浓度达到1mg/L时，增殖的再生芽呈现部分畸形芽叶。因此，在本实验中，两个品种在MS+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+2mg/LAgNO3+30g/L蔗糖+0.8mg/L琼脂的培养基中增殖效果最好。将0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA用于本发明后续实验中的芽增殖培养基中。

[0068] 4)腋芽外植体在培养基中培养28天后，转入新的芽增殖培养基中继代。将外植体上长度大于1.5cm的具有独立生长点的再生芽切下进行不定根诱导。

[0069] 5)生根采用不含琼脂的固体基质培养，将蛭石、草炭及蒸馏水按1:1:0.5的体积比(v/v)搅拌均匀后分装入培养瓶灭菌，基质装入量为培养瓶体积的1/2。培养瓶瓶盖设有无菌通气孔，培养瓶直径6.5cm，高9cm。

[0070] 在超净工作台中进行如下操作：将切下的再生芽基部在过滤灭菌的2.0g/L IBA溶液中浸蘸2秒，插入装有固体基质的培养瓶中，封好瓶盖，进行生根培养。以上培养条件均为：光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃。

[0071] 6)当再生芽高度大于3cm时，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再生苗连同培养瓶中的基质一同转入入盛有固体基质的塑料花盆中。花盆基质采用蛭石和草炭体积比1：1混合而成。将再生植株置于室温下培养，给予自然光照。

[0072] 实施例4

[0073] 本实施例通过实验比较不同AgNO3浓度配比对大白菜腋芽再生的影响，具体实验步骤如下：

[0074] 1)选取‘西白4号’和‘87-114’结球期大白菜，剥去叶球外叶。将叶柄基部与短缩茎连接处的腋芽用手术刀切下，切割处位于腋芽基部以下约3mm，包含部分短缩茎组织。

[0075] 2)在无菌条件下，先用体积分数70％的酒精表面消毒30s，无菌蒸馏水漂洗一遍。再倒入质量分数5％的NaClO溶液灭菌10min，无菌蒸馏水漂洗5-6次，每次3min。漂洗结束后，用灭菌吸水纸将腋芽吸附的多余水分吸干。灭菌后，将腋芽基部多余的短缩茎组织切除。

[0076] 3)将芽尖向上置于添加不同浓度AgNO3(0，2，4，6，8mg/L)的芽增殖培养基中。在光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃条件下进行培养。每个处理20-25个外植体，重复三次外植体在培养基中培养28天后，转入新的芽增殖培养基中继代。接种5周后统计芽再生情况。

[0077] 表4 不同AgNO3浓度配比对大白菜腋芽再生的影响

[0078]

[0079] 注：采用LSD法进行多重比较，同列数据后字母相同者表示在5％水平上差异不显著。

[0080] 芽增殖培养基固定组成为MS基本培养基(见表2)+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.8mg/L琼脂，pH均为5.8。

[0081] 增殖率(％)＝增殖出新芽的腋芽外植体个数/接种的腋芽总数×100％；

[0082] 增殖系数＝增殖出的新芽个数/接种的腋芽总数；

[0083] 成苗率(％)＝获得驯化苗的腋芽外植体数目/接种腋芽外植体总数。

[0084] 由表4可知，培养基中无硝酸银时，两个品种的增殖率、增殖系数和成苗率显著低于含有不同浓度硝酸银的培养基中的增殖结果。且腋芽外植体接种面的褐化程度较含有硝酸银的培养基中的外植体要高。因此增殖培养基中添加适量硝酸银有利于减轻褐化促进外植体增殖。本试验证明AgNO3对于获得大白菜腋芽的高效增殖效果是必须的。AgNO3浓度为2mg/L和4mg/L时，‘西白4号’腋芽增殖率和增殖系数最高，AgNO3浓度为2mg/L、4mg/L和6mg/L时，‘87-114’的腋芽增殖率差异不显著，但AgNO3浓度为2mg/L时，腋芽的增殖系数最高。过高浓度AgNO3对腋芽外植体产生一定毒害。因此，综合两个品种的试验结果，选定2mg/L AgNO3用于大白菜腋芽增殖培养基。

