一种具有抗皮肤癌作用的组合物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种具有抗皮肤癌作用的组合物及其制备方法，所述组合物由甘草异黄酮B 1～2重量份，新甘草酚1～2重量份,甘草查耳酮A2～4份组成。其中甘草异黄酮B与新甘草酚可以分别通过P38MAPKs通路、PI3K/AKT通路促进皮肤癌细胞的分化，抑制皮肤癌细胞的增殖，而甘草查耳酮A可以通过PARP通路诱导皮肤癌细胞的凋亡，从而达到抑制皮肤癌细胞的生长。本发明通过大量实验筛选得到最佳用量比的3个单体异戊烯基黄酮化合物的组合物，该组合物可以通过多靶点协同，显著提升抑制皮肤癌细胞生长，具有良好的预防和治疗皮肤癌的作用，具有很好的开发应用前景。

权利要求

1.甘草异黄酮B 1重量份，新甘草酚 1～3重量份和甘草查耳酮A 1～3重量份组成的组合物在制备预防或治疗皮肤癌药物中的应用。

2.甘草异黄酮B 1重量份，新甘草酚2重量份和甘草查耳酮A 2重量份组成的组合物在制备预防或治疗皮肤癌药物中的应用。

说明书

一种具有抗皮肤癌作用的组合物及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于中药及天然药物技术领域，具体涉及一种具有抗皮肤癌作用的组合物及制备方法与用途。

背景技术

[0002] 皮肤癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，目前仍无有效的治疗药物。皮肤癌主要分为鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、汗腺癌、血管肉瘤等，其中黑色素瘤是最危险的皮肤癌，它能随血液、淋巴扩散，若治疗时黑色素瘤已扩散，死亡风险极高，大部分皮肤癌致死的病例均由黑色素瘤引起。近期有研究表明，抑制皮肤癌细胞的增殖除了可以通过促进癌细胞凋亡、自噬等常见机制发挥作用外，还可以通过促进癌细胞向正常细胞分化而起到抑制其增殖，最终发挥预防或治疗作用。

[0003] 甘草作为一种优良的天然植物资源及中药材，已被广泛应用于医药、食品、化妆品、畜牧等领域。目前甘草药材主要采用水提或碱水提取法生产甘草浸膏、甘草酸粗提物等，前期我们研究发现，甘草中除了中等极性的活性化合物以外，还存在着丰富的弱极性黄酮类活性物质，具有抗氧化活性(方诗琦,冷康，段金廒,李存玉，魏娟花，郑云枫，彭国平。甘草黄酮类成分及其体外抗氧化活性研究[J].中成药,2015,37(11):2443-2448.)。但是关于甘草黄酮类成分抗皮肤癌的活性较少。

发明内容

[0004] 发明目的：为了更好地开发利用甘草资源，本发明对甘草中弱极性总黄酮的提取精制工艺进行优化，并在活性筛选研究过程中发现，甘草弱极性总黄酮部位具有良好的抑制黑色素癌细胞(B16-F10、A375、A2058)生长的作用。进一步的活性物质筛选研究发现，其中的3个具异戊二烯基的不同类型黄酮成分—甘草异黄酮B(异黄酮)，新甘草酚(香豆素)和甘草查耳酮A(查耳酮)为其主要活性物质，作用机制研究表明这3个主要活性成分可以分别通过不同的途径(促进癌细胞分化或淍亡)发挥作用。依据中药具多成分多靶点的研究思路，本发明以这3个主要活性成分按照不同重量比例进行大量筛选重量配伍实验，筛选出最佳的用量，且具有显著的协同抑制皮肤癌细胞功效的的组合物。

[0005] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

[0006] 一种具有抗皮肤癌作用的组合物，该组合物包括甘草异黄酮B，新甘草酚和甘草查耳酮A；

[0007]

[0008] 作为优选方案，以上所述的一种具有抗皮肤癌作用的组合物，该组合物由甘草异黄酮B1重量份，新甘草酚1～3重量份和甘草查耳酮A1～3重量份组成。

[0009] 作为优选方案，以上所述的一种具有抗皮肤癌作用的组合物，所述组合物由甘草异黄酮B1重量份，新甘草酚2重量份,甘草查耳酮A2重量份组成。

[0010] 本发明所述的一种具有抗皮肤癌作用的组合物，所述甘草异黄酮B，新甘草酚,甘草查耳酮A的制备方法为：

[0011] (1)取甘草，采用乙醇提取，减压回收提取液，浓缩至相对密度为1.20～1.35稠膏；

[0012] (2)取稠膏，加入吸附剂，拌匀，干燥，粉碎，装入超临界萃取斧中，以萃取压力10～30MPa，萃取温度45～55℃，夹带剂为乙醇，夹带剂用量为5％～10％，分离压力4～10MPa，分离斧温度30～40℃，萃取时间为1～3小时，从分离斧中收集萃取液，回收乙醇，得超临界精制部位；

