萝卜硫素制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物应用

摘要

本发明提供了萝卜硫素制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物应用。本发明采用萝卜硫素进行了鸡胚试验，结果证明，一定浓度的萝卜硫素不会导致鸡胚死亡，并且能够有效缓解酒精微环境诱导的胚胎血管发育不良。本发明提供了萝卜硫素的新用途，不仅扩大了萝卜硫素的应用范围，提高了其应用价值，还有助于进一步开发新的药物，比如以萝卜硫素为先导化合物，通过结构修饰或改造，或有望进一步提高其活性或降低副作用，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.萝卜硫素和/或其药用盐在制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物中的应用。

2.根据权利要求1中所述的萝卜硫素和/或其药用盐在制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物中的应用，其特征在于：所述的萝卜硫素的有效浓度为小于20μM。

3.根据权利要求2中所述的萝卜硫素和/或其药用盐在制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物中的应用，其特征在于：所述的萝卜硫素的有效浓度为2～10μM。

4.根据权利要求1～3任一项中所述的萝卜硫素和/或其药用盐在制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物中的应用，其特征在于：所述的保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

5.根据权利要求4中所述的萝卜硫素和/或其药用盐在制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物中的应用，其特征在于：所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

6.根据权利要求1～3任一项中所述的萝卜硫素和/或其药用盐在制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物中的应用，其特征在于：所述的保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射液。

说明书

萝卜硫素制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，特别涉及萝卜硫素制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物应用。

背景技术

[0002] 妊娠期饮酒会增加生理、心理和神经行为等方面障碍的风险。胎儿酒精综合症(FAS)是一种由于怀孕母亲频繁饮酒所造成的永久先天缺陷。在美国，胎儿酒精综合症影响大约2％～5％的人群；在南非，胎儿酒精综合症发生率可以高达9％(Riley et al.,2011)，胎儿酒精综合症与脑、四肢、颅面和心血管系统的缺陷有关(Abel,1984,1995；Jones et al.,1973)。由于血管系统的发生是胚胎早期发育过程中的最早进程之一，处于胚胎发育过程中的致畸敏感期，对妊娠的维持以及其他器官的正常发育都具有重要作用。人和鼠的胚胎受到酒精暴露后，其外皮血管的发育也会受损(Jegou et al.,2012)，血管损伤还可能是胎儿酒精综合症中大脑发育异常的因素。

[0003] 萝卜硫素(Sulforaphane，SFN)，又称“莱菔硫烷”，是硫代葡萄糖苷的衍生物，属于异硫氰酸酯类物质，其富含于十字花科蔬菜中，如西兰花芽(Keum et al.,2005)。有可靠证据表明富含萝卜硫素的西兰花芽及其他来源的食用性萝卜硫素，可通过激活Nrf2信号通路，诱导二相解毒酶和抗氧化酶的产生，并且有助于预防癌症及其他疾病(Dinkova-Kostova et al.,2002)。

[0004] 目前萝卜硫素的专利多集中在其提取制备技术上，例如一种萝卜硫素的纯化方法(CN104961667B)，一种萝卜硫素胶囊的制备方法(CN103705488B)，一种连续制备萝卜硫素的方法(CN104803900B)，萝卜硫素的合成方法(CN102249968B)等。在萝卜硫素的应用方面，多集中在其对成体健康保护作用的专利，尚无胎儿发育保护方面的专利，例如抑制紫外光诱导的皮肤癌发生的药物(CN101208079B)，萝卜硫素的肝脏保护作用及其在非酒精性脂肪肝中的应用(CN 201610938091.2)等。

[0005] 胚胎的心血管系统的发育主要自于胚胎中胚层和内胚层细胞，原基的形成在胚胎发育的早期，其生理状态、机能等与成体细胞或成熟机体均存在较大差异，例如，在胚胎发育的早期，尚无乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶等的产生；而胚胎发育的早期，细胞对于细胞毒性更为敏感。目前对萝卜硫素的细胞毒性，尤其是对于胚胎发育时期(特别是发育早期)的细胞毒性尚不明确，能否用作、如何用于保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育不可预知，有待研究探索；而萝卜硫素在保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物中的应用也尚未开发。

