一种人工重组SPXnovel蛋白在提高大豆低磷耐的应用

摘要

本发明提供一种人工重组SPXnovel蛋白在提高大豆低磷耐的应用，以大豆自身基因组编码的GmSPX6和GmSPX1为基础，通过将不同GmSPX6蛋白的N（1‑220aa）端和C（180‑261aa）端进行融合组装，找到一个新的SPXnovel蛋白，此人工重组的SPXnovel蛋白在低磷下的蛋白稳定性较GmSPX6明显提高。在大豆的毛根体系中超表达该基因能够抑制缺磷信号的快速产生，保证大豆在适度低磷条件下的生长，提高大豆对适度低磷的耐受性，因此具有一定的应用价值。

权利要求

1.一种人工重组的SPXnovel蛋白，其特征在于，所述的PXnovel蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种人工重组的SPXnovel蛋白在提高大豆耐低磷中的应用。

说明书

novel

一种人工重组SPX 蛋白在提高大豆低磷耐的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人工重组SPXnovel蛋白在提高大豆低磷耐的应用。

背景技术

[0002] 磷对植物的生长发育至关重要，土壤中可供植物直接吸收利用的磷经常处于缺乏的状态，低磷下植物的缺磷信号的快速和频繁的产生干扰了植物的生长，不利于植物应对土壤中适度低磷的状况，影响了植物生物量或者产量。降低植物对适当低磷的过激反应是解决这一问题的关键。但是，目前的手段主要是通过提高磷酸根转运蛋白的表达水平增加植物对磷的吸收，没法较少缺磷信号的副作用。本研究通过改造SPX蛋白适当降低植物对缺磷的敏感性，保证植物在适当缺磷下的正常生长。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种人工重组SPXnovel蛋白在提高大豆低磷耐的应用。

[0004] 为实现上述目的，采用以下技术方案：

[0005] 本发明以大豆基因组编码的GmSPX6和GmSPX1蛋白为基础，通过将GmSPX6蛋白的N端（1-220氨基酸）和GmSPX1（180-261氨基酸）蛋白的C端进行融合组装，获得一个SPXnovel蛋白，序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] SPXnovel蛋白是利用大豆自身基因组编码的SPX6基因，将其翻译的蛋白的N端（1-220aa）的SPX结构域与大豆SPX1蛋白的C（180-261aa）端进行融合，得到了一个的人工重组SPXnovel蛋白，该SPXnovel蛋白，该蛋白在低磷下的稳定性较天然存在的GmSPX6蛋白稳定性高。超表达该基因能够抑制适度缺磷下磷信号的产生，保证植物在适度低磷的时候正常生长。

[0007] 该人工重组获得的SPXnovel蛋白在低磷条件下蛋白的稳定性相比原来的SPX6蛋白明显提高。能与磷信号中心调控因子OsPHR2蛋白稳定结合，抑制OsPHR2的蛋白功能，从而抑制缺磷信号的快速产生。其超表达该重组基因SPXnovel，在适度低磷下，抑制缺磷信号的快速产生，保证大豆的生长免收缺磷信号的干扰，接触生长抑制，保证生物量，最终提高大豆对适度低磷的适应性。

[0008] 本发明的优点在于：

[0009] 本发明所述的SPXnovel蛋白稳定性较原来的GmSPX6提高了，并且仍保持与植物磷信号中心调控因子互作的能力，并且抑制其转录活性，能够延缓适度缺磷时磷信号的产生，保证大豆在适度低磷条件下的正常生长，因此对与田间适度低磷的条件下保证大豆的正常生长，提高大豆对适度低磷的耐受性具有重要意义。

附图说明

[0010] 图1体外降解实验研究SPXnovel 水蛋白稳定性。

[0011] 图2烟草瞬时实验验证SPXnovel与OsPHR2的蛋白互作。

[0012] 图3烟草瞬时实验验证SPXnovel抑制OsPHR2的功能。

[0013] 图4. SPXnovel超表达对大豆缺磷信号的抑制作用。

具体实施方式

[0014] 实施例1、人工重组SPXnovel蛋白的获得

[0015] 1）根据phytozome上提供的大豆转录组信息，找到大豆基因组表达的GmSPX6和GmSPX1蛋白的基因序列，经分析GmPX6的SPX结构域区段位于蛋白N端的1-220氨基酸的位置，GmSPX6的SPX结构域位于蛋白N端的1-220氨基酸的位置，为将GmSPX6蛋白的SPX结构域GmSPX1蛋白的C端（180-261aa）融合，设计引物，利用同源重组方法进行融合。

