一株异氧氨同化的鞘氨醇单胞菌LPN080及其微生物制剂与应用

摘要

本发明公开了一株异氧氨同化的鞘氨醇单胞菌LPN080及其微生物制剂与应用。该菌株分离于广东省茂名市对虾养殖环境中，具有很强的降解氨氮的能力，经分子鉴定为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)，鞘氨醇单胞菌LPN080可通过异养形式对氨氮进行快速吸收同化，因此区别于自氧硝菌和异养硝化菌，此外鞘氨醇单胞菌LPN080还可以显著性竞争抑制养殖水体的弧菌。将鞘氨醇单胞菌LPN080应用于养殖水体中，能明显快速降低养殖水体中氨氮的含量，对养殖动物安全。

权利要求

1.鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080，其保藏编号为GDMCC No：60365。

2.一种微生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080。

3.权利要求2所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080接种到液体培养基中发酵培养，发酵结束后，每升加入

1.5g的海藻糖，充分混匀，得到微生物制剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的液体培养基为SPM培养基，其每升培养基是通过以下方法制备的：在1L水中加入硫酸铵1.5g，蛋白胨0.5g，麸皮0.6g，葡萄糖6g，蔗糖6g，玉米汁1.5g，调节pH至7.0。

5.权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080或权利要求2所述的微生物制剂在降解水体氨氮中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的水体为养殖水体。

7.权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080或权利要求2所述的微生物制剂在水产养殖领域降解养殖水体氨氮中的应用。

说明书

一株异氧氨同化的鞘氨醇单胞菌LPN080及其微生物制剂与

应用

技术领域：

[0001] 本发明属于水产养殖技术及生态环境保护技术领域，具体涉及一株异氧氨同化的鞘氨醇单胞菌LPN080及其微生物制剂与应用。背景技术：

[0002] 水产养殖中，养殖池中大量的残饵、粪便及其代谢产物的不断增加，这些物质被微生物分解产生大量的氨氮和亚硝酸盐，二者对养殖动物产生毒性，过量的氨氮和亚硝酸盐还会使养殖水体中的藻类大量爆发，藻类爆发后死亡产生毒素，也会大量引起水产养殖动物的死亡，同时病原微生物也会大量滋生。因此，水产养殖中控制养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的浓度是仅次于溶解氧的重要水质指标。

[0003] 微生物制剂已经广泛在水产养殖中得到应用，其中包括硝化细菌和反硝化细菌。目前市场中广泛使用的硝化细菌绝大多数为自养硝化细菌，将氨氧化为亚硝酸盐，再由亚硝酸进一步氧化为硝酸盐。自养硝化细菌多生活在寡营养的水体环境，且自养硝化的过程非常缓慢，这可能是在高密度养殖环境中，氨氮和亚硝酸含量容易超标的原因。因此，自养硝化细菌实际上并不能完全满足利用微生物制剂来调控水体氨氮和亚硝酸含量的目的。

[0004] 异养硝化菌目前已经在污水处理中得到应用，近年来随着生物絮团养殖技术的兴起，异养硝化菌在水产养殖领域逐渐得到重视，异养硝化代谢快、生长快，某些特殊的异养细菌能同步进行异养硝化和好氧反硝化，在养殖水体水质改善方面具有广泛用途。

[0005] 然而上述细菌均只能完成氨存在形式的转化(NH4+/NO2-/NO3-)，并不能将无机态的氨或亚硝酸转化为细菌细胞本身的组成成份。

[0006] 异养氨同化菌利用外界碳源作为能源，利用谷氨酰胺合成途径将氨氮作为氮源同化为自身所需的有机物，将氨氮积累在体内。相比之下异养氨同化菌的实用性更强，不会产生亚硝酸盐和硝酸盐的积累，更能解决养殖生产中水体氨氮和硝酸盐过高的问题。关于异养亚硝酸同化菌目前还缺乏报道和研究，更没有在水产养殖中应用的实例。发明内容：

[0007] 本发明的第一个目的是提供一株鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080，该菌于2018年4月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：60365。

[0008] 本发明是从对虾养殖水体及底泥混合样，通过在富集及分离培养基(EIM)中加入葡萄糖，蔗糖等碳源，加入硫酸铵作为氮源，加入少量酵母提取物作为生长因子，富集含有降氨氮能力的异养氮同化菌，通过相应上述培养基的琼脂平板进行纯化，再次挑单菌落到上述培养基中，挑选出生长速度快降氨氮能力最强的菌株。通过16SrDNA鉴定，确定为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)的细菌，命名为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080。