[0013] (3)所得超临界精制部位经ODS反相硅胶色谱柱吸附，以体积浓度60％～80％乙醇水溶液洗脱，分离获得甘草异黄酮B，新甘草酚和甘草查耳酮A。

[0014] 作为优选方案，以上所述的一种具有抗皮肤癌作用的组合物，所述甘草异黄酮B，新甘草酚和甘草查耳酮A的制备方法为：

[0015] (1)取甘草，加体积浓度95％乙醇提取，减压回收提取液，浓缩至相对密度为1.28稠膏；

[0016] (2)取稠膏，加入3倍重量的硅胶，拌匀，干燥，粉碎，装入超临界萃取斧中，以萃取压力20MPa，萃取温度55℃，夹带剂为乙醇，夹带剂用量为15％，分离压力6MPa，分离斧温度30℃，萃取时间2小时，从分离斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，得超临界精制部位；

[0017] (3)所得超临界精制部位ODS反相硅胶色谱柱吸附，以体积浓度为60％～80％乙醇水溶液洗脱，分离获得甘草异黄酮B，新甘草酚和甘草查耳酮A。

[0018] 一种药物制剂，包括权利要求1至3任一项所述的具有抗皮肤癌作用的组合物，所述的制剂为外用制剂或口服制剂。

[0019] 以上所述的药物制剂，所述的外用制剂为外软膏剂、凝胶剂或搽剂中的一种；所述的口服制剂为片剂，胶囊剂或丸剂中的一种。

[0020] 有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优点：

[0021] (1)本发明通过大量实验，依据具有不同抑制皮肤癌细胞作用机制的化合物进行的组合筛选，以多种皮肤癌细胞株模型进行阐明和论证而获得的。首先采用了MTT法从甘草总黄酮中筛选出了对皮肤癌细胞(B16-F10细胞株)具显著生长抑制活性的成分，并发现了这些活性化合物可以通过不同途径发挥作用，即甘草异黄酮B与新甘草酚分别通过P38MAPKs通路、PI3K/AKT通路促进了皮肤癌细胞的分化，抑制了皮肤癌细胞的增殖，而甘草查耳酮A可以通过PARP通路诱导了皮肤癌细胞的凋亡，从而达到了抑制皮肤癌细胞的生长。进一步以这三种活性化合物进行配伍组合筛选，最终获得了优化的组合物，筛选出的组合物显示出了比单一组分明显的活性优势，起到了很好的协同增效的预料不到的技术效果！[0022] (2)本发明的制备方法采用的“醇提取—超临界CO2填充萃取法联用”工艺制备甘草弱极性总黄酮，再以反相色谱分离，获得甘草异黄酮B，新甘草酚及甘草查耳酮A单体成分，其效率获得了极大的提升，且工艺中不使用有毒有机溶剂，与传统溶剂萃取法、树脂精制法相比具有明显的优势。

[0023] 为了更好地理解本发明的有益效果，下面以相应的实验作为进一步的说明。

[0024] a.超临界CO2萃取工艺研究

[0025] 目的：以总黄酮含量为指标，采用正交试验法考察甘草乙醇提取物的超临界CO2萃取精制工艺。

[0026] 1.仪器与材料：

[0027] 超临界CO2萃取装置及萃取用气体：FY230-40-11型超临界流体萃取装置(南通飞宇石油科技开发有限公司)；CO2气体为食品级(南京市通广特种气体厂)；紫外分光光度计。

[0028] 取干燥甘草(即以水煎煮提取两次后的药材，烘干)10kg，加乙醇提取2次(8+6倍量)，合并，过滤，减压回收乙醇，浓缩至稠膏(相对密度为1.28)，得967g，加入100-200目硅胶3000g，混匀，60℃烘干，粉碎，即得超临界萃取精制用原料。

