一种CARP-1基因及其应用

摘要

本发明涉及甲壳动物生长发育领域，具体涉及一种CARP‑1基因及其在促进日本沼虾生长中的应用。日本沼虾CARP‑1基因具有SEQ ID NO:1所示的碱基序列。本发明提供的引物从日本沼虾的肌肉中克隆了一种CARP‑1基因；根据CARP‑1基因的开放阅读框设计RNA干扰引物，将双链RNA注射到日本沼虾体内沉默CARP‑1基因，可使日本沼虾的蜕皮次周期缩短、生长速度加快，该结果为提升日本沼虾的生产性能提供了理论参考。本发明首次阐明了CARP‑1基因具有调控甲壳动物生长发育的功能。

权利要求

1.一种日本沼虾CARP-1基因的双链RNA在促进日本沼虾生长中的应用；

所述日本沼虾CARP-1基因的双链RNA的碱基序列如SEQ ID NO:5所示；

所述日本沼虾CARP-1基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种促进日本沼虾生长的制剂，其特征在于：含权利要求1所述的日本沼虾CARP-1基因的双链RNA（dsRNA）的溶液。

3.如权利要求2所述的促进日本沼虾生长的制剂，其特征在于： 利用RNA干扰（RNAi）技术，根据SEQ ID NO:1所示的碱基序列CARP-1基因的开放阅读框设计干扰引物，以日本沼虾的肌肉总RNA为模板进行PCR反应，再以PCR反应液为模板进行体外合成如SEQ ID NO:5所示的双链RNA（dsRNA），将获得的双链RNA（dsRNA）溶解于DEPC 水中即得到促进日本沼虾生长的制剂。

4.如权利要求3所述的促进日本沼虾生长的制剂，其特征在于：所述引物为正向上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种如权利要求4所述制剂的应用，其特征在于：所述制剂在干扰CARP-1基因促进日本沼虾生长中的应用。

说明书

一种CARP-1基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及甲壳动物生长发育领域，具体涉及一种CARP-1基因及其在促进日本沼虾生长中的应用。

背景技术

[0002] 生长发育是动物体最基本的生物学过程，甲壳动物亦不例外。由于几丁质外骨骼的存在，有关甲壳动物生长发育的研究多集中于蜕皮机制的调控方面，并取得了众多的研究成果。不可否认的是，蜕皮机制的确在甲壳动物的生长发育过程中发挥重要作用。但是也应清醒地认识到，甲壳动物躯体的生长才是造成蜕皮的原因。从这个角度来讲，蜕皮仅仅是甲壳动物生长的外在表现形式而已。因此，鉴定甲壳动物自身躯体生长的重要基因，不仅有助于了解甲壳动物生长发育这一基本的生物学过程，同时也对利用分子手段改良甲壳动物的产量和品质具有重要的生产意义。

[0003] 日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称青虾、河虾，隶属于十足目、长臂虾科、沼虾属。具有适应性强、生长速度快、繁殖力强、个体大、营养丰富等特点，是我国重要的淡水经济虾类。根据《2017年中国渔业统计年鉴》，我国养殖青虾年产量为272,592吨。日本沼虾养殖已经成为渔民增产创收的重要手段之一，在我国的水产养殖中发挥着重要作用。近来随着养殖规模的不断扩大，日本沼虾出现了生产性能下降和种质资源退化的现象，其中个体小型化尤为突出，最终导致商品虾的规格降低，严重影响了日本沼虾的品质，成为日本沼虾养殖业发展的瓶颈之一。为选育大规格日本沼虾的优良品种，鉴定调控日本沼虾生长发育的重要基因就成为当前亟待解决的问题。

发明内容

[0004] 本发明目的在于提供一种CARP-1基因及其在促进日本沼虾生长中的应用。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

[0006] 一种CARP-1基因，日本沼虾CARP-1基因具有SEQ ID NO:1所示的碱基序列。

[0007] 所述日本沼虾CARP-1基因为与SEQ ID NO:1所示的碱基序列同源性90％所示的序列。

[0008] 所述日本沼虾CARP-1基因的双链RNA为SEQ I NO:5所示的碱基序列。

[0009] 一种CARP-1基因的应用，所述日本沼虾CARP-1基因的双链RNA在促进日本沼虾生长中的应用。

[0010] 一种促进日本沼虾生长的制剂，含根据日本沼虾CARP-1基因，进行体外合成获得的双链RNA(dsRNA)的溶液；溶液指DEPC水或无菌水中。

[0011] 利用RNA干扰(RNAi)技术，根据SEQ ID NO:1所示的碱基序列CARP-1 基因的开放阅读框设计干扰引物，以日本沼虾的肌肉总RNA为模板进行PCR 反应，再以PCR反应液为模板进行体外合成如SEQ I NO:5所示的双链RNA (dsRNA)，将获得的双链RNA(dsRNA)溶解于水中即得到促进日本沼虾生长的制剂(dsRNA-CARP-1)。水为DEPC水或无菌水中。