[0009] 本发明的第二个目的是提供一种微生物制剂，包含所述的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080。

[0010] 本发明的第三个目的是提供所述的微生物制剂的制备方法，将所述的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080接种到液体培养基中发酵培养，发酵结束后，每升加入1.5g的海藻糖，充分混匀，得到微生物制剂。

[0011] 所述的液体培养基为SPM培养基，其每升培养基是通过以下方法制备的：在1L水中加入硫酸铵1.5g，蛋白胨0.5g，麸皮0.6g，葡萄糖6g，蔗糖6g，玉米汁1.5g，调节pH至7.0。

[0012] 本发明的第四个目的是提供所述的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080或所述的微生物制剂在降解水体氨氮中的应用。

[0013] 所述的水体优选为养殖水体。

[0014] 本发明的第五个目的是提供所述的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080或所述的微生物制剂在水产养殖中的应用。

[0015] 鞘氨醇单胞菌LPN080制剂(即微生物制剂)按每亩养殖水体(水深1m算)5-10公斤量使用。首先将鞘氨醇单胞菌LPN080制剂加入到4-10倍体积的养殖水中，按每升鞘氨醇单胞菌LPN080制剂加入50-100g红糖的量加入红糖，混匀后，室温放置4-12小时，全池泼洒即可。

[0016] 本发明的鞘氨醇单胞菌LPN080及其微生物制剂具有以下优点或积极效果：

[0017] (1)降解氨氮的速度相比自养硝化菌快；(2)氨氮被吸收同化，不会转化成亚硝酸盐或硝酸盐，因此氮素能真正从养殖水体中快速去除；(3)鞘氨醇单胞菌LPN080在养殖水体中竞争性抑制弧菌生长，因此本菌同时具有抑制水产病原菌的功效。

[0018] 本发明的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080于2018年4月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：60365。附图说明：

[0019] 图1为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080降氨氮曲线图。具体实施方式：

[0020] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0021] 实施例1：鞘氨醇单胞菌LPN080富集分离

[0022] 富集及分离培养基(EIM)：硫酸铵0.5g、蛋白胨1g、葡萄糖6g、蔗糖6g、酵母提取物0.5g、NaH2PO4 0.5g、砂滤干净的海水1L，调pH至7.0，高压蒸汽灭菌。

[0023] 样品来源：广东省茂名市电白区对虾养殖水体及池底泥混合样。

[0024] 具体的实施步骤如下：无菌条件下，过滤样品135ml至灭菌的锥形瓶中，加入10×EIM培养基(10×EIM培养基的配方为：硫酸铵5g、蛋白胨10g、葡萄糖60g、蔗糖60g、酵母提取物5g、NaH2PO4 5g、砂滤干净的海水1L，调pH至7.0，高压蒸汽灭菌)15ml，150rpm的摇床中30℃培养48h，得到富集液。取富集液100μl涂布于上述EIM固体培养基中，30℃的恒温箱中培养24h，挑取单菌落20个，接种至EIM液体培养基中培养24h，在EIM平板上划线纯化2次，得到20个纯化的菌株，接种至EIM培养基中培养。

[0025] 各菌取等量的菌液100μl，接入到新鲜的EIM培养基中，测定起始培养基中氨氮的浓度，30℃培养48h后测定最终氨氮浓度。挑选出降氨氮效果最好的一株菌，菌株号LPN080。

[0026] 实施例2：鞘氨醇单胞菌LPN080分子鉴定

[0027] 取菌株LNP080菌液离心，弃上清，以菌体沉淀提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，以27F/1492R为引物进行16SrDNA扩增(doi:10.1128/AEM.02272-07)，并测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列经Blast搜索比对，鉴定为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)的细菌，命名为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080。

[0028] 实施例3：鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LPN080对养殖水体氨氮的去除效果[0029] 取养殖水样采用硫酸铵调氨氮浓度为8mg/L左右，加入葡萄糖至终浓度1g/L，灭菌处理后分装150ml到灭菌的250ml摇瓶中。实验组(E1、E2、E3)加入30℃，200rpm摇床过夜培养的LPN080菌液(培养基为EIM培养基)500μl，对照组(C1、C2、C3)加入等量的EIM培养基，30℃摇床培养(转速200rpm)，于0h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h取水样。利用纳氏试剂分光光度计法测定不同时间点氨氮含量，结果见图1。