[0029] 2.方法与结果

[0030] 取样品，装入超临界CO2萃取罐(体积1L)，按下表中条件萃取，其余萃取时间为2h，分离压力为6Mpa，分离温度为40℃。考虑到超临界提取时，萃取压力，温度这三个因素最为关键，因此选用L9(34)正交表，以总黄酮为考察指标，进行了9次试验，优选最佳萃取条件，各因素水平见下表1。

[0031] 表1超临界CO2提取因素水平表

[0032]

[0033] 根据表1，若试验因素水平为A1B1C1，即表示该试验号以萃取压力10Mpa，萃取温度35℃，夹带剂用量为0，萃取时间为2h，解析压力和温度分别为6Mpa和40℃收集萃取物，冷冻干燥，检测总黄酮含量。其余依此类推。

[0034] 表2超临界CO2提取正交表

[0035]

[0036] 2.2指标的选择

[0037] 本正交试验选用总黄酮含量作为其考核指标。方法如下：

[0038] 对照品溶液的制备：称取芦丁对照品适量，加60％乙醇溶液，配制含0.08mg/mL芦丁对照品溶液，再依次稀释成0.04，0.02，0.01mg/mL系列对照品溶液。

[0039] 样品液的制备：称取样品约5mg，精密称定，置50mL量瓶中，加60％乙醇溶液溶解并定容至刻度，即得。

[0040] 分别取芦丁系列对照品溶液，样品溶液各5mL置10mL量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加10％销酸铝溶液0.3mL，摇匀，静置6min,加入1mol/L氢氧化钠溶液4mL，摇匀，用30％乙醇定容，静置15min，在波长510nm处测定吸度度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，并计算样品中总黄酮含量。

[0041] 2.3结果及分析

[0042] 根据正交设计表，共进行9次试验，相关试验数据及其计算见下表3。

[0043] 表3超临界CO2提取正交试验结果表

[0044]

[0045]

[0046] 表4超临界CO2提取正交方差分析表

[0047]方差来源 平方和 自由度 均方 F 显著性
萃取压力 1589.29 2 794.64 33.52 显著
萃取温度 124.46 2 62.23 2.63 不显著
夹带剂 845.01 2 422.50 17.82 不显著
误差 47.41 2 23.70    

[0048] 由表4的方差分析可以看出，萃取温度与夹带剂对萃取效果影响并不显著，而萃取压力对萃取效果有显著性影响。

[0049] 由表3的简单计算可以看出，K2a>K3a>K1a，但K2a接近于K3a，故因素A选择水平2为最佳，即最佳萃取压力为20Mpa；虽然K3b>K2b>K1b，但三者相差不大，因此萃取温度选择为在35-45℃间均可；K2c>K3c>K1c，但K2a接近于K3a，因素C选择水平2，即夹带剂适宜用量为15％。

[0050] 从正交试验结果来看，超临界萃取工艺可选择为：以萃取压力10～30MPa，萃取温度35～45℃，夹带剂用量为5％～30％，分离压力4～10MPa，分离斧温度30～40℃，萃取时间1～3小时，从分离斧中收集萃取液，回收溶剂，冷冻干燥，即得。

[0051] 最佳萃取工艺为：以萃取压力20MPa，萃取温度55℃，夹带剂用量为15％，分离压力6MPa，分离斧温度30℃，萃取时间2小时，从分离斧中收集萃取液，回收溶剂，冷冻干燥，即得甘草超临界萃取物。

[0052] b.甘草超临界提取物中化学成分研究

[0053] (1)实验材料与仪器

[0054] 紫外光谱用日本岛津UV-2401型紫外-可见分光度析仪测定。核磁共振谱用BrukerACF-300型、BrukerASR-500型核磁共振仪测定。质谱由Agilent1100HPLC/TOF-MS质谱仪测定。

[0055] 液相分析用Agilent1100，VWD检测器，AgilentLC色谱工作站。色谱柱用汉邦科技有限公司ThermoC18柱(5μm，C18 ,250×4 .6mm)。C18中压柱层析用BUCHIChromatographyPumpB-688泵，填料为C18(25–50μm)，乙腈用进口分装色谱纯(MERCK)试剂，乙醇为色谱纯(淮阴精细化工研究院所)，水为亚沸蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0056] 甘草药材购自甘肃。

[0057] (2)高效液相色谱条件：

[0058] 以ThermoC18column(4.6×50mm，5μm)为色谱柱，Agilent1100为高效液相色谱分析仪，紫外UV检测器，流速为1.0mL/min，进样体积为10μL，检测波长为254nm，流动相具体条件如下表5：

