人凝血因子Ⅷ制品中vWF多聚体的检测方法

摘要

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种人凝血因子FⅧ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，依次包括胶制备、电泳、膜和滤纸处理、湿转、封闭、抗体孵育和显色等步骤，其特征在于：所述电泳步骤为连续垂直琼脂糖电泳，并在显色步骤后增加了定量分析步骤用以准确分析FⅧ制品中血管性血友病因子多聚体的质量。所述定量分析步骤为用凝胶分析软件计算供试品和混合血浆中每个条带相对含量，并以供试品中每个条带的相对含量与混合血浆中每个条带的相对含量的比值来做为评估血管性血友病因子多聚体质量的标准。本发明中可定量分析FⅧ制品中血管性血友病因子多聚体组成，从而评估FⅧ制品中vWF的质量，为FⅧ/vWF制品用于vWD的治疗提供理论依据。

权利要求

1.一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，依次包括胶制备、电泳、膜和滤纸处理、湿转、封闭、抗体孵育和显色步骤，其特征在于：所述电泳为连续垂直琼脂糖电泳，并在显色步骤后增加了定量分析步骤用以准确分析人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的质量；所述定量分析步骤为用凝胶分析软件计算供试品和混合血浆中每个条带相对含量，并以供试品中每个条带的相对含量与混合血浆中每个条带的相对含量的比值来作为评估血管性血友病因子多聚体质量的标准；

所述电泳为将处理好的样品加入上样孔，在电泳缓冲液中电泳；电泳条件为：恒流

10mA, 2-2.5h，直至溴酚蓝跑出玻璃板，结束电泳；

所述电泳与所述膜和滤纸处理步骤之间还有浸泡洗涤步骤，即胶取出后，用1 mMβ-巯基乙醇浸泡5min后用PBS-T洗3次，每次5min,在冰冷的湿转缓冲液中放置15min；

所述定量分析步骤中，将供试品中第5条带之后的条带合在一起分析，并以混合血浆作为标准对照分析人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体组成，即用供试品中每个条带的相对含量与混合血浆中每个条带的相对含量的比值来评估血管性血友病因子多聚体的质量，用百分比表示来反映血管性血友病因子多聚体的质量。

2.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述胶制备为将琼脂糖溶于缓冲液中，加热至沸腾，倒入垂直玻璃板中，插入梳子制造上样孔，放置一段时间待胶凝固。

3.根据权利要求2所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖浓度为1%-1.2%，缓冲液为连续凝胶缓冲液，具体配方包括：30%甘油，50mM Tris，0.384M Gly和0.1%SDS。

4.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述样品为待测的人凝血因子Ⅷ制品和作为标准对照的混合血浆；待测的人凝血因子Ⅷ制品和混合血浆用纯水将其稀释至血管性血友病因子抗原（vWF：Ag）含量

1IU/ml，再与上样缓冲液按1:4的比例混合,最后加入溴酚蓝使其终浓度为0.005%；所述上样缓冲液包括9M尿素，4mM EDTA，50mM Tris，2% SDS, 上样缓冲液pH为6.8。

5.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述电泳缓冲液的具体配方包括50mM Tris，0.384M Gly，0.1%SDS，电泳缓冲液pH为8.3；所述湿转缓冲液的具体配方包括2.5mM Tris, 19.2mM Gly，0.1%SDS，湿转缓冲液pH为8.8。

6.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述显色步骤为PBS-T洗膜5次，每次5min；然后膜与发光试剂盒中混合液充分接触,采用超灵敏化学发光成像仪捕捉信号；将膜上有蛋白的那面朝下与发光试剂盒混合液充分接触30s-2min。

说明书

人凝血因子Ⅷ制品中vWF多聚体的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及人凝血因子Ⅷ制品(Human Coagulation Factor Ⅷ，以下简称FⅧ制品，)中血管性血友病因子(von Willebrand Factor，以下简称vWF) 多聚体组成的检测方法。

