一种生产尼莫克汀的方法

摘要

本发明提供了一种高效率生产尼莫克汀的方法，采用抗L‑缬氨酸的蓝灰链霉菌在L‑缬氨酸存在条件下进行发酵生产，解决了传统工艺里发酵中后期发酵产量增长缓慢的问题，延长了发酵周期，显著提高了尼莫克汀的发酵产率。

权利要求

1.一种生产尼莫克汀的方法，其特征在于，包括：含有蓝灰链霉菌的发酵液中，加入L-缬氨酸，进行发酵；所述蓝灰链霉菌为抗L-缬氨酸的蓝灰链霉菌；在发酵过程中，控制发酵液中蓝灰链霉菌生长因子质量浓度维持在0.1％-8％；

其中，所述蓝灰链霉菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2017年2月15日，保藏编号CGMCC No.13661；

其中，所述蓝灰链霉菌生长因子为单糖、双糖、或寡糖中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，所加入的L-缬氨酸占发酵液重量比例为0.01％-0.1％。

3.根据权利要求2所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，所述蓝灰链霉菌发酵过程中，每天添加L-缬氨酸，每天添加的L-缬氨酸占发酵液重量比例为0.01％-0.1％。

4.根据权利要求1所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，蓝灰链霉菌在发酵液中完成初级代谢后加入L-缬氨酸。

5.根据权利要求1所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，加入L-缬氨酸之后的发酵过程中，控制发酵液中蓝灰链霉菌生长因子质量浓度维持在0.5％-2％。

6.根据权利要求5所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，所述发酵过程中，当蓝灰链霉菌生长因子质量浓度低于1.5％时，进行补加蓝灰链霉菌生长因子。

7.根据权利要求1所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，所述单糖为苏力糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖中的一种或几种；所述双糖为蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、乳糖、海藻糖中的一种或几种；所述寡糖为低聚果糖、低聚木糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖中的任意一种或几种。

8.根据权利要求1所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，所述蓝灰链霉菌的种子液接种至发酵培养基中，进行培养，获得所述发酵液；以所述发酵培养基总重量为基准，所述发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，黄豆饼粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％。

9.根据权利要求8所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，所述发酵过程中，发酵温度为20-35℃。

说明书

一种生产尼莫克汀的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种微生物发酵方法，尤其涉及一种可提高尼莫克汀发酵产量的方法。

背景技术

[0002] 尼莫克汀(Nemadectin)是一种十六元大环内酯类抗生素，属于米尔贝霉素族的一员，由蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus sp.Noncyanogenus)经发酵产生，尼莫克汀经过半合成在其分子结构的C-23位引入＝N-OCH基团可以得到活性更强的抗生素莫西克汀(Moxidectin)。尼莫克汀的结构式为：

[0003]

[0004] 莫西克汀20世纪80年代中期以来开始作为动物用驱虫药使用，能够高效的杀灭线虫和体表寄生虫等，同时对动物有很好的安全性，是一种新型的广谱、高效、安全的大环内酯类驱虫抗生素，目前已被广泛用于兽医临床，市场需求日益增大。因此，能够高效率生产尼莫克汀的方法是所期望的。

发明内容

[0005] 为了提高尼莫克汀的生产效率，本发明提供了一种高效率生产尼莫克汀的方法。

[0006] 本发明所提供的生产尼莫克汀的方法，包括：含有蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus sp.Noncyanogenus)的发酵液中，加入L-缬氨酸，进行发酵。其中，所述蓝灰链霉菌为抗L-缬氨酸的蓝灰链霉菌；在发酵过程中，控制发酵液中蓝灰链霉菌生长因子质量浓度维持在0.1％-8％。

[0007] 在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌(Streptomyces  cyaneogriseus sp.Noncyanogenus)KS12-08，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2017年2月15日，保藏编号CGMCC No.13661。

[0008] 在一种优选实施例中，所加入的L-缬氨酸占发酵液重量比例优选为0.01％-0.1％，更优选为0.02％-0.08％，如：0.04％、0.05％、0.06％、0.07％。

[0009] 在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌发酵过程中，每天添加L-缬氨酸，每天添加的L-缬氨酸占发酵液重量比例优选为0.01％-0.1％，更优选为0.02％-0.08％，如：0.04％、0.05％、0.06％、0.07％。

[0010] 在一种优选实施例中，蓝灰链霉菌在发酵液中完成初级代谢后加入L-缬氨酸。

[0011] 在一种优选实施例中，至少在加入L-缬氨酸之后的发酵过程中，控制发酵液中蓝灰链霉菌生长因子质量浓度维持在0.2％-6％，更优选为0.4％-4％，更优选为0.5％-2％，更优选为0.7％-1.5％，如1％、1.2％。

