基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置

摘要

本发明公开一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置，属于显微光谱成像和分析化学技术领域。本方法利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光，通过采用时空聚焦在样品中产生聚焦线、收集所激发荧光并采用共焦光学狭缝滤除杂散光、采集荧光光谱信息完成样品的光谱信息(x,λ)获取，最后由三维空间扫描与延时扫描获取样品(x,λ,y,z,t)五维信息。本装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、以及滤波与同步光谱共焦探测系统，且滤波与同步光谱共焦探测系统中的光谱信息获取与结合时空聚焦技术的线扫描系统中线扫描触发信号同步。本发明具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、高光谱分辨率等优点。

权利要求

1.一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，设定沿激光光谱方向为λ轴，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，设定实现沿样品纵向线扫描的振镜偏转角步长，设定实现沿样品轴向扫描的显微物镜轴向步长，根据目标扫描区域的大小设定光谱信息采集周期和扫描总时长；

2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；

3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线；

4)通过非线性光学效应在步骤3)的聚焦线上激发出荧光信号，该荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，然后由滤波片滤除反射的超短脉冲激光并由共焦光学狭缝滤除样品散射引起的杂散光，得到样品的条形发射荧光；

5)通过色散元件将得到的条形发射荧光进行光谱展开，由面阵探测器进行光谱信息采集，得到样品的(x,λ)二维信息；同时，根据设定的振镜偏转角步长改变线扫描的偏转角，获得样品的(x,λ,y)三维信息，直至扫描遍历XY目标区域，完成样品二维平面不同位置光谱信息的获取；其中，所述面阵探测器的探测区域大小完全覆盖所述条形发射荧光的展开程度，且所述面阵探测器与振镜的触发信号同步；

6)根据设定的显微物镜轴向步长改变聚焦线的深度，获得样品的(x,λ,y,z)四维信息，直至扫描遍历XYZ目标区域，完成不同深度光谱信息的获取，得到样品内三维空间不同位置的光谱信息；当前扫描周期结束，执行步骤7)；

7)根据设定的光谱信息采集周期重复步骤3)～步骤6)进行延时超光谱显微成像，获得样品的(x,λ,y,z,t)五维信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场层析超光谱显微成像。

2.一种根据权利要求1所述基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法的装置，其特征在于，包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、以及滤波与同步光谱共焦探测系统；其中，所述超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整所述激发脉冲光光束尺寸；

所述基于时空聚焦的线扫描系统，置于所述光束变换系统之后，包括光学衍射元件、透镜及光学扫描元件，所述光学衍射元件和所述光学扫描元件分别置于所述透镜的物方焦面与像方焦面；所述光学衍射元件用于引入激发脉冲光束的角色散，所述光学扫描元件用于引入激发脉冲光束的可变偏转角；

所述光学显微系统，置于所述光学扫描元件之后，包括透镜组及显微物镜，由所述透镜组连接所述光学扫描元件和显微物镜后入瞳面，构成4f系统，该光学显微系统用于在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以激发组织样品并基于非线性光学效应产生发射荧光；

所述滤波与同步光谱共焦探测系统，置于所述基于时空聚焦的线扫描系统中发射荧光经所述显微物镜收集并反向传输的光学扫描元件之后，包括滤波片、共焦光学狭缝及光谱仪，用于选出样品的发射荧光信号并进行光谱信息采集；所述光谱仪的信息获取与所述基于时空聚焦的线扫描系统的触发信号同步。

3.根据权利要求2所述的基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法的装置，其特征在于，所述超短脉冲激光光源及光束变换系统中，在超短脉冲激光输出之前还设有色散预补偿系统，用于预补偿超短脉冲在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散。

4.根据权利要求2所述的基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法的装置，其特征在于，所述基于时空聚焦技术的线扫描系统还包括置于所述光学衍射元件沿激发光传播方向经透镜后的傅里叶面处的自适应光学元件，用于进行光谱相位整形，进一步克服生物样品散射对最终成像造成的影响。