[0016] 引物序列如下:

[0017] SPX6-F: ATGAAATTTGGGAAAGAGTTCAA；

[0018] SPX6-R: CTCACATTCATGGACTAACCTTG；

[0019] SPX1-F:AGTCCATGAATGTGAGGAGTGCGAGAGCATAATTG；

[0020] SPX6-F: CTAGACAATAGGAACTGCAGCA；

[0021] 2）将融合产生的新基因连接pMD-19T载体转化大肠杆菌，经测序获得成功的融合SPXnovel蛋白，新的SPXnovel蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示。

[0022] 实施例2、大豆SPXnovel重组蛋白的功能研究

[0023] 为了研究产生的SPXnovel融合蛋白的稳定性，我们将SPXnovel融合蛋白和天然存在的SPX6蛋白分别构建了原核表达载体，我们构建融合的GST标签的植物表达载体pGEX4T-1-SPXnovel和天然存在的GmSPX6的原核表达载体pGEX4T-1-SPX6，提取大豆叶片的总蛋白与原核表达纯化的GST，GST-GmSPX6和GST-SPXnovel共同孵育，利用体外cell-free 降解体系研究GST-SPXnovel蛋白的稳定性。结果如附图1所示，结果显示GST标签蛋白在总蛋白孵育中是稳定的，而GST-SPXnovel蛋白的量在30min内显著高于GST-GmSPX6蛋白，表明人工改造重组的SPXnovel蛋白的稳定性相对GmSPX6有明显的提高。

[0024] 实施例3大豆SPXnovel的与OsPHR2蛋白的相互作用

[0025] 为了研究人工重组的SPXnovel蛋白是否仍能与OsPHR2蛋白发生相互作用，我们利用Split-LUC方法检测其在植物细胞内的相互作用。结果如图2所示，结果表明SPXnovel蛋白能够与OsPHR2蛋白发生相互作用。

[0026] 实施例4大豆SPXnovel蛋白具有抑制OsPHR2的功能

[0027] 为了研究SPXnovel蛋白是否具有抑制OsPHR2蛋白的功能，我们利用烟草瞬时体系进行验证。结果发现（图3）在超表达OsPHR2能够显著诱导4×P1BS-LUC上报告基因LUC的表达，novel novel而同时超量表达SPX 和OsPHR2则LUC荧光信号显著降低，表明人工重组合成的SPX 蛋白能够抑制OsPHR2的功能。

[0028] 实施例5 SPXnovel超量表达对缺磷信号的影响

[0029] 为了研究人工重组合成的SPXnovel蛋白在适当低磷的条件下，是否能对缺磷信号具有抑制作用或者延缓缺磷信号的诱导，我们利用立体大豆毛根体系，在离体毛根中超量表达SPXnovel-GFP以超量表达GmSPX6-GFP为对照，将同一时期的毛根转移到低磷培养基上（磷浓度为50µM），不同处理时间取样（低磷处理1天，3天，5天，7天），利用qRT-PCR的方法分析缺磷信号基因GmIPS1的转录水平。结果发现(如图4)在不同的低磷处理时间点里超量表达SPXnovel-GFP的转基因毛根中的缺磷信号明显低于超量表达GmSPX6-GFP的离体毛根。表明人工重组合成的蛋白能够在一定水平上抑制磷信号的启动。

[0030] 本研究通过对大豆原有的SPX蛋白进行改造，获得了一个与OsPHR2互作的，同时具有抑制OsPHR2功能的蛋白。并且人工重组获得的SPXnovel蛋白的稳定性明显比天然存在的GmSPX6，经离体毛根体系验证表明超表达该基因能够抑制缺磷信号的快速启动。因此人工重组获得的新基因在大田实验中，帮助植物应对多变的外界可利用磷方面可能具有应用潜力。

[0031] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。