一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽巴氏杆菌荚膜多糖‑蛋白结合疫苗及其制备方法。本发明提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖‑蛋白结合疫苗，由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成，采用多杀性巴氏杆菌荚膜多糖与载体蛋白白喉类毒素结合，增强了疫苗免疫效力，并对同源菌株和异源菌株的感染起到了交叉保护的作用。本发明提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖‑蛋白结合疫苗的制备方法，操作简单，节约成本，具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成；所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的重量比为15：21：10；所述纳米微球由生物高分子材料制备而成；所述生物高分子材料为壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、海藻酸钠中的一种或几种。

2.如权利要求1所述的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、称取重量为荚膜多糖1.4倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于4倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为7％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为3mg/mL的混合液；

S2、将步骤S1制得的混合液在压力为38MPa条件下乳化7次，每次3min，然后以2000转/分钟速度搅拌15min，得到乳化液，蒸干乳化液中的有机溶剂，得到胶体溶液；

S3、用离心机离心步骤S2制得的胶体溶液，转速为11000r/min，得到直径为80nm的纳米微球，水洗纳米微球，并置于冻干机中冻干保存；

S4、利用膜过滤法和硫酸铵沉淀法分离提纯禽巴氏杆菌荚膜多糖；

S5、将步骤S4制得的禽巴氏杆菌荚膜多糖与步骤S3制得的纳米微球以重量比1：1.4的比例偶联，得到多糖纳米微球偶联体，然后进行醛基化反应得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体；

S6、用质量分数为0.3％的甲醛水溶液对白喉毒素进行脱毒处理制备并分离提纯得到白喉类毒素载体蛋白；

S7、将步骤S5制得的表面醛基化多糖纳米微球偶联体与步骤S6制得的白喉类毒素载体蛋白结合，即得。

3.如权利要求2所述的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中醛基化反应具体操作为：在磷酸缓冲液中，温度为32℃，pH＝6的条件下，将多糖纳米微球偶联体通过质量分数为25％的戊二醛水溶液改性，得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体。

说明书

一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 多杀性巴氏杆菌简称巴氏杆菌，是一种有荚膜的革兰氏阴性短杆菌，能够感染家畜、家禽和野禽等多种动物。临床研究表明，禽霍乱是主要由血清型A∶1、A∶3或A∶4巴氏杆菌引起的一种接触性传染病，对养禽业造成严重的经济损失。

[0003] 中国专利申请CN105288607A公开了一种禽巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，该方法制备的禽巴氏杆菌病灭活疫苗免疫家兔，起到了良好的免疫家兔的作用，但是，在使用过程中，这种灭活疫苗在体内的作用时间较短，需要多次接种，使用费时费力。

[0004] 中国专利CN102139116B公开了一种禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备方法，该方法制备的疫苗通过引入真核载体，具有高效高速转染的能力，增强免疫活性。但是该制备方法操作复杂，需要严密的操作流程，制备成本较高。

[0005] 荚膜多糖是主要的毒力因子，是细菌在一定环境中产生的胶态或粘液性的物质，该物质大都是多糖、多肽或多糖蛋白复合体等，在细胞壁外积累形成稳定的、较厚的致密保护层。20世纪90年代大量学者研究发现多杀性巴氏杆菌可分为A，B，D，E和F五种荚膜血清群。研究发现含有荚膜的多杀性巴氏杆菌分离株比无荚膜的相关变异菌株毒力更强，证明荚膜对多杀性巴氏杆菌的致病性起着重要的作用。研究表明A型无荚膜突变株对试验鸡无致病性，且该突变株不能在鸡肌肉细胞上增殖，然而高剂量的该无荚膜的突变菌株作疫苗却能刺激试验鸡产生相关的免疫性保护。表明荚膜是合理有效的巴氏杆菌候选亚单位疫苗。

[0006] 目前，用灭活疫苗和活菌疫苗来预防禽霍乱，但灭活疫苗只对同源菌株的感染具有保护作用，而活菌疫苗对同源菌株和异源菌株的感染具有一定的交叉保护作用，因此具有广泛的应用前景。

发明内容

[0007] 针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法。本发明提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗采用多杀性巴氏杆菌荚膜多糖，并采用减毒活菌疫苗来预防禽霍乱，增强了疫苗毒力，并对同源菌株和异源菌株的感染起到了交叉保护的作用。本发明提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，操作简单，节约成本。

[0008] 本发明的技术方案如下:

[0009] 本发明提供了一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。

[0010] 进一步地，所述纳米微球由生物高分子材料制备而成。

[0011] 进一步地，所述生物高分子材料为壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、海藻酸钠中的一种或几种。