背景技术

[0002] FⅧ制品是由健康人血浆分离提纯而来，以FⅧ为主要药物成分的血浆蛋白制品，在临床上主要用于治疗先天缺乏FⅧ的甲型血友病。而在生产过程中vWF与FⅧ不易分开，大部分FⅧ制品中都含有vWF，因此FⅧ制品也用于治疗von Willebrand病，一种vWF数量减少或质量异常导致的出血性疾病。FⅧ制品中的vWF主要有2个功能：一个是作为FⅧ的载体保护FⅧ不被降解，另一个是介导血小板黏附于损伤的血管壁并诱导血小板聚集，发挥止血功能。vWF在血浆中以多聚体形式存在，分为高分子量多聚体(含有11-20个二聚体)，中分子量多聚体(含有5-10个二聚体)和低分子量多聚体(含有1-5个二聚体)。

[0003] 研究表明尽管所有分子量的vWF均有FⅧ载体功能，但vWF的止血功能与vWF多聚体分子量大小有关，只有高分子量vWF多聚体具有较强的血小板结合能力，中分子量vWF多聚体仅有较低的血小板结合能力，而低分子量vWF多聚体不具有与血小板结合的能力。因此用于治疗vWD的FⅧ制品必须含有高分子量和中分子量vWF多聚体。在评估FⅧ制品是否可用于治疗vWD时，需对FⅧ制品进行vWF多聚体分析。

[0004] 传统的vWF多聚体分析方法常用SDS-琼脂糖电泳和Western blot来分析，包括以下几个步骤：(1)进行不连续水平板SDS-琼脂糖电泳，大约需6-8小时。(2)进行湿转移，电转时间12-20h。(3)进行一抗、二抗孵育和底物显色，大约需要16h。传统的vWF多聚体分析方法操作复杂、耗时长，需要3-5天，且未进行定量分析，因此不适合用于分析FⅧ制品中vWF多聚体组成。

发明内容

[0005] 本发明的目的是克服现有检测技术所存在的上述不足，建立一种快速灵敏，可定量分析 FⅧ制品中vWF多聚体组成的方法，该方法适用于定量分析FⅧ制品中vWF多聚体组成；克服了传统方法中水平板琼脂糖电泳耗时长及不连续的垂直板琼脂糖电泳在制备过程中操作非常困难的技术问题。

[0006] 解决以上技术问题的本发明中的一种人凝血因子Ⅷ制品中vWF多聚体的检测方法，依次包括胶制备、电泳、膜和滤纸处理、湿转、封闭、抗体孵育和显色步骤，其特征在于：所述电泳步骤为连续垂直琼脂糖电泳，并在显色步骤后增加了定量分析步骤用以准确分析FⅧ制品中vWF多聚体的质量。所述定量分析步骤为用凝胶分析软件计算供试品和混合血浆中每个条带相对含量，并以供试品中每个条带的相对含量与混合血浆中每个条带的相对含量的比值来做为评估vWF多聚体质量的标准。

[0007] 本发明中方法为连续的垂直板琼脂糖电泳，容易操作，减少制胶步骤。

[0008] 所述电泳步骤与膜和滤纸处理步骤之间还有浸泡洗涤步骤，即胶取出后，用1mMβ- 巯基乙醇浸泡5min后用PBS-T洗3次，每次5min，在电泳缓冲液中放置15min。

[0009] 电泳结束后，用β-巯基乙醇处理胶，使胶上所有条带都裂解为单体，再进行电转移，提高转膜效率。

[0010] vWF多聚体是分子量从500kD-5000kD不等，采用同样的电转时间，可能造成一些低分子量的vWF已经转过，即穿过膜了，而一些高分子量的vWF多聚体还未转到膜上去。因此电泳后用1mMβ-巯基乙醇处理，β-巯基乙醇将所有的不同分子量大小的vWF多聚体裂解成 vWF单体再进行转膜，减少转膜时间且转膜效果更好。若β-巯基乙醇处理浓度过大或时间过久，条带转到膜上会变模糊。PBS-T洗涤为去除胶上的β-巯基乙醇，若不洗干净影响转膜效果，可洗3次，每次洗5min。