5.根据权利要求2所述的基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法的装置，其特征在于，所述超短脉冲激光光源及光束变换系统中，超短脉冲激光光源依照输出脉冲宽度，选用飞秒脉冲激光光源或皮秒脉冲激光光源；超短脉冲激光光源依照输出波长是否可调，选用固定波长的超短脉冲激光光源或可调谐波长的超短脉冲激光光源；光束变换系统为伽利略望远镜系统或开普勒望远镜系统；

该超短脉冲激光光源及光束变换系统提供产生非线性光学信号的激发光中非线性光学信号通过双光子吸收荧光效应、三光子吸收荧光效应或双光子激发-荧光共振能量转移效应中的任一种产生。

6.根据权利要求2所述的基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法的装置，其特征在于，所述滤波与同步光谱共焦探测系统中，光谱仪由色散元件、二维面探测器和两个透镜组成；其中，所述共焦光学狭缝置于样品激发面的共轭面，第一透镜将共焦光学狭缝与色散元件构成物像关系，第二透镜将色散元件与二维面探测器构成物像关系。

说明书

基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置，属于显微光谱成像和分析化学技术领域。

背景技术

[0002] 超光谱显微成像(Hyperspectral Microscopy)在生物医学研究领域有着重要应用，尤其是在临床疾病诊断、术中图像导航等领域日益受到人们的广泛重视。采用超光谱显微成像技术获取空间可分辨的光谱信息，可为疾病诊断提供生物组织的生理参数、形貌及组份等信息。目前，采用超光谱显微成像技术，已可实现对多种癌症的非侵入式检测。

[0003] 从本质上讲，超光谱显微成像技术是在显微成像的基础上获取更高维信息(即光谱信息)的技术。依据显微成像技术的实现方式，当前的超光谱显微成像技术可分为基于普通宽场显微的超光谱显微成像技术、基于共聚焦扫描的超光谱显微成像技术等。前者可快速并行获取宽视场内的光谱信息，但限于普通宽场显微不具备层析能力、易受组织散射造成信号串扰等缺点，该技术仅适用于透明生物样本。后者基于共聚焦原理，一定程度上抑制了组织散射的影响且获得了轴向分辨能力，但由于需要进行逐点扫描成像，成像速度受到限制。此外，近年来还出现了基于光片显微的超光谱显微成像技术，遗憾的是该技术同样不适于散射性组织成像。

[0004] 为了克服生物组织散射的影响并提高成像穿透深度，人们将非线性光学显微技术引入到超光谱显微成像中，发展了基于非线性光学效应的超光谱显微技术，并广泛应用于生物医学研究。由于普通非线性光学显微技术大多仍采用点扫描方式以克服组织散射的影响，成像的速度及通量势必受到影响。另一方面，采用面激发的非线性光学显微虽然免除了逐点扫描导致的速度瓶颈，但所激发信号经组织散射后串扰严重，不适于散射组织光谱成像。采用线扫描方式的普通非线性光学显微技术可以在成像速度与抑制散射影响二者之间折衷，但是该方法相对于点扫描方式所获得的轴向分辨率降低，亦非理想的选择。

[0005] 因此，目前需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何能够创新地提出一种有效措施，以解决现有技术中存在的不足。

发明内容

[0006] 本发明的目的是为了克服已有技术的不足之处，提供一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置。本发明适用于散射性生物组织成像，可提高成像速度和通量，并具有高轴向分辨率。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 本发明提出的一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0009] 1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，设定沿激光光谱方向为λ轴，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，设定实现沿样品纵向线扫描的振镜偏转角步长，设定实现沿样品轴向扫描的显微物镜轴向步长，根据目标扫描区域的大小设定光谱信息采集周期和扫描总时长；

[0010] 2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；

[0011] 3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线；

[0012] 4)通过非线性光学效应在步骤3)的聚焦线上激发出荧光信号，该荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，然后由滤波片滤除反射的超短脉冲激光并由共焦光学狭缝滤除样品散射引起的杂散光，得到样品的条形发射荧光；