[0012] 进一步地，所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的重量比为6-25:7-30：10。

[0013] 进一步地，所述禽巴氏杆菌荚膜多糖从巴氏杆菌中提取得到。

[0014] 本发明还提供了一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：

[0015] S1、称取重量为荚膜多糖1.2-1.5倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于3-5倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为0.1-5mg/mL的混合液；

[0016] S2、将步骤S1制得的混合液在压力为20-50MPa条件下乳化5-8次，每次2-3min，然后以1000-3000转/分钟速度搅拌10-30min，得到乳化液，蒸干乳化液中的有机溶剂，得到胶体溶液；

[0017] S3、用离心机离心步骤S2制得的胶体溶液，转速为8000-12000r/min，得到直径为50-150nm的纳米微球，水洗纳米微球，并置于冻干机中冻干保存；

[0018] S4、利用膜过滤法和硫酸铵沉淀法分离提纯禽巴氏杆菌荚膜多糖；

[0019] S5、将步骤S4制得的禽巴氏杆菌荚膜多糖与步骤S3制得的纳米微球以重量比1：1.2-1.5的比例偶联，得到多糖纳米微球偶联体，然后进行醛基化反应得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体；

[0020] S6、用质量分数为0.3％-0.4％的甲醛水溶液对白喉毒素进行脱毒处理制备并分离提纯得到白喉类毒素载体蛋白；

[0021] S7、将步骤S5制得的表面醛基化多糖纳米微球偶联体与步骤S6制得的白喉类毒素载体蛋白结合，即得。

[0022] 进一步地，所述步骤S5中醛基化反应具体操作为：

[0023] 在磷酸缓冲液中，温度为30-37℃，pH＝5-7的条件下，将多糖纳米微球偶联体通过质量分数为25％的戊二醛水溶液改性，得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体。

[0024] 进一步地，本发明提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗可以以任何已有的途径进行免疫，包括真皮层或皮肤给药、肌肉给药等形式。其中，所给予的量是本领域技术人员根据常识可以确定的。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下优势：

[0026] (1)本发明提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗采用多杀性巴氏杆菌荚膜多糖，并采用减毒活菌疫苗来预防禽霍乱，增强了疫苗毒力，并对同源菌株和异源菌株的感染起到了交叉保护的作用。

[0027] (2)本发明提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，操作简单，节约成本。

具体实施方式

[0028] 下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。以下所用试剂或设备均为市售品种，如无特殊说明，均按照说明书操作，在此不做赘述。

[0029] 实施例1、一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗

[0030] 所述禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的质量比为15:18:25。

[0031] 制备方法如下：

[0032] S1、称取重量为荚膜多糖1.2倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于3倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为1％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为0.1mg/mL的混合液；

[0033] S2、将步骤S1制得的混合液在压力为20MPa条件下乳化5次，每次2min，然后以1000转/分钟速度搅拌30min，得到乳化液，蒸干乳化液中的有机溶剂，得到胶体溶液；

[0034] S3、用离心机离心步骤S2制得的胶体溶液，转速为8000r/min，得到直径为150nm的纳米微球，水洗纳米微球，并置于冻干机中冻干保存；

[0035] S4、利用膜过滤法和硫酸铵沉淀法分离提纯禽巴氏杆菌荚膜多糖；

[0036] S5、将步骤S4制得的禽巴氏杆菌荚膜多糖与步骤S3制得的纳米微球以重量比1：1.2的比例偶联，得到多糖纳米微球偶联体，然后在磷酸缓冲液中，温度为30℃，pH＝5的条件下，将多糖纳米微球偶联体通过质量分数为25％的戊二醛水溶液改性，得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体；

[0037] S6、用质量分数为0.3％的甲醛水溶液对白喉毒素进行脱毒处理制备并分离提纯得到白喉类毒素载体蛋白；

[0038] S7、将步骤S5制得的表面醛基化多糖纳米微球偶联体与步骤S6制得的白喉类毒素载体蛋白结合，即得。

[0039] 实施例2、一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗

[0040] 所述禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。

[0041] 所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的质量比为10:15:4。

[0042] 制备方法如下：

[0043] S1、称取重量为荚膜多糖1.5倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于3-5倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为10％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为5mg/mL的混合液；

[0044] S2、将步骤S1制得的混合液在压力为50MPa条件下乳化8次，每次3min，然后以3000转/分钟速度搅拌10min，得到乳化液，蒸干乳化液中的有机溶剂，得到胶体溶液；