[0030] 由图1可见，当初始养殖水样调氨氮浓度达到为7.89mg/L时，48小时内鞘氨醇单胞菌LPN080对氨氮的去除效率达到99.4％，几乎检测不到氨氮的存在，因此鞘氨醇单胞菌LPN080对于高氨氮浓度的养殖水中的氨氮具有非常强的去除能力。

[0031] 为了证明氨氮是被吸收同化，而非像异养硝化菌一样转化为NO2-，同时在0h、12h、24h、48h时，测定了实验组和对照组各样品的NO2-含量，结果发现各组样品在四个时间点的NO2-含量均为0。由于本水样品中以及上述实施例的培养基中，除了硫酸铵提供氮源，并无其它物质大量提供氮源，结果这些事实，确定鞘氨醇单胞菌LPN080为具有显著降氨能力的异养氨同化细菌。

[0032] 实施例4：鞘氨醇单胞菌LPN080生物安全性评价

[0033] 实验组(SE1、SE2、SE3)三个玻璃缸，对照组(SC1、SC2、SC3)三个玻璃缸，每缸加入过滤海水4L，每缸随机放对虾8尾。取30℃，200rpm摇床过夜培养的LPN080菌液(培养基为EIM培养基)，8000rpm离心2min，用灭菌海水洗两次，用灭菌海水悬浮至菌液浓度OD600nm＝1(约8×108个细菌/ml)，取100μl(8×107个细菌)加入到实验组养殖的玻璃缸中，对照组加入等量灭菌海水，正常投喂饲料，于1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d记录存活数量。结果如下表1。

[0034] 表1鞘氨醇单胞菌LPN080对对虾存活率的影响

[0035]

[0036] 由表1可见，即使在高浓度的鞘氨醇单胞菌LPN080存在的情况下，实验组对照组与在对虾存活率方面没有任何差异，因此说明鞘氨醇单胞菌LPN080具有非常高的养殖动物安全性，非致病菌。

[0037] 实施例5：鞘氨醇单胞菌LPN080对弧菌抑制

[0038] 取养殖水样2L，加入2g葡萄糖，分装150ml到灭菌的250ml锥形瓶中。实验组(VE1、VE2、VE3、VE4)加入30℃，200rpm摇床过夜培养的LPN080菌液(培养基为EIM培养基)500μl，对照组(VC1、VC2、VC3、VC4)加入等量的EIM培养基。置于30℃，150rpm摇床中培养48h，各取水样用PBS缓冲液稀释105倍，100μl涂TCBS平板30℃恒温箱过夜培养，记录平板上弧菌菌落数，结果见下表2。

[0039] 表2鞘氨醇单胞菌LPN080对弧菌的抑制率

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[0042] 通过表2中数据可以看出，水样中加入LPN080菌液后，经过48小时的孵育，在105倍释的情况下，实验组的TCBS平板平均菌落不到1个，对照组TCBS平板平均菌落为13.5个，因此表明在水体中加入一定量葡萄糖的情况下，鞘氨醇单胞菌LPN080或以显著地竞争性抑制弧菌，表明鞘氨醇单胞菌LPN080除了可以降解氮氮外，还具强烈地竞争性抑制弧菌的功效。

[0043] 实施例6：鞘氨醇单胞菌LPN080制剂

[0044] 发酵培养基(SPM)成份：硫酸铵1.5kg、蛋白胨0.5kg、麸皮0.6kg、葡萄糖6kg、蔗糖6kg、玉米汁1.5kg、自来水1吨，以NaOH，调节pH至7.0，常规发酵罐灭菌，冷却。

[0045] 将鞘氨醇单胞菌LPN080培养液以1％(V/V)的比例接种到SPM培养基中，采用常规的发酵罐，进行常规的液体深层发酵，发酵温度30℃，发酵时间36h，发酵结束后，每升加入1.5g的海藻糖，充分混匀，得到鞘氨醇单胞菌LPN080制剂(即微生物制剂)，常温或4℃保存。

[0046] 实施例7：鞘氨醇单胞菌LPN080制剂应用

[0047] 鞘氨醇单胞菌LPN080制剂按每亩养殖水体(水深1m算)6公斤量使用。首先将鞘氨醇单胞菌LPN080制剂加入到4-10倍体积的养殖水中，按每升鞘氨醇单胞菌LPN080制剂加入80g红糖的量加入红糖，混匀后，室温放置10小时，全池泼洒即可。

[0048] 需要注意的是，上述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而不是限制本发明。在本发明的基础上，领域内的技术人员可以进行适当的改进或变形，而这些改进并不使相应的技术方案本质上脱离本发明的保护范围。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。