[0013] 5)通过色散元件将得到的条形发射荧光进行光谱展开，由面阵探测器进行光谱信息采集，得到样品的(x,λ)二维信息；同时，根据设定的振镜偏转角步长改变线扫描的偏转角，获得样品的(x,λ,y)三维信息，直至扫描遍历XY目标区域，完成样品二维平面不同位置光谱信息的获取；其中，所述面阵探测器的探测区域大小完全覆盖所述条形发射荧光的展开程度，且所述面阵探测器与振镜的触发信号同步；

[0014] 6)根据设定的显微物镜轴向步长改变聚焦线的深度，获得样品的(x,λ,y,z)四维信息，直至扫描遍历XYZ目标区域，完成不同深度光谱信息的获取，得到样品内三维空间不同位置的光谱信息；当前扫描周期结束，执行步骤7)；

[0015] 7)根据设定的光谱信息采集周期重复步骤3)～步骤6)进行延时超光谱显微成像，获得样品的(x,λ,y,z,t)五维信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场层析超光谱显微成像。

[0016] 本发明还提出一种根据上述基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法的装置，其特征在于，包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、以及滤波与同步光谱共焦探测系统；其中，

[0017] 所述超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整所述激发脉冲光光束尺寸；

[0018] 所述基于时空聚焦的线扫描系统，置于所述光束变换系统之后，包括光学衍射元件、透镜及光学扫描元件，所述光学衍射元件和所述光学扫描元件分别置于所述透镜的物方焦面与像方焦面；所述光学衍射元件用于引入激发脉冲光束的角色散，所述光学扫描元件用于引入激发脉冲光束的可变偏转角；

[0019] 所述光学显微系统，置于所述光学扫描元件之后，包括透镜组及显微物镜，由所述透镜组连接所述光学扫描元件和显微物镜后入瞳面，构成4f系统，该光学显微系统用于在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以激发组织样品并基于非线性光学效应产生发射荧光；

[0020] 所述滤波与同步光谱共焦探测系统，置于所述基于时空聚焦的线扫描系统中发射荧光经所述显微物镜收集并反向传输的光学扫描元件之后，包括滤波片、共焦光学狭缝及光谱仪，用于选出样品的发射荧光信号并进行光谱信息采集；所述光谱仪的信息获取与所述基于时空聚焦的线扫描系统的触发信号同步。

[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：通过采用基于时空聚焦方法的线扫描技术，并提出相应的同步光谱共焦探测技术，可保证高轴向分辨率、低散射信号串扰及高速光谱信息获取，所实现的宽视场层析超光谱显微成像技术适用于深层组织宽视场高速层析显微光谱成像。

[0022] 概括而言，所提出的宽视场层析超光谱显微成像技术可用于深层生物组织的(x,y,z,t,λ)五维信息获取，具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、高光谱分辨率等优点。

附图说明

[0023] 图1是本发明所述的宽视场层析超光谱显微成像装置的结构示意图。

[0024] 图2是本发明的原理示意图。

[0025] 图3是本发明装置实施实例1的结构示意图。

[0026] 图4是本发明装置实施实例2的结构示意图。

具体实施方式

[0027] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。

[0028] 本发明提出的一种宽视场层析超光谱显微成像方法，具体包括以下步骤：

[0029] 1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，设定沿激光光谱(即波长)方向为λ轴，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，设定实现沿样品纵向线扫描的振镜偏转角步长，设定实现沿样品轴向扫描的显微物镜轴向步长，根据目标扫描区域的大小设定光谱信息采集周期和扫描总时长；

[0030] 2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；

[0031] 3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线(沿x方向，通过改变振镜的偏转角可实现聚焦线的y方向扫描)；

[0032] 4)通过非线性光学效应在步骤3)的聚焦线上激发出荧光信号，该荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，然后由滤波片滤除反射的超短脉冲激光并由共焦光学狭缝滤除样品散射引起的杂散光，得到样品的条形发射荧光；