[0011] 所述胶制备步骤为将琼脂糖溶于缓冲液中，加热至沸腾，倒入垂直玻璃板中，插入梳子制造上样孔，放置一段时间待胶凝固。

[0012] 所述琼脂糖浓度为1％-1.2％，缓冲液为连续凝胶缓冲液，具体配方包括：30％甘油， 50mM Tris，0.384M Gly和0.1％SDS。连续电泳，只有分离胶，没有浓缩胶，胶中加了30％甘油起到浓缩效果。本发明中连续胶更容易配置，减少操作步骤，同时具有好的效果。

[0013] 所述连续垂直电泳步骤为将处理好的样品加入上样孔，再在电泳缓冲液中电泳；电泳条件为：恒流10mM,2-2.5h，直至溴酚蓝跑出玻璃板，结束电泳。电流的大小影响电泳的时间，电流过大，电泳时间很短，跑出的条带不是一条直线，条带会弯曲；电流过小，电泳时间过长，条带会弥散。

[0014] 所述样品为待测的FⅧ制品和作为标准对照的混合血浆；待测的FⅧ制品和混合血浆用纯水将其稀释至vWF：Ag含量1IU/ml，再与上样缓冲液按1:4比例混合,最后加入溴酚蓝使其终浓度为0.005％；所述上样缓冲液包括9M尿素，4mM EDTA，50mM Tris，2％SDS，pH为 6.8。

[0015] 混合血浆是作为一个标准参考品与供试品对比来说明FⅧ制品中vWF多聚体组成是否有异常。

[0016] 所述电泳缓冲液为冰冷的湿转缓冲液，即将溶液在4℃放置。将溶液在4℃放置一段时间，作用是使胶降温，减少胶在转膜过程中所产的热，提高转膜效果。

[0017] 所述电泳缓冲液为包括50mM Tris，0.384M Gly，0.1％SDS，pH为8.3；所述湿转步骤中湿转缓冲液为包括2.5mM Tris,19.2mM Gly，0.1％SDS，pH为8.8；120V湿转1h。

[0018] 所述定量分析步骤中将第5条带之后的条带(中分子量和高分子量vWF)合在一起分析，并以混合血浆作为标准对照分析FⅧ制品中vWF多聚体组成，即用供试品中每条带的相对含量与混合血浆中每条带的相对含量的比值来评估vWF多聚体的质量，用百分比表示来反映vWF多聚体的质量。

[0019] 将第5条带之后的带合在一起作为一个整体来分析，通过用供试品中每个多聚体的相对含量与混合血浆中每个多聚体的相对含量的比值，来说明FⅧ制品中vWF多聚体组成是否有异常，而这种比较通过定量分析增加了量化标准，而不是仅肉眼观察条带，增加了检测准确性。

[0020] 本发明中检测方法具体如下：

[0021] (1)胶制备：琼脂糖溶于缓冲液中，加热至沸腾，倒入垂直玻璃板中，插入梳子制造上样孔，放置一段时间待胶凝固，直接使用或低温保存；

[0022] (2)连续垂直电泳：将处理好的样品(包括待测的FⅧ制品和做为标准对照的千人份混合血浆)加入上样孔，电泳缓冲液中电泳，电泳条件为：恒流10mM,2-2.5h，直至溴酚蓝跑出玻璃板，结束电泳。

[0023] (3)膜和滤纸处理：剪切PVDF膜和滤纸，PVDF膜在甲醇中浸泡后放置在湿转缓冲液中电转平衡，滤纸放置在湿转缓冲液中浸湿；PVDF膜用甲醇浸泡作用是活化膜，胶、膜、滤纸在湿转缓冲液中浸泡的目的是使胶和膜上充满电转缓冲液中的离子，提高电转效率。

[0024] 胶和膜在湿转缓冲液中平衡15-30min，滤纸放置在湿转缓冲液中5min，电压采用恒流或恒压，优选为恒压，电压保持恒定。

[0025] (4)湿转：滤纸、胶、膜和滤纸依次从上到下装成三明治结构放入转移槽中，加入湿转缓冲液；电转过程中注意放入冰盒散热，因为湿转过程会产很多热，如不放入冰盒降温，产热过多，电阻增加，电流下降，影响电转效果。