[0059] 表5梯度洗脱条件

[0060]时间(min) 乙腈(％) 0.2％甲酸(％)
0 18 82
10 25 75
30 45 55
60 70 30

[0061] (3)提取分离

[0062] 甘草药材，用95％乙醇加热回流提取，减压浓缩至稠膏，以硅胶拌样(质量比为1:1)，按以上超临界优化后方法制备获得甘草超临界精制物，再经C18中压柱色谱，以50％(4BV)，60％(4BV)，70％(4BV)的乙醇水进行梯度洗脱，经HPLC检测，合并含有相似成分的流份，分别得到Fra.A、Fra.B、Fra.C、Fra.D四个流份，各流份分别再上C18柱：Fra.A流份以
50％～60％乙醇水进行梯度洗脱，分离获得GF-5、GF-7；Fra.B流份以55％～65％乙醇水进行梯度洗脱，分离获得化合物GF-3、GF-8、GF-9；Fra.C流份以60％～65％乙醇水进行梯度洗脱，分离获得化合物GF-6、GF-10；Fra.D流份以65％～70％乙醇水进行梯度洗脱，分离获得化合物GF-1、GF-2、GF-4。

[0063] (4)结构鉴定

[0064] LC-HRTOF-MS检测结果：GF-1：m/z353.1024[M+H]+，GF-2：m/z337.1071[M+H]+，化合物3：m/z353.1012[M+H]+，GF-4：m/z367.1187[M+H]+，GF-5：m/z269.0808[M+H]+，GF-6：m/z339.1590[M+H]+，GF-7：m/z257.0809[M+H]+，GF-8：m/z257.0805[M+H]+，GF-9：m/z323.1278[M+H]+，GF-10：m/z315.0866[M+H]+；13CNMR测定结果(见下表6)。

[0065] 表6 GF 1-10的13C NMR(DMSO-d6)

[0066] NO. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10C-1           113.5   125.7    
C-2 155.7 155.1 162.5 157.9 153.0 158.2 78.9 131.1 162.2 155.8
C-3 120.5 122.1 104.4 102.7 124.2 99.9 43.1 115.8 104.4 137.7
C-4 180.6 176.0 176.2 158.6 174.5 159.6 190.0 160.3 176.2 178.0
C-4a 104.6 116.2 16.1 100.2 127.2   113.5   115.8 105.1
C-5 161.8 127.2 126.4 154.3 116.6 126.5 128.3 115.8 124.5 160.9
C-6 98.8 115.3 114.7 120.1 115.0 127.7 110.5 131.1 127.2 97.6
C-7 164.1 162.8 160.6 160.0 162.5   164.6   160.3 165.0
C-8 93.6 102.0 102.4 99.7 102.0   102.5   101.7 92.2
C-8a 157.7 157.5 157.3 153.4 158.9   163.1   155.6 160.2
C-α           117.8   144.2    
C-β           138.7   117.4    
C-γ           187.3   191.5    
C-1' 111.2 112.7 121.7 114.7 123.1 129.6 129.3 112.9 121.9 120.4
C-2' 151.2 151.3 128.0 156.6 130.0 130.6 128.2 165.8 127.9 130.1
C-3' 109.7 110.1 115.8 99.0 113.5 115.2 115.1 102.5 115.8 115.6
C-4' 153.6 153.5 162.4 157.4 157.4 161.6 157.6 165.4 160.5 156.2
C-5' 107.4 107.6 115.8 114.5 113.5 115.2 115.1 108.0 115.8 115.6
C-6' 131.3 130.9 128.0 120.9 130.0 130.6 128.2 132.7 127.9 130.1
C-1”       22.5   39.5     27.5  
C-2” 75.4 75.4   122.9   147.5     121.8  
C-3” 128.8 128.8   131.4   109.9     132.3  
C-4” 116.9 117.0   18.2   26.9     25.5  
C-5” 27.4 27.5   25.9   26.9     17.6  
C-6” 27.4 27.5                
2-OCH3           55.4        
3-OCH3                   56.0
4'-OCH3         55.1          
5-OCH3       62.8            
7-OCH3                   59.6

[0067] 根据以上测定结果，并与文献数据对照，鉴定化合物1-10分别为：甘草异黄酮B、光甘草酮、7,4'-二羟基黄酮、新甘草酚、芒柄花素、甘草查耳酮A、甘草素、异甘草素、甘草黄酮、华良姜素A。