[0033] 5)通过色散元件将得到的条形发射荧光进行光谱展开，由面阵探测器进行光谱信息采集，得到样品的(x,λ)二维信息；同时，根据设定的振镜偏转角步长改变线扫描的偏转角，获得样品的(x,λ,y)三维信息，直至扫描遍历XY目标区域，完成样品二维平面不同位置光谱信息的获取；其中，面阵探测器的探测区域大小完全覆盖条形发射荧光的展开程度，且面阵探测器与振镜的触发信号同步；

[0034] 6)根据设定的显微物镜轴向步长改变聚焦线的深度，获得样品的(x,λ,y,z)四维信息，直至扫描遍历XYZ目标区域，完成不同深度光谱信息的获取，得到样品内三维空间不同位置的光谱信息；当前扫描周期结束，执行步骤7)；

[0035] 7)根据设定的光谱信息采集周期重复步骤3)～步骤6)进行延时超光谱显微成像，获得样品的(x,λ,y,z,t)五维信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场层析超光谱显微成像。

[0036] 本发明还根据上述方法提出一种宽视场层析超光谱显微成像装置，其结构如图1所示，包括：超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、以及滤波与同步光谱共焦探测系统；其中，

[0037] 超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整激发脉冲光光束尺寸；

[0038] 基于时空聚焦的线扫描系统，置于上述光束变换系统之后，包括光学衍射元件、透镜及光学扫描元件，光学衍射元件及光学扫描元件分别置于透镜的物方焦面与像方焦面；光学衍射元件用于引入激发脉冲光束的角色散，光学扫描元件用于引入激发脉冲光束的可变偏转角；

[0039] 光学显微系统，置于上述光学扫描元件之后，包括透镜组及显微物镜，由透镜组连接上述光学扫描元件及显微物镜后入瞳面，并构成4f系统，用于在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线，以激发组织样品并基于非线性光学效应产生发射荧光；

[0040] 滤波与同步光谱共焦探测系统，置于基于时空聚焦的线扫描系统中发射荧光经显微物镜收集并反向传输的光学扫描元件之后，包括滤波片、共焦光学狭缝及光谱仪，用于选出样品的发射荧光信号并进行光谱信息采集；其中，光谱仪的信息获取与基于时空聚焦的线扫描系统的触发信号同步。

[0041] 进一步地，超短脉冲激光光源及光束变换系统中，在超短脉冲激光输出之前还设有色散预补偿系统，用于预补偿超短脉冲在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散。

[0042] 进一步地，基于时空聚焦技术的线扫描系统还包括置于光学衍射元件沿激发光传播方向经透镜后的傅里叶面处的自适应光学元件，用于进行光谱相位整形，进一步克服生物样品散射对最终成像造成的影响。

[0043] 本发明装置中各组成部分的具体实现方式如下：

[0044] 超短脉冲激光光源及光束变换系统中，超短脉冲激光光源依照输出脉冲宽度，可选用飞秒脉冲激光光源或皮秒脉冲激光光源；超短脉冲激光光源依照输出波长是否可调，可选用固定波长的超短脉冲激光光源或可调谐波长的超短脉冲激光光源；光束变换系统为伽利略望远镜系统或开普勒望远镜系统。超短脉冲激光光源及光束变换系统提供产生非线性光学信号的激发光中非线性光学信号通过双光子吸收荧光效应、三光子吸收荧光效应或双光子激发-荧光共振能量转移效应中的任一种产生。

[0045] 基于时空聚焦技术的线扫描系统中，光学衍射元件可选用光栅、变形镜、空间光调制器或其他光学衍射元件；光学扫描元件选用振镜、多面镜或声光调制器等。

[0046] 滤波与同步光谱共焦探测系统中，滤波片选用二色镜、带通滤波片、低通滤波片或长通滤波片。共焦光学狭缝置于生物样品激发面的共轭面，该共焦光学狭缝的宽度由样品共轭像的设计尺寸决定。光谱仪由色散元件、二维面探测器和两个透镜组成，第一透镜将共焦光学狭缝与色散元件构成物像关系，第二透镜将色散元件与二维面探测器构成物像关系；色散元件可选用棱镜、光栅或其他色散元件；二维面探测器选用电荷耦合元件(CCD)、电子倍增电荷耦合元件(EMCCD)或科学级互补金属氧化物半导体器件(sCMOS)等。