[0026] (5)封闭：电泳结束后，取出PVDF膜，PBS-T洗膜后放置在封闭液中封闭1h；

[0027] 洗涤液(PBS-T)为0.02M PBS含0.1％吐温-20；封闭液为0.02M PBS含5％BSA；洗涤 3次，每次5min。

[0028] (6)一抗孵育：用PBS-T洗膜后放置在用抗体稀释液1:3000稀释的一抗中37℃、 2h或4℃过夜孵育，优选4℃过夜孵育。若过夜温度选择室温或37℃，抗原抗体反应过强，造成背景颜色过深，影响条带观察。

[0029] (7)二抗孵育：用PBS-T洗膜放置在用抗体稀释液1:2000稀释的二抗中室温孵育1h；抗体稀释液为0.02M PBS-T含0.5％BSA。

[0030] 一抗为抗人的vWF抗体，即兔抗人的vWF抗体、鼠抗人或其他种属抗人的vWF抗体，或为单克隆抗体，或多克隆抗体。

[0031] (8)显色：PBS-T洗膜5次，每次5min后，膜与发光试剂盒中混合液充分接触,采用超灵敏化学发光成像仪捕捉信号；将膜上有蛋白的那面朝下与发光试剂盒混合液充分接触 30s-2min。

[0032] (9)定量分析：用凝胶分析软件定量分析供试品和混合血浆每个条带，即每个多聚体的相对含量。并以混合血浆作为标准对照分析FⅧ制品中vWF多聚体组成，用百分比表示。

[0033] 本发明在vWF多聚体分析中用定量分析，减少或无肉眼观察，减少主观性和误差。且本发明中定量分析在第5条带之后的带(即中分子量和高分子量vWF)合在一起做为一个整体分析，通过将混合血浆作为标准参考品与供试品做比较来说明FⅧ制品中vWF多聚体组成是否有异常(用百分比表示)。

[0034] 本发明能定量分析检测样品中的vWF多聚体分布，且大大降低了操作的复杂程度和缩短了时间，有效确保了试验结果的真实性和可靠性。

附图说明

[0035] 下面结合附图及具体实施方式对本发明做更进一步详细说明：

[0036] 图1为本发明中结果分析图

[0037] (其中1.国内A厂家FⅧ制品，2.国内B厂家FⅧ制品，3.国内C厂家FⅧ制品(60倍稀释)，4.国内C厂家FⅧ制品，5.国内D厂家FⅧ制品，6.国外E厂家FⅧ制品，7.国外F 厂家FⅧ制品(100倍稀释)，8.正常人混合血浆)；

[0038] 图2为本发明中试验三中专属性考察图

[0039] (其中1.国内A厂家FⅧ制品，2.正常人混合血浆，3.国内B厂家FⅧ制品，4.国内 C厂家FⅧ制品，5.国内D厂家FⅧ制品，6.国内E厂家FⅧ制品，7.用未稀释的冷上清)；

[0040] 图3为本发明中试验四未用β-巯基乙醇处理图；

[0041] 图4为本发明中试验五β-巯基乙醇处理时间过长的结果分析图。

具体实施方式

[0042] 下面结合具体实施方式和附图对本发明作详细的说明，其中所用仪器与试剂如下：

[0043] 仪器及参数：小型转印槽(Mini Trans-blot Cell，BIO-RAD)；小型垂直电泳槽(Mini Protein Tetra，BIO-RAD)；凝胶成像系统(ImageQuant LAS 4000mini，GE)；凝胶分析软件(ImageQuant TL，GE)；

[0044] 测试用试剂：HGT琼脂糖(Seakem，FMC Bioproducts)，PVDF膜(Immobilon-P, Millipore)，兔抗人vwf多克隆抗体(Dako),羊抗兔偶联HRP二抗(北京中杉)，BSA，吐温 -20，PBS缓冲液，化学发光底物试剂盒( West Pico Chemiluminescent
Substrate，Thermoscientific)，溴酚蓝，尿素，EDTA，Tris，甘氨酸，甲醇，β-巯基乙醇，多人份混合血浆。

[0045] 实施例1

[0046] 检测方法如下：

[0047] (1)胶制备：琼脂糖溶于缓冲液中，加热至沸腾，倒入垂直玻璃板中，插入梳子制造上样孔，放置一段时间待胶凝固，直接使用或低温保存；琼脂糖浓度为1％，缓冲液为连续凝胶缓冲液，具体配方包括：30％甘油，50mM Tris，0.384M Gly和0.1％SDS。