[0068] c.抗皮肤癌活性筛选

[0069] 1.实验材料

[0070] (1)受试品：以上b分离得到的化合物1-10，即：甘草异黄酮B、光甘草酮、7,4'-二羟基黄酮、新甘草酚、芒柄花素、甘草查耳酮A、甘草素、异甘草素、甘草黄酮、华良姜素A。

[0071] (2)实验细胞株及来源：皮肤癌细胞B16-F10(购自ATCC)

[0072] (3)实验试剂DMEM培养基，胎牛血清：Gibco；甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，NaHCO3：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酶标仪：美国Thermo；96孔细胞培养板。

[0073] 2.方法与结果

[0074] 药物制备：称取以上各化合物1～10，用DMSO溶解，配成浓度为80mM的母液，-20℃保存。临用前用相应的培养液将其稀释为80μM、60μM、40μM、20μM、10μM进行实验。

[0075] 给药处理：取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，7.5×103cells/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内，培养24h后加药，作用48h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设3个复孔，重复实验3次。

[0076] MTT测定：细胞成活率测定采用MTT分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐为原理，利用酶标仪测定492nm出的OD值，OD值的大小与反应出药物对细胞成活率的影响。细胞抑制率％＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％

[0077] 细胞分化率：倒置显微镜(100倍×)，观察给药处理后的各组细胞，计数150个/组，计数细胞体树突长度≥3个细胞长度的细胞数，并计算细胞分化率(％)。

[0078] IC50的计算方法：将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。如下表7。

[0079] 表7GF1-10对B16-F10皮肤癌细胞抑制增殖作用(n＝3)

[0080] 化合物 IC50(μM) 化合物 IC50(μM)甘草异黄酮B(1) 16.0±3.2 甘草查耳酮A(6) 18.1±2.9
光甘草酮(2) 45.8±3.3 甘草素(7) >80
7,4'-二羟基黄酮(3) >80 异甘草素(8) >80
新甘草酚(4) 17.5±3.7 甘草黄酮(9) 42.4±3.4
芒柄花素(5) >80 华良姜素A(10) >80

[0081] 结果显示，化合物甘草异黄酮B(GF-1)、新甘草酚(GF-4)及甘草查耳酮A(GF-6)具有较强的活性，对B16-F10皮肤癌细胞具有明显的抑制其增殖的作用，IC50<20μM；化合物光甘草酮和甘草黄酮活性相对较弱，而其它成分则未能显示出相应活性。

[0082] d.甘草异黄酮B、新甘草酚和甘草查耳酮A抑制皮肤癌细胞增殖作用机制研究[0083] 1.实验材料

[0084] (1)受试品：甘草异黄酮B(GF-1)、新甘草酚(GF-4)和甘草查耳酮A(GF-6)，自制，HPLC纯度>98％。

[0085] (2)实验细胞株及来源：皮肤癌细胞B16-F10(购自ATCC)

[0086] (3)实验试剂DMEM培养基，胎牛血清：Gibco；甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，NaHCO3：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酶标仪：美国Thermo；100mm细胞培养皿。抗体anti-GAPDH(1:5000),anti-p38(1:2500),anti-AKT(1:2500),anti-P-CREB(1:1000),anti-MITF(1:200),anti-PI3K(P85)(1:1000),anti-Cl-PARP(1:1000)、anti-Cl-Casp9(1:1000)、anti-Cl-Casp3(1:1000)(购置于CellSignalingTechnology,Danvers,MA)[0087] 2.方法与结果

[0088] 药物制备：称取各化合物，用DMSO溶解，配成浓度为80mM的母液，-20℃保存。临用前用相应的培养液将其稀释为40μM、20μM进行实验。

[0089] 给药处理：取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于100mm培养皿内，1×106cells/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内，培养24h后加药，作用48h。分设空白组、给药组，重复实验3次。处理后，将细胞用PBS洗涤两次，在RIPA裂解缓冲液(150mMNaCl，1mMEDTA，1mMEGTA，50mMTris-Cl，0.35％w/v，1-脱氧胆酸钠，1mM苯基甲基磺酰氟，1％v/vNP-40,1mMNaF，1mMNa3VO4，pH7.4)中于4℃裂解30分钟，收集裂解液，15,000g下离心30分钟。取上清液，-20℃保存。