[0047] 参照图2，示出了本发明的原理示意图。利用非线性光学效应并结合时空聚焦技术(美国发明专利US20080151238A1)可在生物样品上产生具有高轴向分辨率的聚焦线(x方向)，所激发的荧光光谱信号经共焦探测在光谱仪的二维光电探测面(Dx,Dy)上成像，其中Dy方向即为光谱λ维度。通过在样品的y方向进行扫描，并进行同步共焦探测，可获得样品在宽视场下的(x,λ,y)三维信息。利用该技术的轴向层析能力进行轴向扫描(即改变移动样本与显微物镜的相对位置)，可获得样品的(x,λ,y,z)四维信息；进一步地，利用该技术的高速光谱显微成像能力进行延时信息采集(即采集不同时刻的样品(x,λ,y,z)四维信息)，可获得样品的(x,λ,y,z,t)五维信息。可见，本发明所提出的宽视场层析超光谱显微成像方法及其装置具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、高光谱分辨率等优点，可为生物动态过程研究、疾病诊断依据等提供丰富信息。

[0048] 实施例1：

[0049] 下面参照图3，详细叙述本实施例的宽视场层析超光谱显微成像装置，该装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、滤波与同步光谱共焦探测系统，生物样品放置在样品台319上。其中，超短脉冲激光光源及光束变换系统中的超短脉冲激光光源301采用飞秒激光器(如Coherent Chameleon Discovery系列)，光束变换系统采用由透镜302和柱透镜303构成的开普勒望远镜系统(为4f系统)；基于时空聚焦的线扫描系统包括透射光栅304、透镜305和扫描振镜307；光学显微系统包括两个透镜308、309和显微物镜310；滤波与同步光谱共焦探测系统包括二色镜306，低通滤波片311，透镜312，共焦光学狭缝313(光学狭缝宽度由生物样品共轭像的设计尺寸决定)，以及由两个透镜314、316，反射光栅315和二维面探测器(采用sCMOS或EMCCD)317构成的光谱仪。
上述元器件的相对位置关系为：透镜302与柱透镜303构成4f系统进行扩束，透射光栅304置于柱透镜303的像面处，透镜305将透射光栅304成像在扫描振镜307处，透镜308与309构成
4f系统使得扫描振镜307与显微物镜310的入瞳面共轭，透镜312与透镜308构成4f系统使得物面成像在共焦光学狭缝313处，低通滤波片311紧置于透镜312之前，透镜314将共焦光学狭缝313成像在反射光栅315，透镜316将反射光栅315成像在二维面探测器317。图3中还示意出了计算机318，用于控制扫描振镜307的偏转角度，并对二维面探测器317采集到的光谱信息进行常规的图像重建与数据处理。

[0050] 该实施例中超短脉冲激光光源301所发出的激光束经透镜302、柱透镜303扩束(改变激光束的直径)后入射到透射光栅304，在透射光栅304的作用下该超短脉冲光束产生角色散(目的是使得该引入角色散的光束经后续光学元件后充满物镜的后焦面)，经透镜305准直后透过二色镜306投射到扫描振镜307上并引入可变偏转角(该偏转角由振镜驱动电压驱动，根据扫描区域设定偏转角度)，最后经由透镜308、309及显微物镜310在生物样品中的物镜焦面上产生聚焦线。由非线性光学效应所产生的光信号经显微物镜310收集后反向传输，依次经过透镜309、308及扫描振镜307，并被二色镜306反射。之后，该信号光束依次经过低通滤波片311、透镜312及共焦光学狭缝313，最后进入光谱仪进行信号收集。需要注意的是，扫描振镜307的行扫描触发信号与二维面探测器317的帧触发信号同步。采用上述技术方案，可获得生物样品的(x,λ,y)三维信息。通过移动显微物镜310进行轴向扫描，可获得样本的(x,λ,y,z)四维信息。若进行延时信息采集，可获得样本的(x,λ,y,z,t)五维信息。