[0048] (2)连续垂直电泳：将处理好的样品(包括待测的FⅧ制品和作为标准对照的千人份混合血浆)加入上样孔，电泳缓冲液中电泳，电泳条件为：恒流10mM,2h，直至溴酚蓝跑出玻璃板，结束电泳。

[0049] 样品为待测的FⅧ制品和做为标准对照的混合血浆；待测的FⅧ制品和混合血浆用纯水将其稀释至vWF：Ag含量1IU/ml，再与上样缓冲液按1:4比例混合,最后加入溴酚蓝使其终浓度为0.005％；所述上样缓冲液包括9M尿素，4mM EDTA，50mM Tris，2％SDS，pH为6.8。

[0050] (3)膜和滤纸处理：剪切PVDF膜和滤纸，PVDF膜在甲醇中浸泡后放置在湿转缓冲液中电转平衡，滤纸放置在湿转缓冲液中浸湿；PVDF膜用甲醇浸泡作用是活化膜，胶、膜、滤纸在湿转缓冲液中浸泡的目的是使胶和膜上充满电转缓冲液中的离子，提高电转效率。

[0051] 胶和膜在湿转缓冲液中平衡15min，滤纸放置在湿转缓冲液中5min，电压采用恒流或恒压，优选为恒压，电压保持恒定。

[0052] (4)湿转：滤纸、胶、膜和滤纸依次从上到下装成三明治结构放入转移槽中，加入湿转缓冲液；电转过程中注意放入冰盒散热，因为湿转过程会产很多热，如不放入冰盒降温，产热过多，电阻增加，电流下降，影响电转效果。

[0053] (5)封闭：电泳结束后，取出PVDF膜，PBS-T洗膜后放置在封闭液中封闭1h；

[0054] 洗涤液(PBS-T)为0.02M PBS含0.1％吐温-20；封闭液为0.02M PBS含5％BSA。

[0055] 洗涤3次，每次5min，若洗涤不充分，可能造成膜上结果背景较强，影响最终条带的显示。若封闭时间不够，使得封闭效果不理想，造成非特异结合增多，可能造成膜上结果背景较强，影响最终条带的显示。

[0056] (6)一抗孵育：用PBS-T洗膜后放置在用抗体稀释液1:3000稀释的一抗中37℃、2h或4 ℃过夜孵育，优选4℃过夜孵育。若过夜温度选择室温或大于37℃，抗原抗体反应过强，造成背景颜色过深，影响条带观察。

[0057] (7)二抗孵育：用PBS-T洗膜放置在用抗体稀释液1:2000稀释的二抗中室温孵育1h；抗体稀释液为0.02M PBS-T含0.5％BSA。

[0058] 一抗为抗人的vWF抗体，即兔抗人的vWF抗体、鼠抗人或其他种属抗人的vWF抗体，或为单克隆抗体，或多克隆抗体。单克隆抗体是针对vWF某一特定位点的抗体，多克隆抗体是针对vWF多个位点的抗体，这里选择多克隆抗体是因为多克隆抗体能扑捉更多的vWF。

[0059] 稀释液浓度过低导致抗原抗体反应较弱，条带不清晰；稀释浓度过高易造成抗体的浪费和背景较深。

[0060] (8)显色：PBS-T洗涤5次，每次5min，膜与发光试剂盒中混合液充分接触,采用超灵敏化学发光成像仪捕捉信号；将膜上有蛋白的那面朝下与发光试剂盒混合液充分接触30s-2min。

[0061] (9)定量分析：用凝胶分析软件定量分析供试品和混合血浆每个条带，即每个多聚体的相对含量。并以混合血浆做为标准对照分析FⅧ制品中vWF多聚体组成，用百分比表示。

[0062] 实施例2

[0063] 检测方法如下：

[0064] (1)胶制备：琼脂糖溶于缓冲液中，加热至沸腾，倒入垂直玻璃板中，插入梳子制造上样孔，放置一段时间待胶凝固，直接使用或低温保存；琼脂糖浓度为1.2％，缓冲液为连续凝胶缓冲液，具体配方包括：30％甘油，50mM Tris，0.384M Gly和0.1％SDS。

