一种大叶金腰的水培繁殖的培养液及培养方法

摘要

本发明为一种大叶金腰的水培繁殖的培养液及水培方法。本发明以大叶金腰叶片作为外植体，使用不同的培养液进行培养，根据外植体是否能生成不定根和腋芽以及所需时间长短作为依据，选择出适合大叶金腰的水培繁殖的培养液并进行室外移栽。本发明的培养方法移栽成活率高，极大的促进大叶金腰的繁殖，有效缩短生根时间，可以为金腰的规模化种植和大田管理提供原材料来源，适用大规模产业化生产。

权利要求

1.一种大叶金腰的水培繁殖培养液在促进大叶金腰外植体的腋芽生长中的用途，所述大叶金腰的水培繁殖培养液由IAA、1/5MS与水组成，所述IAA的浓度为0.01mg/L，或者所述大叶金腰的水培繁殖培养液由IAA、1/8MS与水组成，所述IAA的浓度为0.01mg/L。

2.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外植体为叶片。

3.一种大叶金腰的水培繁殖的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

(1).配制大叶金腰的水培繁殖培养液，所述大叶金腰的水培繁殖培养液由IAA、1/5MS与水组成，所述IAA的浓度为0.01mg/L，或者所述大叶金腰的水培繁殖培养液由IAA、1/8MS与水组成，所述IAA的浓度为0.01mg/L；

(2).外植体的选取，选择生长比较健壮、无病虫害、生长阶段适宜的植株，取植株幼嫩、大小适宜的叶片的作为外植体；

(3).外植体的处理，采摘：左手托住植物，右手用刀片斜切叶柄，即得到所需叶片；清洗：取回来的叶片用手托住，然后轻轻抖动，慢慢拍打，使泥土脱落；然后将叶片置于自来水流下，连续冲洗，并用手轻轻柔搓，直至肉眼观察不到叶片上有泥沙颗粒为止；修剪：在大叶金腰叶片的叶柄处切割，斜切，保留整个叶柄，剔除叶片枯黄的部分；修剪后再次清洗叶片，将修剪时留下的残渣清理掉；

(4).外植体的培养，将处理完的叶片置于步骤(1)配制完成的培养液之中，进行培养；

培养条件：温度12-15℃，光照时间12h，光照强度500-1000lx，湿度：每三天更换一次培养液，每天两次喷水保湿；

(5).外植体的移栽：叶片长出不定根和腋芽后，将其移栽到用多菌灵灭过菌的黑土+蛭石按照1:1的比例做基质的孔穴盘中；室外培养，水分保证充足。

说明书

一种大叶金腰的水培繁殖的培养液及培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物水培繁殖技术领域，具体涉及一种大叶金腰的水培繁殖的培养液和培养方法。

背景技术

[0002] 金腰(Chrysosplenium)是一种隶属于虎耳草科(Saxifragaceae)的植物，全球约65种，亚、欧、非、美四洲均有分布，但主产东亚温带。一般依据叶片对生或互生分为互叶亚属(Subg.Gamosplenium)和金腰亚属(Subg.Chrysosplenium or Subg.Dialysplenium)：互叶亚属全球约33种，中国产23种6变种；金腰亚属全球约32种，中国产11种和2变种；东亚有大叶金腰约51种，中国有36种8变种，南北均产，且其中21种为中国特有种。金腰是一种具有匍匐枝或鳞茎的多年生常绿小草本，它多生于潮湿的环境中。金腰的花果期一般在早春，其植株矮小，这也是它很容易被分类学专家们忽略的一个原因。另外，虎耳草科内其他种属的植物大多有5个一组的花瓣或萼片，而大叶金腰非但没有花瓣，萼片也只是4个一组，这是大叶金腰与虎耳草科其它属植物最大的区别，也正因此该属在虎耳草科的系统演化上具有特殊地位。

[0003] 大叶金腰多年生草本，高17-21厘米；不育枝长23-35厘米，其叶互生，具柄，叶片阔卵形至近圆形，长0.3-1.8厘米，宽0.4-1.2厘米，边缘具11-13圆齿，腹面疏生褐色柔毛，背面无毛，叶柄长0.8-1厘米，具褐色柔毛。大叶金腰生于海拔1000-2236米的林下或沟旁阴湿处，在我国主要分布在安徽南部、浙江西北部、江西、湖北、湖南、广东北部、四川东部、贵州和云南东部。大叶金腰具有药用作用，其可以用于治疗小儿惊风和肺、耳部疾病等。