[0051] 实施例2：

[0052] 下面参照图4，详细叙述本实施例的宽视场层析超光谱显微成像装置，本实施例与实施例1的区别在于增设了自适应光学元件。本实施例装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、滤波与同步光谱共焦探测系统，生物样品放置在样品台424上；其中，超短脉冲激光光源及光束变换系统中的超短脉冲激光光源401采用飞秒激光器(如Coherent Chameleon Discovery系列)，光束变换系统采用由透镜402和柱透镜403构成的开普勒望远镜系统(为4f系统)；基于时空聚焦的线扫描系统包括透射光栅404，五个透镜405、407、408、410、411，设置于透镜405和407之间的自适应光学元件406(本实施例采用空间光调制器)，扫描振镜412；光学显微系统包括两个透镜413、414，显微物镜415；滤波与同步光谱共焦探测系统包括二色镜409，低通滤波片416，普通透镜417，共焦光学狭缝418(光学狭缝宽度由生物样品共轭像的设计尺寸决定)，以及由两个透镜419、421，反射光栅420和二维面探测器(采用sCMOS或EMCCD)422构成的光谱仪。上述元器件的相对位置关系为：透镜402与柱透镜403构成4f系统进行扩束，透射光栅404置于柱透镜
403的像面处，透镜405将透射光栅404成像在空间光调制器406处，透镜407与408、透镜410与411、透镜413与414分别构成3组串联的4f系统使得空间光调制器406与扫描振镜412及显微物镜415的入瞳面共轭，透镜417与410构成4f系统使得物面成像在共焦光学狭缝418处，低通滤波片416紧置于透镜417之前，透镜419将共焦光学狭缝418成像在反射光栅420，透镜
421将反射光栅420成像在二维面探测器422。图4中还示意出了计算机423，用于控制扫描振镜412的偏转角度，并对二维面探测器422采集到的光谱信息进行常规的图像重建与数据处理。

[0053] 该实施例中，超短脉冲激光光源401所发出的激光束经透镜402、柱透镜403扩束后入射到透射光栅404，在透射光栅404的作用下该超短脉冲光束产生角色散，经透镜405准直后投射到空间光调制器406进行光谱相位整形，以进一步克服组织散射的影响，之后依次经过透镜407、透镜408、二色镜409、透镜410、透镜411在扫描振镜412上引入可变偏转角，最后经由透镜413、414及显微物镜415在生物样品中的物镜焦面上产生聚焦线。由非线性光学效应所产生的荧光信号经显微物镜415收集后反向传输，依次经过透镜414、透镜413、扫描振镜412、透镜411、透镜410，并被二色镜409反射。之后，该信号光束依次经过低通滤波片416、透镜417及共焦光学狭缝418，最后进入光谱仪进行信号收集。需要注意的是，扫描振镜412的行扫描触发信号与二维面探测器422的帧触发信号同步；空间光调制器406是采用自适应光学方法测量波前畸变并施加补偿波前(在光谱成像前进行)。采用上述技术方案，可获得生物样品的(x,λ,y)三维信息。通过移动显微物镜415进行轴向扫描，可获得生物样品的(x,λ,y,z)四维信息。若进行延时信息采集(即多次采集)，可获得生物样品的(x,λ,y,z,t)五维信息。

[0054] 实际实验中，考虑到所需激发光功率可能大于空间光调制器的光损伤阈值，还可能需要在空间光调制器406之前增加透镜组，使得光束在垂直于光谱扩展的方向上展开至光强低于空间光调制器的光损伤阈值及以下。

[0055] 综上，本发明通过结合时空聚焦技术进行线扫描技术，并提出了相应的同步光谱共焦探测技术，保证了高轴向分辨率及低散射信号串扰，适于深层组织层析光谱显微成像；提高了光谱信息获取速度，可实现宽视场高速光谱显微成像。

[0056] 以上对本发明所提出的宽视场层析超光谱显微成像方法与装置进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，这些改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。