[0045] S3、用离心机离心步骤S2制得的胶体溶液，转速为12000r/min，得到直径为50-150nm的纳米微球，水洗纳米微球，并置于冻干机中冻干保存；

[0046] S4、利用膜过滤法和硫酸铵沉淀法分离提纯禽巴氏杆菌荚膜多糖；

[0047] S5、将步骤S4制得的禽巴氏杆菌荚膜多糖与步骤S3制得的纳米微球以重量比1：1.2-1.5的比例偶联，得到多糖纳米微球偶联体，然后在磷酸缓冲液中，温度为37℃，pH＝7的条件下，将多糖纳米微球偶联体通过质量分数为25％的戊二醛水溶液改性，得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体；

[0048] S6、用质量分数为0.3％-0.4％的甲醛水溶液对白喉毒素进行脱毒处理制备并分离提纯得到白喉类毒素载体蛋白；

[0049] S7、将步骤S5制得的表面醛基化多糖纳米微球偶联体与步骤S6制得的白喉类毒素载体蛋白结合，即得。

[0050] 实施例3、一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗

[0051] 一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，所述禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的质量比为15:21:10。

[0052] 制备方法如下：

[0053] S1、称取重量为荚膜多糖1.4倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于4倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为7％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为3mg/mL的混合液；

[0054] S2、将步骤S1制得的混合液在压力为38MPa条件下乳化7次，每次3min，然后以2000转/分钟速度搅拌15min，得到乳化液，蒸干乳化液中的有机溶剂，得到胶体溶液；

[0055] S3、用离心机离心步骤S2制得的胶体溶液，转速为11000r/min，得到直径为80nm的纳米微球，水洗纳米微球，并置于冻干机中冻干保存；

[0056] S4、利用膜过滤法和硫酸铵沉淀法分离提纯禽巴氏杆菌荚膜多糖；

[0057] S5、将步骤S4制得的禽巴氏杆菌荚膜多糖与步骤S3制得的纳米微球以重量比1：1.4的比例偶联，得到多糖纳米微球偶联体，然后在磷酸缓冲液中，温度为32℃，pH＝6的条件下，将多糖纳米微球偶联体通过质量分数为25％的戊二醛水溶液改性，得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体；

[0058] S6、用质量分数为0.3％的甲醛水溶液对白喉毒素进行脱毒处理制备并分离提纯得到白喉类毒素载体蛋白；

[0059] S7、将步骤S5制得的表面醛基化多糖纳米微球偶联体与步骤S6制得的白喉类毒素载体蛋白结合，即得。

[0060] 对比例1、一种禽巴氏杆菌疫苗

[0061] (1)生产用菌种的制备

[0062] 将禽巴氏杆菌标准菌种A型NCTC1502接种于胰蛋白大豆琼脂固体培养基平板，在37℃恒温箱中培养复苏；

[0063] (2)制苗菌液的制备

[0064] 挑取典型菌落接种于胰蛋白大豆肉汤液体培养基，于37℃、200rpm条件下培养多杀性巴氏杆菌至对数生长期，取5mL培养菌液在1000mL限铁环境的胰蛋白大豆肉汤液体培养基内，于37℃、200rpm继续培养12h，限铁环境培养细菌达到平台期时收获菌液作为制苗用菌液；限铁培养所需菌液培养到对数生长期至OD630nm达到0.6，为确定生产实际中限铁环境细菌培养对数期提供技术参数，免去了每批做细菌计数的复杂、耗时的工序；限铁环境为：普通胰蛋白大豆肉汤液体培养基内加入终浓度为220μmol/L的D(2,2-dipyridyl2,2’-联吡啶)，可有效螯合培养环境中的铁离子，使其极度接近病原体在宿主体内繁殖的缺铁环境；限铁环境培养PM达到平台期时间为12h；

[0065] (3)制苗用菌液的灭活

[0066] 将上述培养获得的菌液用1mol/L的氢氧化钠溶液调至至pH＝7.2，然后加入甲醛溶液使，使得甲醛最终质量分数达到0.4％进行灭活，充分搅拌混匀，在37℃下灭活72h，分别取各灭活菌液少量接种于平板上进行培养，进行无菌检验，应达到无细菌生长的要求；

[0067] (4)疫苗的制备

[0068] 将灭活检验合格的菌液浓缩，调至其浓度大于等于3.25×1010CFU/mL，与灭菌的白油佐剂按1：1体积比的比例充分混合乳化，并按照每毫升的乳化混合物加入0.01g硫柳汞混匀，即可获得目标灭活疫苗。