[0004] 植物快繁技术又可称为“快繁”和“微繁”，前者来源于其繁殖速度很快，后者来源于其使用的材料较细小。快繁是指在人为控制光照、温度、湿度、氧气等环境条件和营养条件下，利用植物部分组织器官作为外植体繁殖出植株的方法。水培是一种应用广泛的植物繁殖方法，是将植物的根、茎、叶、芽等切离植株，在一定条件下将浸泡于水中，待其长出不定根、不定芽后，可移栽，使其长成新的完整植株，水培是一种比较特别的营养繁殖方法，它除了可以用于促进生根，还能用于诱导不定芽、增殖芽苗、培养原球茎等，同时又克服了传统扦插受季节影响、遗传不稳定、扦插后管理环节繁琐等缺点，具有取材容易、操作简便、繁殖快、成本低的特点。

[0005] 研究表明大叶金腰含有甲氧基化和羟基化的黄酮醇类化合物，应用价值颇高。现有技术中有利用愈伤组织培养方法进行金腰的繁殖与培养，但是，组愈伤织培养是一种在无菌条件下进行的，将外植体如离体器官、细胞、原生质体等放置于人工配制的培养液上培养，同时给予适合于外植体生长的环境与营养条件，诱导其产生愈伤组织或者潜伏芽等，再进一步培养成整个植株。愈伤组织培养方法对无菌环境要求很高，对于培养条件、操作人员、设备的要求较高，且培养周期较长，不适合用于大规模的产业化生产。

[0006] 目前我国的金腰资源紧缺，且国内外关于金腰的水培快繁技术方面的研究，特别是大叶金腰的水培快繁技术，可以说尚属空白。因此，获得一种培养液成分简单，配制容易且适用于水培快繁的大叶金腰培养液，并以此培养液为基础开发出再生率高，操作简便，繁殖速度快，适用于大规模产业化生产的大叶金腰的水培快繁技术，是目前急需解决的问题。

发明内容

[0007] 本发明目的之一是一种大叶金腰的水培繁殖培养液，其可以使大叶金腰利用水培方式进行繁殖，实现大叶金腰快速繁殖的目的，该培养液可以快速促进大叶金腰外植体的生成腋芽和不定根，并促进腋芽和不定根的生长。

[0008] 为实现上述目的，本发明的大叶金腰的水培繁殖培养液由MS、植物激素和水组成，所述植物激素的浓度为0.01-0.05mg/L。优选的，所述外植体为叶片，所述植物激素选自IAA，所述MS为1/5MS或1/8MS。进一步优选的，所述培养液由IAA、1/5MS与水组成，所述IAA的浓度为0.01mg/L，或者，所述培养液由IAA、1/8MS与水组成，所述IAA的浓度为0.01mg/L，所述水为自来水。

[0009] 在上述培养液中，IAA为吲哚乙酸，其是一种有机物。纯品是无色叶状晶体或结晶性粉末，其通常作为植物生长激素，调节植物的生长，促进植物生根生芽。

[0010] 在上述培养液中，MS为本领域常用的植物组织培养培养基，其成分具体为：大量元素：NH4NO3，1650mg/L；KNO3，1900mg/L；CaCl2·2H2O，440mg/L；MgSO4·7H2O，370mg/L；KH2PO4，170mg/L；微量元素：KI，0.83mg/L；H3BO3，6.2mg/L；MnSO4·4H2O，22.3mg/L；ZnSO4·
7H2O，8.6mg/L；Na2MoO4·2H2O，0.25mg/L；CuSO4·5H2O，0.025mg/L；CoCl2·6H2O，0.025mg/L；
铁盐：FeSO4·7H2O，27.8mg/L；Na2-EDTA·2H2O，37.3mg/L；有机物质：肌醇，100mg/L；烟酸，
0.5mg/L；盐酸吡哆醇(维生素B6)，0.5mg/L；盐酸硫胺素(维生素B1)，0.1mg/L；甘氨酸，
2.0mg/L。本发明中所使用的MS为商业制造的MS培养基粉末，使用时直接称量溶解即可。本发明的MS培养基中不含有植物激素类物质和糖类物质。相应的1/5MS或1/8MS可基于上述配方，通过本领域常规的方法调整获得。

[0011] 本发明的第二个目的是提供一种大叶金腰的水培繁殖，特别是大叶金腰外植体的水培繁殖培养液的方法，其采用本发明所述的水培繁殖培养液，实现了只用快速促进大叶金腰外植体的生成腋芽和不定根、操作简单，适用于大规模生产的效果。所述方法的具体步骤为：

[0012] (1).配制前述培繁殖培养液；优选的，所述培养液由IAA、1/5MS与水组成，所述IAA的浓度为0.01mg/L，或者，所述培养液由IAA、1/8MS与水组成，所述IAA的浓度为0.01mg/L。进一步优选的，所述水为自来水；