发明内容

[0006] 萝卜硫素虽然具有良好的抗氧化能力和广泛的抗肿瘤作用，但是能否抑制胚胎发育过程中酒精微环境诱导的血管发育损伤尚不明确。鉴于此，本发明基于发明人团队前期所建立的酒精诱导的鸡胚血管发育不良的模型(Wang et al.,J ApplToxicol,2016)，进一步对萝卜硫素在该模型中的保护作用进行研究，提供萝卜硫素及其衍生物在保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育中的新用途。具体为萝卜硫素在制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物应用，一定浓度的萝卜硫素不会导致胚胎死亡，并且能够有效缓解酒精微环境诱导的胚胎血管发育不良的应用。

[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0008] 萝卜硫素在制备保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物中的应用。

[0009] 所述的萝卜硫素的有效浓度优选为小于20μM；进一步优选为2～10μM。

[0010] 所述的保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物含有萝卜硫素和其药用盐中的至少一种。

[0011] 所述的保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

[0012] 所述的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

[0013] 所述的保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育药物可以采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂等口服给药的剂型及注射液等口服以外的给药剂型，如针剂等。

[0014] 本发明所述的萝卜硫素(SFN)分子式为C6H11NOS2，分子量为177.29，具有图1的结构。本发明采用萝卜硫素进行了鸡胚试验，结果证明，一定浓度萝卜硫素不会导致鸡胚死亡，并且能够有效缓解酒精微环境诱导的胚胎血管发育不良，具体具有如下优点：

[0015] (1)一定浓度萝卜硫素不会影响鸡胚发育，促进鸡胚尿囊膜血管发育。

[0016] (2)一定浓度萝卜硫素促进鸡胚卵黄囊血管发育。

[0017] (3)萝卜硫素显著改善酒精环境导致的胚胎体重降低及尿囊膜血管发育不良。

[0018] (4)萝卜硫素显著改善酒精环境导致卵黄囊血管发育不良。

[0019] (5)萝卜硫素抑制酒精环境诱导的血管氧化应激升高。

[0020] (6)萝卜硫素抑制酒精环境诱导的血管细胞凋亡。

[0021] (7)萝卜硫素显著改善酒精环境诱导的内质网应激水平。

[0022] (8)萝卜硫素显著改内质网应激诱导的血管发育不良。

[0023] 目前对萝卜硫素的研究多集中在其提取制备技术和抗肿瘤活性等作用上，尚无安全性较高的针对保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育的药物。本发明提供了萝卜硫素的新用途，不仅扩大了萝卜硫素的应用范围，提高了其应用价值，还有助于进一步开发新的药物，比如以萝卜硫素为先导化合物，通过结构修饰或改造，或有望进一步提高其活性或降低副作用。

附图说明

[0024] 图1是萝卜硫素的化学结构。

[0025] 图2是不同浓度的萝卜硫素对鸡胚尿囊膜血管发育影响的结果分析图。

[0026] 图3是不同浓度的萝卜硫素对鸡胚卵黄囊血管发育影响的结果分析图。

[0027] 图4是萝卜硫素改善酒精环境导致的胚胎体重降低及尿囊膜血管发育不良的结果分析图。

[0028] 图5是萝卜硫素改善酒精环境导致的卵黄囊血管发育不良的结果分析图。

[0029] 图6是萝卜硫素对酒精环境诱导的血管氧化应激水平的影响的结果分析图。

[0030] 图7是萝卜硫素对酒精环境诱导的血管细胞凋亡情况的影响的结果分析图。

[0031] 图8是萝卜硫素对酒精环境诱导的内质网应激水平的影响的结果分析图。

[0032] 图9是萝卜硫素对内质网应激诱导的血管发育不良的影响的结果分析图。

具体实施方式

[0033] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0034] 以下实施例中所用的萝卜硫素购自Sigma(sc-204638)。