[0012] 在一种优选实施例中，所述发酵过程中，当蓝灰链霉菌生长因子质量浓度低于1.5％时，进行补加蓝灰链霉菌生长因子。

[0013] 其中，所述蓝灰链霉菌生长因子优选为单糖、双糖、或寡糖中的一种或几种。其中，所述单糖可以是优选为苏力糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖中的一种或几种；所述双糖可以是优选为蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、乳糖、海藻糖中的一种或几种；所述寡糖优选为低聚果糖、低聚木糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖中的任意一种或几种。

[0014] 在一种优选实施例中，所述发酵过程中，发酵温度优选为20-35℃，更优选为25-33℃，如28℃、30℃。

[0015] 在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌种子液接种至发酵培养基中，进行培养，获得所述发酵液。

[0016] 在一种优选实施例中，以所述发酵培养基总重量为基准，所述发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，黄豆饼粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％。

[0017] 更优选地，当发酵液中葡萄糖质量浓度低于1.5％时，进行补加葡萄糖。

[0018] 在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌孢子接种于种子培养基获得种子液。

[0019] 在一种优选实施例中，以所述种子培养基总重量为基准，所述种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，黄豆饼粉1.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％。

[0020] 在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌制成孢子悬浮液，在含有L-缬氨酸的培养基中培养，进一步进行抗性筛选获得耐受L-缬氨酸的菌株并培养，得到孢子。

[0021] 本发明提供的生产尼莫克汀的方法，解决了传统工艺里发酵中后期发酵产量增长缓慢的问题，延长了发酵周期，显著提高了尼莫克汀的发酵产率。

具体实施方式

[0022] 初始菌种为常规蓝灰链霉菌，将初始菌种通过斜面培养，后用斜面菌种制成孢子悬液，稀释至孢子浓度为108个/ml，向悬浮液中加入硫酸二乙酯溶液，然后放摇床中28℃震荡培养，用移液枪取出5ml孢子悬浮液置于6cm直径的培养皿中，放入搅拌子。然后通过紫外灯管照射诱变。

[0023] 将紫外诱变后的孢子悬浮液在红灯下稀释成一定的浓度梯度，分别取0.2ml涂布于培养基平板上，28℃避光培养7-8天，挑取单菌落筛选得到耐受L-缬氨酸的菌株，名称为蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus sp.Noncyanogenus)KS12-08，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2017年2月15日，保藏编号CGMCC No.13661。

[0024] 16S rDNA序列检测结果显示，该诱变菌株CGMCC No.13661属于蓝灰链霉菌。该诱变菌株CGMCC No.13661孢子丝短，呈致密的2-3圈螺旋形，孢子呈卵圆形至短柱形，表面光滑；克式合成1号琼脂培养基中：气丝为粉状，基丝由最初无色变为后来的灰蓝色；耐受L-缬氨酸。

[0025] 实施例1

[0026] 步骤1，将蓝灰链霉菌KS12-08接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；

[0027] 步骤2，从成熟的斜面菌种刮取适量孢子接种于液体种子培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～500rpm条件下培养26～30小时，得到成熟的种子液；种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，黄豆饼粉1.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％；

[0028] 步骤3，将成熟的种子液按照8～12％的接种量接种至发酵培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～600rpm，罐压0.02～0.06MPa，罐上溶氧≥30％的条件下发酵培养；发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，黄豆饼粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％；

[0029] 将L-缬氨酸配制成适当浓度的溶液，灭菌后，发酵过程中，每天在发酵液中补入占发酵液0.05wt％的L-缬氨酸。

[0030] 实施例2

[0031] 步骤1，将蓝灰链霉菌KS12-08接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；

[0032] 步骤2，从成熟的斜面菌种刮取适量孢子接种于液体种子培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～500rpm条件下培养26～30小时，得到成熟的种子液；种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，黄豆饼粉1.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％；

[0033] 步骤3，将成熟的种子液按照8～12％的接种量接种至发酵培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～600rpm，罐压0.02～0.06MPa，罐上溶氧≥30％的条件下发酵培养；发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，黄豆饼粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％；

[0034] 发酵到48h时，每天在发酵液中补入0.05wt％的L-缬氨酸，将L-缬氨酸配成浓度5wt％的溶液，灭菌后，每天按照发酵液体积的1wt％将L-缬氨酸溶液补入发酵罐中。