[0090] Westernblot测定各组细胞裂解液中与细胞分化及增殖相关的抗体，并使用Imagelab软件(ThermoScientific)使反应条带可视化，然后通过Chemidoc成像系统(Bio-Rad；Hercules，CA)校准。

[0091] 如图1结果显示，甘草异黄酮B(GF-1)、新甘草酚(GF-4)和甘草查耳酮A(GF-6)虽然能够抑制B6-F10癌细胞的增殖，但其作用机制却并不相同：甘草异黄酮B和新甘草酚可分别通过上调p-p38和p-CREB蛋白及下调P-AKT、PI3K蛋白，最终促进了下游分化相关蛋白MITF的表达，提示这两个化合物可通过促进皮肤癌细胞分化而起到抑制肿瘤细胞的生长。而甘草查耳酮A显示出与其它两个化合物不同的作用机制，其主要可以通过诱导Cl-PARP/Cl-Casp3/Cl-Casp9等凋亡相关蛋白，使癌细胞发生凋亡而产生抑制其生长的作用。

[0092] e.甘草异黄酮B、新甘草酚和甘草查耳酮A组合物优化配伍研究

[0093] 1.实验材料

[0094] (1)受试品：甘草异黄酮B(GF-1)、新甘草酚(GF-4)和甘草查耳酮A(GF-6)组合物。

[0095] (2)实验细胞株及来源：皮肤癌细胞B16-F10，A375，A2058(购自ATCC)[0096] (3)实验试剂DMEM培养基，胎牛血清：Gibco；甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，NaHCO3：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酶标仪：美国Thermo；96孔细胞培养板。

[0097] 2.方法与结果

[0098] 药物制备：称取按下表重量比例组合的样品，用DMSO溶解，配成浓度为50mM的母液，-20℃保存。临用前用相应的培养液将其稀释为50μM、25μM、10μM、5μM、1μM进行实验。

[0099] 给药处理：取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，7.5×103cells/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内，培养24h后加药，作用48h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设3个复孔，重复实验3次。

[0100] MTT测定：细胞成活率测定采用MTT分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐为原理，利用酶标仪测定492nm出的OD值，OD值的大小与反应出药物对细胞成活率的影响。细胞抑制率％＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％。

[0101] IC50的计算方法：将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。如表8所示。

[0102] 表8不同重量比例的组合物对三种皮肤癌细胞抑制增殖作用(n＝3)

[0103]

[0104] 结果显示，在B16-F10，A375，A2058三种皮肤癌细胞模型上，以上不同比例甘草异黄酮B(GF-1)、新甘草酚(GF-4)和甘草查耳酮A(GF-6)的组合物，均显示出比单一组分更优的抑制肿瘤细胞生长作用。特别是在甘草异黄酮B1重量份、新甘草酚1-3重量份以及甘草查耳酮A1-3重量份时形成的组合物，其配伍协同作用较强，对三种皮肤癌细胞的IC50<10μM；在各种组合物中，特别优选甘草异黄酮B1重量份、新甘草酚2重量份以及甘草查耳酮A2重量份时，该组合物的活性最强，对B16-F10，A375，A2058皮肤癌细胞模型的IC50分别为3.3μM，3.7μM和4.2μM。显示出了明显预料不到的技术效果！

附图说明

[0105] 图1为甘草异黄酮B(GF-1)、新甘草酚(GF-4)和甘草查耳酮A(GF-6)通过不同信号调控通路抑制B6-F10皮肤癌细胞增殖作用结果图。

具体实施方式

[0106] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

[0107] 实施例1抗皮肤癌化合物的分离制备

[0108] (1)取甘草2kg，以乙醇提取，提取2次(8+6倍量)，每次2h，合并提取液，减压回收，并浓缩至相对密度为1.28稠膏145g；

[0109] (2)取稠膏，加入450g硅胶吸附剂(100-200目)，拌匀，干燥，粉碎，装入超临界萃取斧中，以萃取压力20MPa，萃取温度55℃，夹带剂乙醇用量为15％，分离压力6MPa，分离斧温度40℃，萃取时间为2小时，从分离斧中收集萃取液，回收乙醇，冷冻干燥，即甘草超临界提取物，共28.4g。