[0065] (2)连续垂直电泳：将处理好的样品(包括待测的FⅧ制品和作为标准对照的千人份混合血浆)加入上样孔，电泳缓冲液中电泳，电泳条件为：恒流10mM,2.5h，直至溴酚蓝跑出玻璃板，结束电泳。

[0066] 样品为待测的FⅧ制品和作为标准对照的混合血浆；待测的FⅧ制品和混合血浆用纯水将其稀释至vWF：Ag含量1IU/ml，再与上样缓冲液按1:4比例混合,最后加入溴酚蓝使其终浓度为0.005％；所述上样缓冲液包括9M尿素，4mM EDTA，50mM Tris，2％SDS，pH为6.8。

[0067] (3)浸泡洗涤步骤，即胶取出后，用1mMβ-巯基乙醇浸泡5min后用PBS-T洗3次，每次 5min，在电泳缓冲液中放置15min。

[0068] (4)膜和滤纸处理：剪切PVDF膜和滤纸，PVDF膜在甲醇中浸泡后放置在湿转缓冲液中电转平衡，滤纸放置在湿转缓冲液中浸湿；PVDF膜用甲醇浸泡作用是活化膜，胶、膜、滤纸在湿转缓冲液中浸泡的目的是使胶和膜上充满电转缓冲液中的离子，提高电转效率。

[0069] 胶和膜在湿转缓冲液中平衡30min，滤纸放置在湿转缓冲液中5min，电压采用恒流或恒压，优选为恒压，电压保持恒定。

[0070] (5)湿转：滤纸、胶、膜和滤纸依次从上到下装成三明治结构放入转移槽中，加入湿转缓冲液；电转过程中注意放入冰盒散热，因为湿转过程会产很多热，如不放入冰盒降温，产热过多，电阻增加，电流下降，影响电转效果。

[0071] (6)封闭：电泳结束后，取出PVDF膜，PBS-T洗膜后放置在封闭液中封闭1h；

[0072] 洗涤液(PBS-T)为0.02M PBS含0.1％吐温-20；封闭液为0.02M PBS含5％BSA。

[0073] PBS-T洗3次，每次5min。

[0074] (7)一抗孵育：用PBS-T洗膜后放置在用抗体稀释液1:3000稀释的一抗中37℃、2h或4 ℃过夜孵育，优选4℃过夜孵育。

[0075] (8)二抗孵育：用PBS-T洗膜放置在用抗体稀释液1:2000稀释的二抗中室温孵育1h；抗体稀释液为0.02M PBS-T含0.5％BSA。

[0076] 一抗为抗人的vWF抗体，即兔抗人的vWF抗体、鼠抗人或其他种属抗人的vWF抗体，或为单克隆抗体，或多克隆抗体。

[0077] (9)显色：PBS-T洗膜5次，每次5min，膜与发光试剂盒中混合液充分接触,采用超灵敏化学发光成像仪捕捉信号；将膜上有蛋白的那面朝下与发光试剂盒混合液充分接触30s-2min。

[0078] (10)定量分析：将第5条带之后的条带(中分子量和高分子量vWF)合在一起分析，并以混合血浆做为标准对照分析FⅧ制品中vWF多聚体组成，即用供试品中每条带的相对含量与混合血浆中每条带的相对含量的比值来评估vWF多聚体的质量，用百分比表示来反映vWF多聚体的质量。

[0079] 实施例3

[0080] 供试品：先按照制品说明书将FⅧ制品复溶，复溶后放置至少20min，待样品完全溶解。用纯水将样品稀释至vWF：Ag含量1IU/ml。FⅧ制品是冻干的粉末，用水溶解。再配制各种溶液：