[0035] 实施例1 一定浓度萝卜硫素不会影响鸡胚发育，促进鸡胚尿囊膜血管发育[0036] 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上具有丰富的血管系统，是经典的检测血管发育的模型。为了长时间研究萝卜硫素(SFN)对血管发育的影响，我们在孵育1.5天的已受精鸡蛋气室中加入2.5μM、5.0μM、10.0μM、20.0μM和40.0μM五个不同浓度的萝卜硫素，对照组加入相应量的0.01％DMSO(200μL)，每隔一日加一次药，孵育到9天后取材发现实验组(图2.C-G)的血管生成比对照组(图2.B)明显呈增多趋势，并且在CAM上血管的主要分支加入萝卜硫素后也是显著的增多，但是高浓度的萝卜硫素(20.0μM和40.0μM)可造成少量胚胎的死亡(图2.H)。对孵育9天的胚胎称重，发现随着SFN浓度增加胚胎体重呈升高趋势(图2.I)，CAM上血管密度的测量统计(图2.J)也表明萝卜硫素能促进新生血管的形成(**p<0.01,***p<0.001)。

[0037] 实验证实，在鸡胚模型中，低于10.0μM萝卜硫素是良好促进血管发育的剂量，且安全性较高。

[0038] 实施例2 一定浓度萝卜硫素促进鸡胚卵黄囊血管发育

[0039] 我们利用鸡胚卵黄膜实验研究不同浓度的萝卜硫素对鸡胚卵黄膜血管新生的影响。将孵育60小时后的鸡胚置于已灭菌的结晶皿中，在卵黄囊膜两侧血管新生区域均称的放入两个灭菌过的白色硅胶圈，圈边缘对侧用两个红色点(对照侧)、黑色点(实验侧)指示血管新生起始的区域(图3.A-F)。我们采集了放入硅胶圈加过酒精后0、12、24和36小时YSM的图片(图3.A-F3)。我们对比了各浓度萝卜硫素的对照侧和实验侧血管生长的程度和延伸范围，发现加入2.5μM、5.0μM、10.0μM侧萝卜硫素的血管生长均比对照侧的血管生长快速，血管密度也较高(图3.A1-D3)，其中加入10.0μM萝卜硫素侧的血管生长比对照侧显著加快，延伸范围显著增大(图3.D1-D3)。然而在加入较高浓度萝卜硫素(20.0μM和40.0μM)下的血管生长并没有呈现促进趋势(图3.E1-F3)，并且40.0μM萝卜硫素侧的血管生长比对照侧的血管生长迟缓，延伸范围较小，血管密度也较低(图3.F1-F3)，12小时和24小时血管生长的主要边缘出现了缺损(图3.F1-F2)。血管密度统计显示，2.5μM、5.0μM、10.0μM萝卜硫素组比对照组的血管密度均呈增加趋势，20.0μM萝卜硫素组与对照组的血管密度没有明显差异，40.0μM萝卜硫素组比对照组的血管密度呈减少趋势(图3.G)，说明高于20.0μM的萝卜硫素能抑制血管生长，对卵黄膜细胞存在一定的毒性作用(*p<0.05,**p<0.01)。

[0040] 实验证实，在鸡胚模型中，低于10.0μM萝卜硫素是良好促进血管发育的剂量。

[0041] 实施例3萝卜硫素显著改善酒精环境导致的胚胎体重降低及尿囊膜血管发育不良[0042] 为了研究萝卜硫素对酒精环境下的血管发育的影响，我们在孵育1.5天的已受精鸡蛋气室中加入酒精、10μM萝卜硫素和酒精+10μM萝卜硫素，对照组加入相应量的0.01％DMSO，每隔一日加一次药，孵育到9天后取材。发现酒精组血管生长受损(图4.C-C1)，血管密度明显减小(图4.E)(*p<0.05)，并且胚胎体重明显降低(图4.G)(**p<0.01)。10μM萝卜硫素组血管生长良好(图4.B-B1)，胚胎体重与对照组接近。酒精+10μM萝卜硫素组与酒精组比较，血管生长改善，血管的主要分支明显增多(图4.D-D1)，血管密度显著上升(图4.E)(##p<0.01)，酒精+10μM萝卜硫素组的胚胎体重也与对照组接近。对尿囊膜组织进行石蜡切片，随后采用了H&E染色(图4.A2-D2)和CAV-1血管上皮细胞标记物(图4.A3-D3)来标记，并对血管直径进行统计，结果显示萝卜硫素组血管直径显著增大，酒精组血管直径显著减小，酒精+
10μM萝卜硫素组与不添加萝卜硫素的酒精组相比，血管直径显著增大(图4.F)(与正常组相比，*p<0.05；与酒精组相比，##p<0.01)。我们对血管发育相关基因VEGFA和FGF2进行了检测，实时荧光定量PCR结果证实，酒精+10μM萝卜硫素组VEGFA和FGF2的表达水平与酒精组相比显著上升(图4.H、I)(与正常组相比，*p<0.05,**p<0.01；与酒精组相比，#p<0.05,##p<
0.01)。

