一种小鼠肺癌模型的构建方法

摘要

本发明提供一种小鼠肺癌模型的构建方法，包括如下步骤：S1取6‑8周龄的C57BL/6J野生型小鼠，适应1‑2周后，置于动式吸入染毒柜的主体柜中进行苯并芘暴露，暴露的条件参数包括：5天/周，5‑8h/天，苯并芘暴露浓度为9‑12μg/m3；暴露期间小鼠停止供食，自由饮水；S2暴露23‑28周后，得到小鼠肺癌模型。本发明属于生物技术领域，本发明方法无人为损伤肺部原来的结构，也不会引起感染等干扰，符合人体实际环境暴露途径，更能反映肺癌在人体的实际发生情况，有利于肺癌相关治疗药物的开发。

权利要求

1.一种小鼠肺癌模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1取6-8周龄的C57BL/6J野生型小鼠，适应1-2周后，置于动式吸入染毒柜的主体柜中进行苯并芘暴露，暴露的条件参数包括：5天/周，5-8h/天，苯并芘暴露浓度为9.8-10.5μg/m3；暴露期间小鼠停止供食，自由饮水；

S2暴露23-28周后，得到小鼠肺癌模型；

所述小鼠为雌性小鼠；所述动式吸入染毒柜包括主体柜、机械通风系统和配气系统；所述苯并芘以苯并芘溶液的形式注入，苯并芘溶液的浓度为0.01mg/mL，经配气系统的注射泵定量输送到高压雾化装置；苯并芘溶液经高压雾化装置雾化成粒径为0.1-0.8μm的气溶胶；

所述暴露的条件参数还包括：温度19-25℃，相对湿度50-70％，氧气含量19-23％；

所述主体柜维持0.07-0.09MPa的负压；所述机械通风系统维持12-15次/h的换气频率。

2.根据权利要求1所述的小鼠肺癌模型的构建方法，其特征在于：所述步骤S2的暴露周期为25-26周。

说明书

一种小鼠肺癌模型的构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种小鼠肺癌模型的构建方法。

背景技术

[0002] 肺癌作为当前全球最常见和死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命和健康。随着我国工业化、城市化进程的加速，肺癌的危害日益加剧，现已成为我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。随着肺癌日益成为一种高发的恶性肿瘤疾病，肺癌给人们的生活和经济造成了巨大的负担，已成为一个严重的公共卫生问题。肺癌的临床表现复杂，难以早期发现和诊断等使得肺癌疗效难以提高。由于不能直接利用人体进行试验，因此构建动物肺癌模型是肺癌发病机制研究以及相关治疗药物开发的重要手段。

[0003] 目前，常用肺癌动物模型主要包括两种类型：诱导模型和移植模型。中国专利申请CN104826136A公开了大鼠移植性肺癌模型的建立方法，包括如下步骤：Walker-256细胞腹水的制备，Walker-256细胞接种到SD大鼠肺部，大鼠生长14天以后，得到移植性肺癌模型。与移植性肺癌模型相比，诱导肺癌模型更容易反映肺癌在人体的实际发生情况。已有很多研究报道了小鼠诱发型肺癌模型的方法，包括鼻滴注致癌物诱发肺癌、肺穿刺致癌剂诱发肺癌、皮下注射诱发肺癌等。然而，鼻滴注法使用移液枪吸取滴注液，逐滴滴入动物鼻腔，操作比较耗时，滴注液也很可能经口腔到达胃部；肺穿刺法是将致癌剂直接通过胸壁穿刺注射入肺内，因多次穿刺可能造成气胸、血胸、感染等引起实验动物死亡，且操作比较繁琐等缺点；皮下注射是直接经皮下注射致癌物，容易在皮下局部形成肿瘤，同时肝脏及胃肠道的肿瘤发生率较高，致癌器官的特异性不理想，且与人体接触苯并芘致肺癌的实际相差较大。
因此，上述诱导肺癌模型的构建方法均存在不同程度的不足，难以满足相关要求。