[0081] 连续凝胶缓冲液：60ml甘油，1.21g Tris，5.76Gly，0.2g SDS溶于200ml纯水；

[0082] 上样缓冲液：54.04g尿素，0.15g EDTA，0.61g Tris，2g SDS溶于100ml纯水；

[0083] 电泳缓冲液：12.1g Tris，57.6g Gly,2g SDS溶于2L纯水；

[0084] 湿转缓冲液：0.303g Tris,1.44g Gly，1g SDS溶于1L纯水；

[0085] 洗涤液(PBS-T)：0.02M PBS含0.1％吐温-20；

[0086] 封闭液：0.02M PBS含5％BSA；

[0087] 抗体稀释液：0.02M PBS-T含0.5％BSA。

[0088] 供试品配制：按1.2稀释的供试品或混合血浆与上样缓冲液按1:4比例混合,最后加入溴酚蓝使其终浓度为0.005％。

[0089] 制备具体步骤如下：

[0090] (1)胶制备：1％琼脂糖：0.2gHTG溶于20ml连续凝胶缓冲液中，微波炉加热至沸腾，倒入2块垂直玻璃板中，迅速插入梳子，制造上样孔，放置30min后待胶凝固，此胶可4 ℃保存3天或直接使用。

[0091] (2)连续垂直电泳：将处理好的样品加入上样孔，上样量6ul/孔，电泳条件为：恒流 10mM,2.2h，直至溴酚蓝跑出玻璃板，结束电泳。垂直板的琼脂糖凝胶，与水平板琼脂糖胶比较节约了时间。

[0092] (3)胶取出后，用1mMβ-巯基乙醇浸泡5min后用PBS-T洗3次，每次5min，在冰冷的湿转缓冲液中放置15min。

[0093] (4)膜和滤纸处理：PVDF膜和滤纸剪成和凝胶大小等同，PVDF膜在甲醇中浸泡1-2min，放置在冰冷的湿转缓冲液中15min，滤纸放置在湿转缓冲液中5min。

[0094] (5)湿转：滤纸、膜、胶按如下装成三明治结构放入转移槽中：从负极到正极(从上到下)：滤纸+胶+膜+滤纸，加入湿转缓冲液，120V湿转1h。电转过程中注意放入冰盒散热。

[0095] 电泳缓冲液为包括50mM Tris，0.384M Gly，0.1％SDS，pH为8.3；所述湿转步骤中湿转缓冲液为包括2.5mM Tris,19.2mM Gly，0.1％SDS，pH为8.8，120V湿转1h。

[0096] (6)封闭：电泳结束后，取出PVDF膜，PBS-T洗膜3次，每次5min，膜放置在封闭液中封闭1h。

[0097] (7)一抗孵育：PBS-T洗膜3次，每次5min，膜放置在用抗体稀释液1:3000稀释的一抗 (兔抗人vwf多克隆抗体)4℃过夜中孵育。

[0098] (8)二抗孵育：PBS-T洗膜3次，每次5min，膜放置在用抗体稀释液1:2000稀释的二抗 (羊抗兔联HRP)室温孵育1h。

[0099] (9)显色：PBS-T洗膜5次，每次5min，发光试剂盒中试剂Luminol/Enhancer与 Stable Peroxide1:1混合，讲混合液体滴在保鲜膜上,PVDF膜蛋白面朝下与混合液充分接触 2min,然后采用Image Quant Las 4000mini捕捉信号。

[0100] (10)计算：加入定量分析，采用Image Quant TL软件分析供试品和混合血浆每个条带(每个多聚体)相对含量。由于高分子量多聚体条带不易完全分开，将第5条带之后的带合在一起分析。比较混合血浆和供试品多聚体分布情况，用百分比表示。

[0101] 实验结果和分析，如图1。

[0102] 用第4泳道(国内厂家D为例分析：1次结果分析)：采用Image Quant TL软件分析供试品和混合血浆每个条带(每个多聚体)相对含量，并用供试品中每条带的相对含量与混合血浆中每条带的相对含量的比值来评估vWF多聚体的质量:

[0103] 1)厂家D每条带相对含量：第一条带：7.8％，第二条带：10％，第三条带：12.7％，第四条带：12.3％，第五条带：10.7％，第六条带：46.5％。

[0104] 2)混合血浆每条带相对含量：第一条带：6％，第二条带：9.1％，第三条带：12％，第四条带：12.3％，第五条带：10.1％，第六条带：50.5％。