[0043] 实验证实，在鸡胚模型中，萝卜硫素显著改善酒精环境导致的胚胎体重降低及尿囊膜血管发育不良。

[0044] 实施例4萝卜硫素显著改善酒精环境导致卵黄囊血管发育不良

[0045] 为了观察萝卜硫素是否能够促进酒精环境下的鸡胚早期血管发育，于已灭菌的结晶皿中，在卵黄囊膜两侧血管新生区域均称的放入两个灭菌过的白色硅胶圈，圈边缘对侧用两个红色点(对照侧)、黑色点(实验侧)指示血管新生起始的区域(图5.A-F)。我们采集了放入硅胶圈加过酒精后0、12、24和36小时YSM的图片(图5.A-F3)。我们对比了各浓度萝卜硫素的对照侧和实验侧血管生长的程度和延伸范围，发现加入酒精侧的血管生长比对照侧的血管生长迟缓，血管密度明显降低(图5.D1-D3)。加入酒精+5μM萝卜硫素和酒精+10μM萝卜硫素侧的血管生长12h时较对照侧的血管生长略有迟缓(图5.E1-F1)，但是在24h和36h时较对照侧的血管生长快速，血管密度也较高(图5.E2-F3)。与不添加萝卜硫素的酒精处理的血管生长比较，添加5μM和10μM萝卜硫素的酒精处理的血管生长快速，延伸范围较大，血管密度也较高(图5.D1-F3)，虽然12h和24h血管生长的主要边缘也出现了损伤，但是损伤程度较酒精处理组减轻(图5.E1-F2)。血管密度统计显示，5μM和10μM萝卜硫素组比对照组的血管密度均呈增加趋势，酒精组血管密度显著下降，酒精+5μM萝卜硫素和酒精+10μM萝卜硫素处理组在24h和36h时血管密度呈增加趋势，与酒精组比较，血管密度显著增加(图5.G)。实验表明，5μM和10μM萝卜硫素均能够促进酒精抑制下的鸡胚早期血管发育(与正常组相比，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；与酒精组相比，#p<0.05,###p<0.001)。

[0046] 实验证实，在鸡胚模型中，萝卜硫素显著改善酒精环境导致的卵黄囊血管发育不良。

[0047] 实施例5萝卜硫素抑制酒精环境诱导的血管氧化应激升高

[0048] 有数据表明，酒精能增加机体的氧化应激，产生过多的氧自由基。而过多的氧自由基对机体的器官和组织均有损害。萝卜硫素作为一种抗氧化剂，可增强机体抵御外源和内源性侵害带来的氧化应激的能力。为了探究萝卜硫素是否能够抑制酒精诱导细胞内ROS产生，我们收集了正常组、酒精组和酒精+5μM萝卜硫素组、酒精+10μM萝卜硫素组处理的卵黄膜，对产生的活性氧自由基进行定量检测。结果表明，酒精处理下ROS的产生量明显增加，而酒精与5μM萝卜硫素同时处理下ROS的产生量趋向正常组，与没有添加5μM SFN的酒精处理下的卵黄膜相比，添加了5μM萝卜硫素的酒精处理下的卵黄膜中ROS的产生量明显低于酒精处理组(图6，A)。用10μM萝卜硫素重复上述实验并检测各组卵黄膜ROS的产生量，得到了相似的结果(图6，B)。这表明5μM和10μM萝卜硫素能清除卵黄膜中过量的活性氧自由基。统计结果具有显著性差异(与正常组相比，*p<0.05,***p<0.001；与酒精组相比，##p<0.01,###p<0.001)。