[0069] 对比例2、一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗

[0070] 一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，所述禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗由禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白通过纳米微球连接而成。所述禽巴氏杆菌荚膜多糖、纳米微球与白喉类毒素载体蛋白的质量比为5:7:5。

[0071] 制备方法如下：

[0072] S1、称取重量为荚膜多糖1.4倍的制备纳米微球所用的生物高分子材料溶于4倍重量的二氯甲烷中，然后加入含有质量浓度为7％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌溶解，得到生物高分子材料的终浓度为3mg/mL的混合液；

[0073] S2、将步骤S1制得的混合液在压力为38MPa条件下乳化7次，每次3min，然后以2000转/分钟速度搅拌15min，得到乳化液，蒸干乳化液中的有机溶剂，得到胶体溶液；

[0074] S3、用离心机离心步骤S2制得的胶体溶液，转速为11000r/min，得到直径为80nm的纳米微球，水洗纳米微球，并置于冻干机中冻干保存；

[0075] S4、利用膜过滤法和硫酸铵沉淀法分离提纯禽巴氏杆菌荚膜多糖；

[0076] S5、将步骤S4制得的禽巴氏杆菌荚膜多糖与步骤S3制得的纳米微球以重量比1：1.4的比例偶联，得到多糖纳米微球偶联体，然后在磷酸缓冲液中，温度为32℃，pH＝6的条件下，将多糖纳米微球偶联体通过质量分数为25％的戊二醛水溶液改性，得到表面醛基化的多糖纳米微球偶联体；

[0077] S6、用质量分数为0.3％的甲醛水溶液对白喉毒素进行脱毒处理制备并分离提纯得到白喉类毒素载体蛋白；

[0078] S7、将步骤S5制得的表面醛基化多糖纳米微球偶联体与步骤S6制得的白喉类毒素载体蛋白结合，即得。

[0079] 对比例2与实施例3基本相同，不同在于，对比例2中禽巴氏杆菌荚膜多糖与白喉类毒素载体蛋白的质量比为1:1。

[0080] 试验例一、安全性试验

[0081] 1.试验材料：实施例1、实施例2和实施例3制备的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗。

[0082] 2.试验对象：80日龄的无特定病原鸡(SPF鸡)60只。

[0083] 3.试验方法：将60只80日龄的SPF鸡随机分为3组，每组20只，分别在各组SPF鸡的颈部皮下注射2mL实施例1-3制备的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，分别记为实施例1组、实施例2组、实施例3组，28日后全部静脉注射致死量的禽巴氏杆菌，14日后，观察SPF鸡的局部炎症反应及健活状况。表1为安全性试验结果。

[0084] 表1安全性试验结果

[0085]组别 观察记录 剖检记录 结果
实施例1组 无症状 无局部炎症反应 健活
实施例2组 无症状 无局部炎症反应 健活
实施例3组 无症状 无局部炎症反应 健活

[0086] 由表1可知，实施例1-3组的SPF鸡在注射疫苗14日以后，均未出现精神状态不佳、局部炎症和死亡的状况，表明本发明提供的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗无毒性，具有较高的安全性。

[0087] 试验例二、疫苗效力试验

[0088] 1.试验材料：实施例1、实施例2、实施例3、对比例2制备的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗以及对比例1制备的禽巴氏杆菌疫苗。

[0089] 2.试验对象：3-6月龄的SPF鸡100只。

[0090] 3.试验方法：将120只3-6月龄的SPF鸡分为6组，每组20只，分别将实施例1、实施例2、实施例3、对比例2制备的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗以及对比例1制备的禽巴氏杆菌疫苗注射给1-5组SPF鸡的颈部皮下注射疫苗0.5mL，并记为实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例2组和对比例1组，一组作对照不注射疫苗。21日后，每只鸡肌肉注射强毒株菌液1mL，注射剂量为3.1×103CFU/mL。观察14日，有无临床反应及死亡状况。表2为疫苗效力试验数据记录表。

[0091] 表2疫苗效力试验数据记录表

[0092]

[0093] 由表2可知，实施例1组和实施例2组SPF鸡出现排绿色稀粪状况，但精神良好，观察期内恢复并健活，实施例3组的SPF鸡在14日内无任何临床症状，效果最好，为本发明的最佳实施例，对比例1组在14日观察期内出现排绿色稀粪，精神状态不佳的状况，且最终SPF鸡全部死亡，对比例2组在15小时出现排绿色稀粪，精神不佳的状况，并在30小时时SPF鸡全部死亡，对照组在22小时全部死亡，表明本发明制备的禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗微量注射，保护率达到100％。

[0094] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。