[0035] 实施例3

[0036] 步骤1，将蓝灰链霉菌KS12-08接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；

[0037] 步骤2，从成熟的斜面菌种刮取适量孢子接种于液体种子培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～500rpm条件下培养26～30小时，得到成熟的种子液；种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，黄豆饼粉1.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％；

[0038] 步骤3，将成熟的种子液按照8～12％的接种量接种至发酵培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～600rpm，罐压0.02～0.06MPa，罐上溶氧≥30％的条件下发酵培养；发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，黄豆饼粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％；

[0039] 发酵到48h时，每天在发酵液中补入0.05wt％的L-缬氨酸，将L-缬氨酸配成浓度5wt％的溶液，灭菌后，每天按照发酵液体积的1wt％将L-缬氨酸溶液补入发酵罐中。

[0040] 取样测定罐上发酵液中葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度降低到1.5％以下时，开始补葡萄糖溶液，维持罐上发酵液中葡萄糖的浓度在0.5～2.0％之间，放罐前12h停止补糖。

[0041] 发酵240～260h后结束发酵，得到含有尼莫克汀的发酵液。

[0042] 实施例4

[0043] 步骤1，将蓝灰链霉菌KS12-08接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；

[0044] 步骤2，取生长好的菌种斜面，刮取约0.5cm×0.5cm斜面上的孢子接种到500ml种子摇瓶中，种子摇瓶装量为50ml，接种好的种子摇瓶在转速为200rpm的摇床上28℃培养28h。

[0045] 步骤3，将培养好摇瓶种子按照8％的接种量接种至5L玻璃发酵罐上，发酵罐的装量为2.5L，发酵罐培养条件为罐温28℃，通气量0.8vvm，搅拌转速200rpm，发酵过程中通过提高搅拌转速，控制发酵罐上溶氧值(DO)≥30％。

[0046] 发酵培养到48h时，开始补灭菌好的5wt％浓度的L-缬氨酸溶液，每天补一次，每次补25ml，即在发酵到48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h时各补入一次L-缬氨酸。

[0047] 发酵培养到150h时，开始流加补葡萄糖溶液，通过调节补糖速度控制发酵液中葡萄糖浓度在0.5～2.0％之间，第228h时停止补糖。

[0048] 发酵培养到240h时结束培养，得到含有尼莫克汀的发酵液。

[0049] 实施例5

[0050] 步骤1，将蓝灰链霉菌KS12-08接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；

[0051] 步骤2，取生长好的菌种斜面，刮取约0.5cm×0.5cm斜面上的孢子接种到500ml种子摇瓶中，种子摇瓶装量为50ml，接种好的种子摇瓶在转速为200rpm的摇床上28℃培养28h。

[0052] 步骤3，将培养好摇瓶种子按照1％的接种量接种至10L不锈钢种子罐上，种子罐的装量为5.0L，种子罐培养条件为罐温28℃，通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制种子罐上溶氧值(DO)≥30％，种子罐培养时间为24h。

[0053] 步骤4，将培养好种子罐种子液按照10％的接种量接种至50L发酵罐上，发酵罐的装量为30L，发酵罐培养条件为罐温28℃，通气量0.8vvm，搅拌转速200rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制发酵罐上溶氧值(DO)≥30％。

[0054] 发酵培养到48h时，开始补灭菌好的5wt％浓度的L-缬氨酸溶液，用匀速流加补料的方式，补入量为300ml/天，228h时停止补料。

[0055] 发酵培养到150h时，开始流加补葡萄糖溶液，通过调节补糖速度控制发酵液中葡萄糖浓度在0.5～2.0％之间，第228h时停止补糖。

[0056] 发酵培养到240h时结束培养，得到含有尼莫克汀的发酵液。

[0057] 对比例1

[0058] 步骤1，将初始蓝灰链霉菌(未经紫外灯光照射诱变的菌株)接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；

[0059] 步骤2，取生长好的菌种斜面，刮取约0.5cm×0.5cm斜面上的孢子接种到500ml种子摇瓶中，种子摇瓶装量为50ml，接种好的种子摇瓶在转速为200rpm的摇床上28℃培养28h。

[0060] 步骤3，将培养好摇瓶种子按照1％的接种量接种至10L不锈钢种子罐上，种子罐的装量为5.0L，种子罐培养条件为罐温28℃，通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制种子罐上溶氧值(DO)≥30％，种子罐培养时间为24h。

[0061] 步骤4，将培养好种子罐种子液按照10％的接种量接种至50L发酵罐上，发酵罐的装量为30L，发酵罐培养条件为罐温28℃，通气量0.8vvm，搅拌转速200rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制发酵罐上溶氧值(DO)≥30％。