[0013] (2).外植体的选取，选择生长比较健壮、无病虫害、生长阶段适宜的植株，取植株幼嫩、大小适宜的叶片的作为外植体；

[0014] (3).外植体的处理，采摘：左手托住植物，右手用刀片斜切叶柄，即得到所需叶片；清洗：取回来的叶片用手托住，然后轻轻抖动，慢慢拍打，使泥土脱落；然后将叶片置于自来水流下，连续冲洗，并用手轻轻柔搓，直至肉眼观察不到叶片上有泥沙颗粒为止；修剪：在大叶金腰叶片的叶柄处切割，斜切，保留整个叶柄，剔除叶片枯黄的部分；修剪后再次清洗叶片，将修剪时留下的残渣清理掉；

[0015] (4).外植体的培养，将处理完的叶片置于步骤(1)配制完成的培养液之中，进行培养；培养条件：温度12-15℃，光照时间12h，光照强度500-1000lx，湿度：每三天更换一次培养液，每天两次喷水保湿；

[0016] (5).外植体的移栽：叶片长出不定根和腋芽后，将其移栽到用多菌灵灭过菌的黑土+蛭石按照1:1的比例做基质的孔穴盘中；室外培养，水分保证充足。

[0017] 本发明的第三个目的是提供一种大叶金腰的水培繁殖培养液的用途。所述用途为：用于大叶金腰外植体的水培繁殖；用于促进大叶金腰外植体的腋芽生成和生长；用于促进大叶金腰外植体的不定根生成和生长。优选的，所述外植体为带叶柄的叶片。

[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0019] 1.本发明是一种针对大叶金腰的水培快繁方法。利用大叶金腰的叶片作为外植体，水培形成不定根和腋芽，移栽成活率高，极大的促进大叶金腰的繁殖，有效缩短生根时间，可以为大叶金腰的规模化种植和大田管理提供原材料来源，适用大规模产业化生产。

[0020] 2.以自来水为培养液的主要成分，添加不同类型、不同浓度的培养液和激素，探索能生成不定根和腋芽的最佳培养液。研究表明含有低浓度MS和IAA的培养液更利于大叶金腰的水培。

[0021] 3.将外植体移栽到用多菌灵灭菌过的黑土+蛭石按照1:1的比例做基质的孔穴盘中。蛭石具有很好的松散性和保水性，可以保证充足的水分。

[0022] 4.移栽后的外植体在培养一段时间后生长为一颗完整植株，取该植株的叶片作为外植体再次进行水培培养，能生成不定根，移栽后能存活，提高了大叶金腰培养的扩繁能力和扩繁系数。

[0023] 5.大叶金腰含有高度甲氧基化和羟基化的黄酮醇类化合物，应用价值颇高。本发明可以为深入研究和开发大叶金腰的药用价值打下基础。

附图说明

[0024] 图1是X类培养液中大叶金腰外植体生长情况；

[0025] 图2是Y类培养液中大叶金腰外植体生长情况；

[0026] 图3是X-4类培养液中绵毛金腰外植体生长情况；

[0027] 图4是X-7类培养液中绵毛金腰外植体生长情况；

[0028] 图5是X-4培养液培养的外植体移栽室外的生长情况。

具体实施方式

[0029] 为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。

[0030] 实施例1大叶金腰外植体的水培繁殖培养液

[0031] 为了探索不同培养液成对于绵毛金腰外植体的水培繁殖效果的影响，我们以三个变化因子为研究对象设计了实验，一是添加的培养液的种类，二是添加的激素的种类，三是添加的激素的质量浓度，实验中使用的培养液一共有18种，均使用自来水做溶剂。

[0032] 培养液的配制方法为根据表1的配方，采用本领域常规的方法进行配制。

[0033] 所述18种培养液的具体成分如表所示。

[0034] 表1大叶金腰外植体的水培繁殖培养液类型

[0035]

[0036] 实施例2：大叶金腰外植体的水培繁殖的方法

[0037] 为了提高培养结果的严谨性，在培养过程中，实施例1中配制18种培养液，每种培养液设置6个重复，均在培养皿中培养，以便于观察单个外植体的培养效果。

[0038] 大叶金腰外植体的水培繁殖的具体方法如下：

[0039] (1).配制实施例1中所述的各种不同类型的水培繁殖培养液；

[0040] (2).外植体的选取，选择生长比较健壮、无病虫害、生长阶段适宜的植株，取植株幼嫩、大小适宜的叶片的作为外植体；

[0041] (3).外植体的处理，采摘：左手托住植物，右手用刀片斜切叶柄，即得到所需叶片；清洗：取回来的叶片用手托住，然后轻轻抖动，慢慢拍打，使泥土脱落；然后将叶片置于自来水流下，连续冲洗，并用手轻轻柔搓，直至肉眼观察不到叶片上有泥沙颗粒为止；切割：在大叶金腰的叶片的叶柄处切割，保留叶柄1-2cm，斜切；修剪后再次清洗叶片，将修剪时留下的残渣清理掉；