[0012] 进一步的说：

[0013] 根据CARP-1基因的开放阅读框设计干扰引物，以日本沼虾的肌肉总RNA 为模板进行PCR反应(所得序列如SEQ ID NO:4所示)，以PCR反应液为模板进行体外合成dsRNA-CARP-1，而后溶于水中，溶解后将其注射到日本沼虾的围心腔内，剂量是5μg/g，进而促进日本沼虾的生长。

[0014] 所述引物为正向上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

[0015] 一种制剂的应用，所述制剂在干扰CARP-1基因促进日本沼虾生长中的应用；其中使用剂量是5μg/g。

[0016] 本发明所具有的优点：

[0017] 本发明首次鉴定了与日本沼虾生长发育相关的CARP-1基因，CARP-1基因在表达水平下降的条件下会使日本沼虾的生长加快，证明CARP-1基因是日本沼虾生长发育的负调控因子。本发明将dsRNA-CARP-1提供至到日本沼虾体内，其在dsRNA刺激下的表达变化及其对日本沼虾蜕皮周期、体重的变化，阐明CARP-1基因的功能，推动CARP-1在其它甲壳动物中的研究。

附图说明

[0018] 图1为本发明实施例提供的雄性日本沼虾注射dsRNA-CARP-1后的干扰效率图，其中：7d、14d、21d和28d分别是指注射后第7天、第14天、第21 天和第28天。**代表P<0.01，干扰组为注射dsRNA-CARP-1，对照组为注射相同剂量的DEPC水。

[0019] 图2为本发明实施例提供的雌性日本沼虾注射dsRNA-CARP-1后的干扰效率图，其中：7d、14d、21d和28d分别是指注射后第7天、第14天、第21 天和第28天。**代表P<0.01，干扰组为注射dsRNA-CARP-1，对照组为注射相同剂量的DEPC水。

具体实施方式

[0020] 下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

[0021] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0022] 本文使用的近似语在整个说明书和权利要求书中可用于修饰任何数量表述，其可在不导致其相关的基本功能发生变化的条件下准许进行改变。因此，由诸如“约”的术语修饰的值并不局限于所指定的精确值。在至少一些情况下，近似语可与用于测量该值的仪器的精度相对应。除非上下文或语句中另有指出，否则范围界限可以进行组合和/或互换，并且这种范围被确定为且包括本文中所包括的所有子范围。除了在操作实施例中或其他地方中指明之外，说明书和权利要求书中所使用的所有表示成分的量、反应条件等等的数字或表达在所有情况下都应被理解为受到词语“约”的修饰。

[0023] 本发明提供的引物从日本沼虾的肌肉中克隆了一种CARP-1基因；根据 CARP-1基因的开放阅读框设计RNA干扰引物，将双链RNA注射到日本沼虾体内沉默CARP-1基因，可使日本沼虾的蜕皮次周期缩短、生长速度加快，该结果为提升日本沼虾的生产性能提供了理论参考。本发明首次阐明了 CARP-1基因具有调控甲壳动物生长发育的功能。

[0024] 实施例1：日本沼虾CARP-1基因全长cDNA的获得

[0025] 总RNA提取：选取3g左右的日本沼虾，取其肌肉，放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速研磨。使用Takara公司的RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行提取肌肉的总RNA。经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品OD260/280比值在1.8～2.0之间，并测定RNA的浓度。

[0026] cDNA第一链合成：以上述RNA为模板，按照Takara M-MLV反转录试剂盒说明书进行第一链cDNA的合成。

[0027] 日本沼虾CARP-1全长cDNA序列的克隆：根据日本沼虾肌肉转录组的中间片段设计正向引物MF1(SEQ ID NO:6)、正向引物MR1(SEQ ID NO:7)和 MF2(SEQ ID NO:8)、正向引物MR2(SEQ ID NO:9)，进行中间片段的验证。 PCR扩增反应体系如下：

[0028]

[0029] PCR反应程序为：94℃预变性3min，然后进入下列循环：94℃30s，55 ℃30s，72℃90s，30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

[0030] 利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pMD18-T载体(Takara)，并转化入大肠杆菌 DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。

[0031] 根据CARP-1基因cDNA中间片段序列，设计特异性正向引物3F(SEQ ID NO:11)和5R(SEQ ID NO:12)分别进行3’和5’快速扩增，操作步骤按 RACE 5’/3’Kit试剂盒说明书进行。按上述克隆的步骤进行随后的切胶、回收、转化、克隆及测序最终得到CARP-1基因的3’和5’端序列。将中间片段和3’和5’端的测序结果进行比对，拼接得到日本沼虾CARP-1 基因全长cDNA序列(SEQ ID NO:1)。