发明内容

[0004] 为解决现有技术中存在的问题，本发明通过长期动式吸入诱癌剂的方式成功建立了小鼠肺癌模型。动式吸入在暴露过程中能够保持染毒柜内二氧化碳分压、温度和湿度的恒定，且维持诱癌剂暴露浓度的基本恒定，动式吸入无人为损伤肺部原来的结构，也不会引起感染等干扰，符合人体实际环境暴露途径，更能反映肺癌在人体的实际发生情况，有利于肺癌相关治疗药物的开发。

[0005] 本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。

[0006] 本发明提供一种小鼠肺癌模型的构建方法，包括如下步骤：

[0007] S1取6-8周龄的C57BL/6J野生型小鼠，适应1-2周后，置于动式吸入染毒柜的主体柜中进行苯并芘暴露，暴露的条件参数包括：5天/周，5-8h/天，苯并芘暴露浓度为9-12μg/m3；暴露期间小鼠停止供食，自由饮水；

[0008] S2暴露23-28周后，得到小鼠肺癌模型。

[0009] 本发明选用多环芳烃类致癌物苯并芘(BaP)作为诱癌剂，主要是考虑到BaP在空气中广泛存在，且动物实验和流行病学研究均显示，肺癌的发病率和死亡率与空气中BaP的水平呈显著正相关。BaP为固态粉末状，无法直接使用，本发明将其溶于有机溶剂DMSO，然后用超纯水稀释到设计的暴露浓度；对照组则采用溶剂对照。本发明通过运用动式吸入染毒柜，实现了BaP的动式吸入，与人体暴露于大气中BaP的实际情况较接近。为了监测小鼠动式吸入过程中BaP的外暴露浓度，采用活性炭管法检测染毒柜内BaP浓度；同时采用竞争性酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠全血中BDPE-DNA加合物含量，检测BaP的内暴露浓度。通过监测外暴露浓度和内暴露浓度，确保BaP有效的进入小鼠体内。通过对BaP暴露浓度和时间进行研究发现，较高浓度的BaP中短期暴露容易导致小鼠的死亡等不理想情况的发生，本发明采用长期重复暴露，并进一步根据我国国标GB 3095-2012《环境空气质量标准》规定的环境空气BaP限量标准和相关现有技术文献，将苯并芘暴露浓度设计为9-12μg/m3，进一步优选9.8-10.5μg/m3，暴露期间小鼠停止供食，自由饮水，非暴露期间自由饮水且供应饲料，观察记录小鼠的生存状况和体重变化，并定期取肺组织进行病理分析，鉴定肺癌模型是否构建成功，结果显示暴露23-28周后成功构建小鼠肺癌模型，重复性好。

[0010] 优选地，所述动式吸入染毒柜包括主体柜、机械通风系统和配气系统。主体柜的数量为2个，便于同时进行实验组和对照组的考察。

[0011] 优选地，所述苯并芘以苯并芘溶液的形式注入，苯并芘溶液的浓度为0.01mg/mL，经配气系统的注射泵定量输送到高压雾化装置。苯并芘溶液经高压雾化装置雾化成粒径为0.1-0.8μm的气溶胶。苯并芘溶液被雾化成气溶胶，有利于维持暴露浓度的均衡和稳定。

[0012] 优选地，所述暴露的条件参数还包括：温度19-25℃，相对湿度50-70％，氧气含量19-23％(含量指体积百分含量)。

[0013] 优选地，所述主体柜维持0.07-0.09MPa的负压；所述机械通风系统维持12-15次/h的换气频率。

[0014] 优选地，所述小鼠为雌性小鼠。

[0015] 配气系统采用高精度注射泵将BaP溶液定量的输送到高压雾化装置，通过喷嘴加速气流，高速气体为液体的充分分散提供必要的湍流和剪切力，BaP溶液瞬间被分裂成粒径不到1微米的气溶胶。动式吸入染毒柜中设置有2个主体柜，实验组小鼠和BaP溶液、对照组小鼠和对照溶液分别放入相应的主体柜内，由同一个操作系统控制，保证两组参数完全一致。机械通风系统维持12-15次/h的换气频率，保证氧气浓度为19-23％及BaP溶液的均匀分布，主体柜内维持轻微的负压以免气溶胶从柜内逸出，同时保证主体柜中气流的稳定性。每周清洗主体柜1次，保证动式吸入染毒柜内环境清洁。