[0110] (3)取甘草超临界提取物，加少量甲醇溶解，上C18中压柱色谱(1000g,25–50μm,6.0×80cm)，以EtOH-H2O(50:50；60:40,70:30)梯度洗脱，每一浓度洗脱6L，每0.5L收集为1个流份，HPLC-UV跟踪检测，依据检测结果合并：A为流份16-20(含有甘草查耳酮A)3.2g，B为流份24-26(含有甘草异黄酮B)2.9g，C为流份28-30(含有新甘草酚)3.5g；

[0111] (4)流份A回收浓缩后，再经60％～65％乙醇水进行梯度洗脱，每200mL收集为1个流份，HPLC-UV跟踪检测，收集纯度>90％的流份，合并，回收，重结晶，获得化合物甘草查耳酮A0.43g；流份B回收浓缩后，再经65％～70％乙醇水进行梯度洗脱，每200mL收集为1个流份，HPLC-UV跟踪检测，收集纯度>90％的流份，合并，回收，重结晶，获得化合物甘草异黄酮B0.26g；流份C回收浓缩后，再经65％～70％乙醇水进行梯度洗脱，每200mL收集为1个流份，HPLC-UV跟踪检测，收集纯度>90％的流份，合并，回收，重结晶，获得化合物新甘草酚0.38g。

[0112] 实施例2抗皮肤癌化合物制备

[0113] (1)取甘草5kg，以乙醇提取，提取2次(10+8倍量)，每次2h，合并提取液，减压回收，并浓缩至相对密度为120稠膏145g；

[0114] (2)取稠膏，加入850g硅藻土吸附剂，拌匀，干燥，粉碎，装入超临界萃取斧中，以萃取压力10MPa，萃取温度45℃，夹带剂用量为30％，分离压力8MPa，分离斧温度30℃，萃取时间为3小时，从分离斧中收集萃取液，回收乙醇，冷冻干燥，即甘草超临界提取物，共67.4g。

[0115] (3)取甘草超临界提取物，加少量甲醇溶解，上C18中压柱色谱(1500g,25–50μm,8.0×80cm)，以EtOH-H2O(65:35)洗脱20L，每0.5L收集为1个流份，HPLC-UV跟踪检测，依据检测结果合并：Ⅰ为流份12-15(含有甘草查耳酮A)10.2g，Ⅱ为流份21-24(含有甘草异黄酮B)12.9g，Ⅲ为流份29-31(含有新甘草酚)13.2g；

[0116] (4)流份Ⅰ回收浓缩后，再经60％乙醇水进行洗脱，每500mL收集为1个流份，HPLC-UV跟踪检测，收集纯度>90％的流份，合并，回收，重结晶，获得化合物甘草查耳酮A0.91g；流份Ⅱ回收浓缩后，再经65％乙醇水进行洗脱，每200mL收集为1个流份，HPLC-UV跟踪检测，收集纯度>90％的流份，合并，回收，重结晶，获得化合物甘草异黄酮B0.64g；流份Ⅲ回收浓缩后，再经70％乙醇水进行洗脱，，每200mL收集为1个流份，HPLC-UV跟踪检测，收集纯度>90％的流份，合并，回收，重结晶，获得化合物新甘草酚0.87g

[0117] 实施例3抗皮肤癌软膏剂的制备

[0118] 处方：

[0119]

[0120] 制备工艺：将上述重量称取甘草异黄酮B、新甘草酚、甘草查耳酮A以少量1，2-丙二醇溶解，再加入加热融化的硬脂酸中，然后再加入液体石蜡，混匀，加热至70℃，作为油相备用；将余下1，2-丙二醇和去离子水混匀，然后再加入吐温80中，充分搅拌，并加热至75℃，作为水相备用；最后将油相缓慢加入到水相中，边加边搅拌，直至冷凝，即得抗皮肤癌软膏。

[0121] 实施例4抗皮肤癌凝胶剂的制备

[0122] 处方：

[0123]

[0124] 将上述重量称取甘草异黄酮B、新甘草酚、甘草查耳酮A和甘油混合溶解，再加入卡波姆、透明质酸及对羟基苯甲酸甲酯，混匀，在均质下加入到去离子水中，混合均匀，冷却至40-50℃，即得到抗皮肤癌凝胶剂。

[0125] 实施例5抗皮肤癌胶囊剂的制备

[0126] 处方：

[0127]

[0128] 将上述重量称取甘草异黄酮B、新甘草酚、甘草查耳酮A和淀粉、糊精混合，制粒，再加入奧晶纤维素，混匀，灌装胶囊，即得。