[0042] (4).外植体的培养，将处理完的叶片置于步骤(1)配制完成的培养液之中，进行培养；培养条件：温度：12-15℃，光照时间12h，光照强度500-1000lx，湿度；每三天更换一次培养液，每天两次喷水保湿；

[0043] 实施例3：不同培养液对整体培养效果的影响

[0044] 在外植体的培养过程中，每天观察其生长状态，并拍照记录。通过图2所显示的结果可知，外植物(叶片)在Y类培养液中培养几天后，植物表面有变焉和染菌的现象，生长状况明显不佳。培养至第8天，叶片变蔫的面积扩大，生长情况不佳且6组重复实验结果相同。而X类培养液中的外植体一直生长良好，保持鲜嫩，如图1所示，且6组重复实验结果相同。对照培养液中，外植体虽然能保持绿色，但并未生长。

[0045] 通过对不同培养液的观察结果可知，X类培养液(具体配方参见实施例1)，适用于大叶金腰的外植体水培繁殖。

[0046] 实施例4：不同X类培养液对大叶金腰外植体的腋芽或不定根的生成和生长的影响[0047] 外植体(叶片)在X类培养液中本都能保持嫩绿状态。X类培养液对外植体的影响主要体现在腋芽和不定根生成的时间，腋芽和不定根生长的速度、长度、密度。如图3所示，X-4培养液中培养至约第15天生成新芽，第25天左右形成不定根，在第29天时该新芽长大，在第32天时不定根的长度达到5mm，在第45天时，不定根和新芽进一步伸长。

[0048] 如图4所示，在X-7类营养液中外植体能较好的生长并保持嫩绿，在第29天时长出了较多的不定根，在第32天时，不定根长度达到5mm，并长出腋芽，在第45天时，不定根和新芽进一步伸长。

[0049] X-1、X-2、X-3、X-5、X-6、X-8、X-9长出不定根的时间分别为45，41，41，32，32，32，35天。除X-4、X-7培养液外，其余培养液均未发现新的腋芽生成。在6个重复实验中X-4、X-7培养液均长出腋芽和不定根，6个重复实验生成腋芽和不定根的时间类似，前后相差1-2天左右。

[0050] 综合各个因素认为，X-4培养液最适合于大叶金腰外植体水培快繁。

[0051] 实施例5：X-4培养液中培养的外植体移栽室外的生长情况

[0052] 大叶金腰外植体在X-4培养液中，培养45天后，移栽室外，移栽方法如下：

[0053] 1.基质的处理

[0054] 移栽前1-2天准备好基质、孔穴盘，寻找合适的移栽圃地。以黑土和蛭石体积比1:1混合作为移栽基质，将黑土与蛭石充分混匀，大块黑土搅碎，基质颗粒均匀即可。提前一天用稀释1000倍的多菌灵水溶液将基质和孔穴盘进行消毒，然后放置于太阳光下照晒，待用。

[0055] 2.外植体的移栽

[0056] 先将基质填充到孔穴内，填充体积大约为孔穴的4/5；自来水清洗一遍外植体，后将外植体轻放于孔穴内，使叶片向上；添加基质直至盖过匍匐茎，注意要使新长出的芽(由腋芽长大而成)暴露于基质表面；将基质压实使得植物不松动，然后浇透水；移栽后的植物放置于室外培养，为避免光线过强，应在圃地上方搭盖遮阳网。

[0057] 3.移栽后管理

[0058] 移栽后的植物依然容易缺水造成叶片焦边，因此每天早晚各进行一次喷水。另外，移栽后要实时注意观察，防止病虫害的发生，并要及时除杂，保证生长环境的卫生。

[0059] 4.移栽后生长情况

[0060] 移栽1.5个月后长出新的芽，到第3个月，外植体已然长成一个新植株，6组重复实验获得的外植体，移栽室外均能成活，移栽成活率100％。

[0061] 实施例6：以实施例5移栽成活大叶金腰外的再次进行水培繁殖

[0062] 以实施例5移栽成活大叶金腰做外植体的取材材料，采用实施例2的外植体培养方法，在X-4培养液中培养45天后，移栽室外，移栽方法同实施例5，移栽成活，3个月后，外植体长成一个新植株。

[0063] 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。