[0016] 更优选地，所述BaP暴露浓度为9.8-10.5μg/m3。

[0017] 更优选地，所述步骤S2的暴露周期为25-26周。

[0018] 相应地，本发明还提供一种小鼠肺癌模型，采用所述的小鼠肺癌模型的构建方法制得。

[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括：(1)本发明通过长期动式吸入诱癌剂BaP的方式成功建立了小鼠肺癌模型，无人为损伤肺部原来的结构，也不会引起感染等干扰，符合人体实际环境暴露途径，更能反映肺癌在人体的实际发生情况，有利于肺癌相关治疗药物的开发；(2)本发明所需的实验设备简单，操作方法简便，可成功构建小鼠肺癌模型且重复性好，不会导致小鼠感染和死亡等不理想情况的发生，适用范围广。

附图说明

[0020] 图1不同实验动物的体重变化示意图。

[0021] 图2BaP标准系列溶液的浓度测定标准曲线。

[0022] 图3BaP暴露90d小鼠肺组织病理分析图(×100)。

[0023] 图4BaP暴露180d小鼠肺组织病理分析图(A：×100，B：箭头指向部分×200)。

具体实施方式

[0024] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

[0025] 材料和设备：

[0026] 1.1实验动物

[0027] 野生型C57小鼠(C57BL/6J野生型小鼠)：SPF级，6-8周龄，质量18-20g，购自广东省医学实验动物中心，合格证号为11400700104488。

[0028] 1.2主要试剂和配置

[0029] BPDE-DNA检测试剂盒购自美国Cell Biolabs公司。

[0030] BaP溶液：称取10mg BaP，将其溶于10mL DMSO，配成浓度为1mg/mL储备液，充分混匀后避光保存，使用时加超纯水稀释成0.01mg/mL BaP溶液。

[0031] 对照溶液：5mL DMSO加入到495mL超纯水中配制成1％DMSO溶液。

[0032] 1.3主要实验设备

[0033] 动式吸入染毒柜购自广州九方公司，型号：L-RD/0600B。

[0034] 实施例一小鼠的处理

[0035] 取SPF级C57BL/6J野生型小鼠，适应一周后，随机分为2组，对照组48只，暴露组48只，其中雌雄各半。暴露组小鼠在动式吸入染毒柜的主体柜中暴露25周，5天/周，6h/天，具体暴露条件参数如表1所示。

[0036] 表1动式吸入暴露条件参数

[0037]

[0038] 暴露期间小鼠自由饮水，停止供食，暴露结束后将小鼠移出动式吸入染毒柜，自由饮水和进食。整个过程中，观察实验动物的生存状况和体重变化，每周记录实验动物体重1次，结果如图1所示。所有动物对实验干预适应性良好，没有出现因实验干预直接导致的死亡，实验期间实验小鼠的运动、精神状态、饮食情况等均未出现异常。从第5周开始，暴露组小鼠体重明显低于对照组，且一直保持这种趋势(P＜0.05)，说明BaP暴露一定时间会影响小鼠的生长发育。通过比较不同性别小鼠体质量变化发现，雌性小鼠的体重增加明显低于雄性(P＜0.05)。

[0039] 实施例二BaP含量检测

[0040] 为了确保暴露浓度达到预期，利用活性炭管法定期监测染毒柜内BaP外暴露浓度，染毒柜内四周使用4台TH-150C中流量采样器同步开始采集，用GH-1型活性炭管收集样品，所有样品以0.5L/min流速收集2h，采样时关闭染毒柜门，保证环境相对封闭，样品采集完后立即将活性炭管密封，于-20℃冷冻保存。用气质联用仪GC-MSD(Agilent 6890 5973 7683自动进样器)分析采集气体样品中BaP的含量。