[0062] 发酵培养到48h时，开始补灭菌好的5wt％浓度的L-缬氨酸溶液，用匀速流加补料的方式，补入量为300ml/天，228h时停止补料。

[0063] 发酵培养到240h时结束培养，得到含有尼莫克汀的发酵液。

[0064] 对比例2

[0065] 步骤1，将初始蓝灰链霉菌(未经紫外灯光照射诱变的菌株)接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；

[0066] 步骤2，取生长好的菌种斜面，刮取约0.5cm×0.5cm斜面上的孢子接种到500ml种子摇瓶中，种子摇瓶装量为50ml，接种好的种子摇瓶在转速为200rpm的摇床上28℃培养28h。

[0067] 步骤3，将培养好摇瓶种子按照1％的接种量接种至10L不锈钢种子罐上，种子罐的装量为5.0L，种子罐培养条件为罐温28℃，通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制种子罐上溶氧值(DO)≥30％，种子罐培养时间为24h。

[0068] 步骤4，将培养好种子罐种子液按照10％的接种量接种至50L发酵罐上，发酵罐的装量为30L，发酵罐培养条件为罐温28℃，通气量0.8vvm，搅拌转速200rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制发酵罐上溶氧值(DO)≥30％。

[0069] 发酵培养到48h时，开始补灭菌好的5wt％浓度的L-缬氨酸溶液，用匀速流加补料的方式，补入量为300ml/天，228h时停止补料。

[0070] 发酵培养到150h时，开始流加补葡萄糖溶液，通过调节补糖速度控制发酵液中葡萄糖浓度在0.5～2.0％之间，第228h时停止补糖。

[0071] 发酵培养到240h时结束培养，得到含有尼莫克汀的发酵液。

[0072] 对比例3

[0073] 步骤1，将初始蓝灰链霉菌(未经紫外灯光照射诱变的菌株)接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；

[0074] 步骤2，取生长好的菌种斜面，刮取约0.5cm×0.5cm斜面上的孢子接种到500ml种子摇瓶中，种子摇瓶装量为50ml，接种好的种子摇瓶在转速为200rpm的摇床上28℃培养28h。

[0075] 步骤3，将培养好摇瓶种子按照1％的接种量接种至10L不锈钢种子罐上，种子罐的装量为5.0L，种子罐培养条件为罐温28℃，通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制种子罐上溶氧值(DO)≥30％，种子罐培养时间为24h。

[0076] 步骤4，将培养好种子罐种子液按照10％的接种量接种至50L发酵罐上，发酵罐的装量为30L，发酵罐培养条件为罐温28℃，通气量0.8vvm，搅拌转速200rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制发酵罐上溶氧值(DO)≥30％。

[0077] 发酵培养到240h时结束培养，得到含有尼莫克汀的发酵液。

[0078] 表1，本发明生产尼莫克汀方法与对比例效果对比

[0079]

[0080]

[0081] 通过表1的对比可以看出，本申请所用菌株，在L-缬氨酸存在情况下，能够显著提高尼莫克汀发酵产量，未诱变菌株(对比例1-3)在加入L-缬氨酸之后，反而导致尼莫克汀发酵产量下降。这是由于常规蓝灰链霉菌对L-缬氨酸有一定敏感性，L-缬氨酸存在下会对蓝灰链霉菌产生毒性，导致菌株活性下降，从而发酵效率下降

[0082] 申请人认为，尼莫克汀分子中的异丙基是来自于L-缬氨酸，因此在发酵液中添加L-缬氨酸可以节省菌体自身合成L-缬氨酸所需的时间和营养，从而提高产量，为此，本申请筛选出的蓝灰链霉菌可以抗L-缬氨酸毒性，在加入L-缬氨酸之后，能够提生产尼莫克汀的产量。例如，本发明实施例4-5与对比例1-3相比，本发明生成尼莫克汀的方法，所得产量比未诱变菌株最高产量提高了9-12％。

[0083] 对比实施例1和实施例2、3可知，在初始的发酵培养基中添加L-缬氨酸的效果并不明显，而在发酵48h后，菌株初级代谢基本完成，次级代谢占据主要地位，此时添加L-缬氨酸则有较好的效果，尤其是分次少量添加的效果更优。

[0084] 对比实施例1-5，本发明在发酵过程中维持葡萄糖等生长因子的浓度，还可以进一步提高发酵效率。

[0085] 应当理解的是，本发明上述实施例中所述各种培养基，也可以用其他培养基进行替代，这对本领域技术人员来讲不存在技术困难。

[0086] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。