[0049] 实验证实，在鸡胚模型中，酒精诱导的血管氧化应激升高可以通过添加5μM或10μM萝卜硫素得到改善。

[0050] 实施例6萝卜硫素抑制酒精环境诱导的血管细胞凋亡

[0051] 酒精会增加细胞内ROS的生成，过多的ROS会损伤线粒体，而线粒体是细胞内ROS生成的主要场所，也是ROS作用的靶点，因此损伤的线粒体会产生大量的ROS，进而导致更严重的线粒体损伤，形成恶性循环，从而导致细胞凋亡。为了研究萝卜硫素是否能够降低酒精诱导的鸡胚卵黄膜细胞凋亡，采用AnnexinV/PI双染-流式检测法，检测了对照组、萝卜硫素、酒精、酒精+5μM萝卜硫素、酒精+10μM萝卜硫素处理后，对卵黄膜细胞凋亡的影响。早期凋亡率与坏死和晚期凋亡率之和为细胞凋亡率，结果发现，5μM或10μM萝卜硫素处理后，对卵黄膜细胞的凋亡率的影响不显著，酒精处理后，卵黄膜细胞的凋亡率显著增加，而酒精+5μM萝卜硫素或酒精+10μM萝卜硫素溶液处理后，与酒精处理组的凋亡率比较显著降低(图7，A、B)(与正常组相比，*p<0.05,***p<0.001；与酒精组相比，#p<0.05,###p<0.001)。

[0052] 实验证实，在鸡胚模型中，酒精诱导的细胞凋亡水平升高可以通过添加萝卜硫素得到改善。

[0053] 实施例7萝卜硫素显著改善酒精环境诱导的内质网应激水平

[0054] 酒精介导的ROS过量产生，会增加氧化应激压力，造成内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集，导致内质网内稳态失衡，从而引发内质网应激，以应对条件的变化和恢复内质网良好的蛋白质折叠环境(Bernales et al.,2012；Kleizen andBraakman,2004)。利用实时荧光定量PCR技术，对鸡胚尿囊膜中内质网应激相关信号通路的重要分子GRP78和IRE1进行了检测(Harding et al.,2003；Hetz et al.,2006；Lai et al.,2007)。结果显示，酒精处理下这些标志性分子的表达发生变化，提示了内质网应激的发生，而酒精+萝卜硫素(10μM)共同处理组IRE1、GRP78基因表达水平对比酒精组均明显减弱(图8.A、B)(与正常组相比，**p<0.01,***p<0.001；与酒精组相比，###p<0.001)。应用Western Blot的方法，我们检测了GRP78的表达情况，我们发现10μM萝卜硫素会抑制GRP78的蛋白表达水平，而酒精环境会促进GRP78表达，在酒精环境下，应用萝卜硫素干预可以显著恢复GRP78的表达水平(图8.C)。

[0055] 实验证实，在鸡胚模型中，萝卜硫素显著改善酒精诱导的内质网应激水平。

[0056] 实施例8萝卜硫素显著改善内质网应激诱导的血管发育不良

[0057] 毒胡萝卜内酯是内质网应激的特异性诱导剂，可以通过抑制内质网Ca2+-ATP酶的活性，使内质网Ca2+稳态失衡，进而导致内质网应激(Lytton et al.,1991；Thastrup et al.,1990)。为了探究萝卜硫素能否直接抑制内质网应激，用1μM毒胡萝卜内酯处理鸡胚尿囊膜(Janyou et al.,2015；Takahashi et al.,2009)，并检测了内质网应激相关基因的表达水平。结果显示，毒胡萝卜内酯会抑制尿囊膜血管生长，使血管密度显著降低，说明萝卜硫素可以减轻毒胡萝卜内酯对尿囊膜血管发育的抑制作用(图9.A-D)(与正常组相比，*p<0.05；与毒胡萝卜内酯相比，#p<0.05)。实时荧光定量PCR检测结果显示，萝卜硫素+毒胡萝卜内酯共同处理组ATF6、IRE1、GRP78基因表达水平对比毒胡萝卜内酯处理组均显著降低(图9.E-G)，说明萝卜硫素可以抑制毒胡萝卜内酯诱导的内质网应激(与正常组相比，**p<
0.01,***p<0.001；与毒胡萝卜内酯相比，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001)。

[0058] 实验证实，在鸡胚模型中，萝卜硫素能够显著改善内质网应激诱导的血管发育不良。

[0059] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。