[0041] 通过测定BaP标准系列溶液(0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L)，以标准系列溶液的峰面积为纵坐标，标准系列溶液的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。结合标准曲线，计算得出染毒柜内气体BaP含量为(10.294±0.518)μg/m3，符合暴露设计要求。

[0042] 为了检测BaP的内暴露浓度，确保BaP有效的进入小鼠体内，同时采用竞争性酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠全血中BDPE-DNA加合物含量。提取实验小鼠全血DNA，按照BPDE-DNA检测试剂盒(美国Cell Biolabs公司)操作说明书进行BDPE-DNA加合物检测，比较暴露组和对照组小鼠体内BDPE-DNA加合物的差异，分析判断动式吸入BaP到达体内的水平。结果如表2所示，暴露组小鼠体内BPDE-DNA含量明显增加，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，而雌、雄两种性别小鼠间没有明显差异(P＞0.05)；暴露组小鼠染毒90d和
180d(25周)比较，小鼠体内BPDE-DNA含量差异不明显(P＞0.05)，证明动式吸入染毒途径可以使BaP充分进入动物体内，同时暴露浓度也已达到设计要求。

[0043] 表2不同性别小鼠经不同时间BaP暴露后体内BPDE-DNA加合物浓度变化(ng/mL)[0044]

[0045] 注：与对照组比较，*P<0.05。

[0046] 实施例三小鼠肺癌模型的构建

[0047] 小鼠肺癌模型的构建方法，包括如下步骤：

[0048] S1取C57BL/6J野生型小鼠，适应1周后，置于动式吸入染毒柜的主体柜中进行苯并芘暴露，暴露的条件参数包括：5天/周，6h/天，苯并芘暴露浓度为10.294±0.518μg/m3，温度22℃，相对湿度60％，氧气含量20％；暴露期间小鼠自由饮水，停止供食；所述主体柜维持0.08MPa的负压，机械通风系统维持12次/h的换气频率；

[0049] S2暴露180d后，得到小鼠肺癌模型。

[0050] 暴露180d后，乙醚麻醉小鼠，手术切取全肺组织，使用福尔马林固定液固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色及相关病理分析；此外，在相同条件下，对暴露90d的小鼠进行病理分析；计算不同暴露时间小鼠肺癌发病率，结果如表3所示。暴露组小鼠的肺癌发病率与对照组相比显著增加(P＜0.05)，其中雌性小鼠全部成瘤，肺癌发病率达到100％，明显高于雄性(P＜0.05)。对照组中，染毒90d、180d的小鼠肺癌发病率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

[0051] 小鼠的肺癌发病率计算公式：肺癌发病率＝每组发生肿瘤的小鼠数/该组存活的小鼠总数×100％。

[0052] 表3不同性别小鼠经不同时间BaP暴露后肺癌发病率

[0053]

[0054] 注：与对照组相比，*P＜0.05；与暴露组雄鼠比较，#P＜0.05。

[0055] 暴露90d后，BaP暴露组小鼠肺组织病理分析图如图3所示，对照组小鼠肺表面光滑，无肿瘤物，经HE染色可见肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺间质无炎症细胞浸润；暴露组也未见肿瘤发生，但可见部分肺泡弥漫性间质化；暴露180d后，BaP暴露组小鼠肺组织病理分析图如图4所示，对照组小鼠无明显异常，暴露组雄性小鼠的肺脏出现肺泡间质增厚，肺泡结构破坏，部分肺脏可见结节，而雌性小鼠肺表面均可见明显结节，质地坚硬，经染色显示小鼠肺组织出现严重肺泡弥漫性间质化，且肺泡结构严重破损，明显的炎性浸润，出现异常结节，如图4中箭头所指，非正常细胞数量异常增多，说明雌性小鼠肺癌模型建立成功。

[0056] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。