[0105] 3)供试品中每条带的相对含量与混合血浆中每条带的相对含量的比值,用百分比表示：第一条带：7.8％/6％＝130％，第二条带：10％/9.1％＝110％，第三条带：12.7％/12％＝106％，四条带：12.3％/12.3％＝100％，第五条带：10.7％/10.1％＝106％，第六条
46.5％/50.5％＝92％。

[0106] 通过分析可得知D厂家FⅧ制品中反映中分子量和高分子量vWF多聚体的第6条带与血浆比值为92％，小于100％，说明D厂家FⅧ制品中vWF中分子量多聚体和高分子量多聚体含量低于正常人血浆。

[0107] 试验一：重复性

[0108] 目的：确定在同一个试验内同一个供试品在测量范围内测定的精密度。

[0109] 步骤：按照实施例3中方法操作，供试品在同一块凝胶上重复上样10次。

[0110] 结果：第1条带相对含量：6.3％，标准差：1.7％，变异系数(CV)27.2％；

[0111] 第2条带相对含量：9.6％，标准差：1.9％，变异系数(CV)19.3％；

[0112] 第3条带相对含量：12.2％，标准差：1.6％，变异系数(CV)12.7％；

[0113] 第4条带相对含量：12.3％，标准差：1.1％，变异系数(CV)9.2％；

[0114] 第5条带相对含量：11.2％，标准差：1.0％，变异系数(CV)8.5％；

[0115] 第6条带相对含量：48.4％，标准差：3.7％，变异系数(CV)7.7％；

[0116] 可接受标准：重复测定结果变异系数不超过30％。

[0117] 试验二：中间精密度

[0118] 目的：考察在同一个实验室，不同时间由不同分析人员不同批号用同一设备测定结果之间的精密度。

[0119] 步骤：不同时间，按照实施例3中方法操作，3块琼脂糖凝胶重复测定(即不同时间做了三次实验)，操作步骤同上重复性检查试验。

[0120] 结果：第1条带平均相对含量：7.3％，标准差：1.2％，变异系数(CV)16.4％；

[0121] 第2条带平均相对含量：9.9％，标准差：1.5％，变异系数(CV)15.2％；

[0122] 第3条带平均相对含量：12.3％，标准差：1.2％，变异系数(CV)9.8％；

[0123] 第4条带平均相对含量：11.7％，标准差：1.1％，变异系数(CV)9.4％；

[0124] 第5条带平均相对含量：10.6％，标准差：1.4％，变异系数(CV)13.2％；

[0125] 第6条带平均相对含量：48.2％，标准差：4.2％，变异系数(CV)8.7％；

[0126] 可接受标准：每个条件内测定结果变异系数不得过30％。可见本发明中检测方法是可重复性，误差小。

[0127] 试验三：专属性

[0128] 目的：考察制品中其他组分是否影响测定结果。

[0129] 步骤：用未稀释的冷上清(vWF和FⅧ含量极低而其他血浆成分正常)做为样品，进行 vWF多聚体分析，操作步骤如实施例3中步骤。

[0130] 结果如图2：无条带，说明制品中其他组分不会引起非特异性免疫反应。

[0131] 试验四

[0132] 具体内容如实施例3中内容，其中无“胶取出后，用1mMβ-巯基乙醇浸泡5min后用 PBS-T洗3次，每次5min，在冰冷的湿转缓冲液中放置15min”步骤。

[0133] 检测结果如图3，图中无法显示出相应的内容。

[0134] 试验五

[0135] 具体内容如实施例3中内容，其中浸泡步骤为“胶取出后，用1mMβ-巯基乙醇浸泡 10min后用PBS-T洗3次，每次5min，在冰冷的湿转缓冲液中放置15min”。

[0136] 检测结果如图4，β-巯基乙醇处理时间过长，图中无法显示出相应的内容。

[0137] 本发明中通过胶制备、连续垂直琼脂糖电泳、膜和滤纸处理以及湿转和封闭等步骤，并通过计算供试品和混合血浆中每个条带所占比例和计算供试品中每个条带的相对含量与混合血浆中每个条带的相对含量的比值，来定量分析vWF多聚体的质量。本发明可定量分析F Ⅷ制品中vWF多聚体组成，从而评估FⅧ制品中vWF的质量，为FⅧ/vWF制品用于vWD的治疗提供理论依据。

[0138] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。