[0032] 实施例2：日本沼虾CARP-1基因dsRNA的合成

[0033] 以SEQ ID NO:1核苷酸序列为依据，在CARP-1基因开放阅读框以内设计制备双链RNA的引物(SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3)，再以日本沼虾的肌肉总 RNA为模板进行如下PCR反应，

[0034]

[0035] 得到的序列如SEQ ID NO:4所示。

[0036] 而后根据Transcript AidTM T7High Yield Transcription kit (Fermentas,Inc.,USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA，以PCR反应液为模板进行体外合成双链RNA(dsRNA)如SEQ ID NO:5所示。

[0037] 将上述获得体外合成双链RNA(dsRNA)经1.5％琼脂糖凝胶鉴定，而后将 dsRNA序列(dsRNA-CARP-1)溶解在DEPC水中，待用。

[0038] 实施例3：注射dsRNA-CARP-1对日本沼虾生长发育的影响

[0039] 1.实验虾的选择

[0040] 挑选活力较强，个体均匀，体重在2g左右的成体雌雄沼虾各60只，平均分成两组(每组30只),一组为实验组(RNAi组)，即上述获得dsRNA-CARP-1 溶解液，另一组为DEPC水组对照组。实验组与对照组注射剂量为5μg/g；实验前在的玻璃缸内中充气暂养，水温为25℃，使其适应实验室养殖环境，每天早晚各投喂次螺狮和人工饵料。

[0041] 2.dsRNA注射和生长参数检测

[0042] 以5μg/g的注射剂量，将dsRNA-CARP-1溶解液从日本沼虾头胸甲基部注入围心腔内,对照组注射DEPC水。干扰时间为4周，每周注射一次。分别在7d、14d、21d和28d取肌肉组织并保存在RNA保存液中。最后提取各样品的总RNA并反转成cDNA。采用荧光定量PCR技术检测CARP-1相对于对照组的表达量变化，以此来计算干扰效率。实验结束测量对照组和实验组的体重，并分析数据(参见图1、图2和表1)。

[0043] 干扰效率＝干扰后的表达量/干扰前的表达量

[0044] 如图1所示，与对照组日本沼虾肌肉的表达量相比，实验组中雄性日本沼虾CARP-1的表达量在干扰后的7d、14d、21d和28d分别下降了88.81％、86.72％、 85.55％和91.80％。

[0045] 如图2所示，与对照组日本沼虾肌肉的表达量相比，实验组中雌性日本沼虾CARP-1的表达量在干扰后的7d、14d、21d和28d分别下降了87.52％、88.82％、 89.522％和86.95％。

[0046] 上述结果表明，dsRNA-CARP-1溶解液有效降低了CARP-1的表达水平。

[0047] 表1日本沼虾RNAi实验中蜕皮个体和平均体重的变化

[0048]

[0049] 如表1所示，RNAi干扰组中雄虾和雌虾的蜕皮个数分别为25只和22只，而对照组中雄虾和雌虾的蜕皮个数分别为12只和10只。与对照组相比，RNAi 干扰组雄雌虾的平均体重分别增重0.31g和0.29g。

[0050] 由上述结果表明，干扰CARP-1基因会导致日本沼虾的蜕皮周期缩短、生长加快，因此CARP-1在日本沼虾的生长发育过程中发挥重要调控功能。

[0051] SEQ ID NO:1

[0052]

[0053]

[0054]

[0055] SEQ ID NO:2

[0056] TAATACGACT CACTATAGGG AGCGTGTATT CACTGGGACC

[0057] SEQ ID NO:3

[0058] TAATACGACT CACTATAGGG TCCCGTCTAG GTGATCTTGG

[0059] SEQ ID NO:4

[0060]

[0061] SEQ ID NO:5

[0062]

[0063] SEQ ID NO:6

[0064] GAAGTCTAAT TGGACAGCCT CC

[0065] SEQ ID NO:7

[0066] AGACCTTTGC TGTTAAGCAT CC

[0067] SEQ ID NO:8

[0068] GGATGTCCGC AGCAGCTCGA GG

[0069] SEQ ID NO:9

[0070] CGTGAGATTT CCGAGCTTCG TC

[0071] SEQ ID NO:10

[0072] GATGGTGAAG TGACTGTCAA TACAGGAAG

[0073] SEQ ID NO:11

[0074] GAGGCTGGAT TTGTGCACTA GTCATCTGG

[0075] SEQ ID NO:11。