[0085] 4)腋芽外植体在培养基中培养28天后，转入新的芽增殖培养基中继代。将外植体上长度大于1.5cm的具有独立生长点的再生芽切下进行不定根诱导。

[0086] 5)生根采用不含琼脂的固体基质培养，将蛭石、草炭及蒸馏水按1:1:0.5的体积比(v/v)搅拌均匀后分装入培养瓶灭菌，基质装入量为培养瓶体积的1/2。培养瓶瓶盖设有无菌通气孔，培养瓶直径6.5cm，高9cm。

[0087] 在超净工作台中进行如下操作：将切下的再生芽基部在过滤灭菌的2.0g/L IBA溶液中浸蘸2秒，插入装有固体基质的培养瓶中，封好瓶盖，进行生根培养。以上培养条件均为：光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃。

[0088] 6)当再生芽高度大于3cm时，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再生苗连同培养瓶中的基质一同转入入盛有固体基质的塑料花盆中。花盆基质采用蛭石和草炭体积比1：1混合而成。将再生植株置于室温下培养，给予自然光照。

[0089] 实施例5

[0090] 本实施例通过实验比较基因型对大白菜腋芽再生的影响，具体实验步骤如下：

[0091] 1)选取‘西白45’、‘小义和秋’、‘菊锦’、‘城阳青’和‘北京桔红心’大白菜为试验材料。其中‘西白45’为娃娃菜类型，‘小义和秋’为中早熟类型，‘菊锦’为春白菜类型，‘城阳青’为中晚熟秋白菜类型，‘北京桔红心’为桔红心秋白菜类型。

[0092] 选取上述材料结球期叶球，剥去外叶。将叶柄基部与短缩茎连接处的腋芽用手术刀切下，切割处位于腋芽基部以下约3mm，包含部分短缩茎组织。

[0093] 2)在无菌条件下，先用体积分数70％的酒精表面消毒30s，无菌蒸馏水漂洗一遍。再倒入质量分数5％的NaClO溶液灭菌10min，无菌蒸馏水漂洗5-6次，每次3min。漂洗结束后，用灭菌吸水纸将腋芽吸附的多余水分吸干。灭菌后，将腋芽基部多余的短缩茎组织切除。

[0094] 3)将芽尖外植体向上置于芽增殖培养基上。在光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃条件下进行培养。所述的芽增殖培养基为MS+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+2mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+0.8mg/L琼脂，pH为5.8。

[0095] 表5 基因型对大白菜腋芽再生的影响

[0096]

[0097]

[0098] 注：采用LSD法进行多重比较，同列数据后字母相同者表示在5％水平上差异不显著。

[0099] 增殖率(％)＝增殖出新芽的腋芽外植体个数/接种的腋芽总数×100％；

[0100] 增殖系数＝增殖出的新芽个数/接种的腋芽总数；

[0101] 成苗率(％)＝获得驯化苗的腋芽外植体数目/接种腋芽外植体总数。

[0102] 由表5可知，不同类型的5个品种大白菜采用腋芽繁殖均可达到75％以上的增殖率，平均成苗率在85％以上。除‘城阳青’外，其余四个品种的芽增殖系数均＞2.0。从以上数据可以看出，大白菜腋芽再生的体系受基因型差异影响较小。

[0103] 4)腋芽外植体在培养基中培养28天后，转入新的芽增殖培养基中继代。将外植体上长度大于1.5cm的具有独立生长点的再生芽切下进行不定根诱导。

[0104] 5)生根采用不含琼脂的固体基质培养，将蛭石、草炭及蒸馏水按1:1:0.5的体积比(v/v)搅拌均匀后分装入培养瓶灭菌，基质装入量为培养瓶体积的1/2。培养瓶瓶盖设有无菌通气孔，培养瓶直径6.5cm，高9cm。

[0105] 在超净工作台中进行如下操作：将切下的再生芽基部在过滤灭菌的2.0g/L IBA溶液中浸蘸2秒，插入装有固体基质的培养瓶中，封好瓶盖，进行生根培养。以上培养条件均为：光照强度2000-2500Lux，光周期16h/d，温度25±1℃。

[0106] 6)当再生芽高度大于3cm时，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再生苗连同培养瓶中的基质一同转入入盛有固体基质的塑料花盆中。花盆基质采用蛭石和草炭体积比1：1混合而成。将再生植株置于室温下培养，给予自然光照。

[0107] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。