一种金铁锁离体快繁方法

摘要

本发明提供了一种金铁锁的离体快繁方法，涉及植物组培技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：1)以消毒后的金铁锁幼嫩组织为外植体，将所述外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养，得诱导苗；2)将步骤1)得到的所述诱导苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得丛生苗；3)将从步骤2)得到的所述丛生苗中分离出的单芽接种于生根培养基中进行生根培养，得金铁锁离体快繁苗。本发明所述方案的外植体诱导率达95％，增殖系数达20～25倍以上，生根率达90％以上，移栽成活率达95％以上，未发现突变株，本发明方法能最大程度保持母株的优良性状，不仅操作简单，成本低廉，而且生根率高，根系发达，其组培苗移栽成活率高。

权利要求

1.一种金铁锁离体快繁方法，包括以下步骤：1)以金铁锁幼嫩组织为外植体，消毒后接种于诱导培养基上进行诱导培养，得诱导苗；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.3～0.5mg/L的6-BA、0.2～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖和4～7g/L的琼脂；2)将步骤1)得到的所述诱导苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得丛生苗；所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.2～0.3mg/L的BA、0.2～0.4mg/L的NAA、0.01～0.03mg/L的PP333、25～35g/L的蔗糖和4～7g/L的琼脂；3)将从步骤2)得到的所述丛生苗中分离出的单芽接种于生根培养基中进行生根培养，得金铁锁离体快繁苗；所述生根培养基以改良B5培养基为基本培养基，还包括0.4～0.8mg/L的NAA、0.01～0.03mg/L的PP333和25～36g/L的蔗糖；

步骤1)所述幼嫩组织为幼嫩茎段。

2.根据权利要求1所述离体快繁方法，其特征在于，步骤1)所述消毒包括将所述外植体置于含洗洁精的水溶液中浸泡3～5min，取出后清洗干净；再置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡5～8min，取出，冲洗4～5次。

3.根据权利要求1所述离体快繁方法，其特征在于，步骤1)所述诱导培养的光照时间为

10～15h/d，光照强度为1500～2000lx，所述诱导培养的温度为23～25℃，所述诱导培养的时间为20～28d。

4.根据权利要求1所述离体快繁方法，其特征在于，步骤2)所述增殖培养的光照时间为

10～15h/d，光照强度为1500～2000lx，所述增殖培养的温度为23～25℃，所述增殖培养的时间为20～25d。

5.根据权利要求1所述离体快繁方法，其特征在于，步骤3)所述生根培养的光照时间为

10～15h/d，光照强度为1500～2000lx，所述生根培养的温度为23～25℃，所述生根培养的时间为20～25d。

6.根据权利要求1所述离体快繁方法，其特征在于，步骤3)所述生根培养后，还包括炼苗和移栽，得到大田苗。

7.根据权利要求6所述离体快繁方法，其特征在于，所述炼苗为将离体快繁苗置于温室大棚中炼苗5～7d。

8.根据权利要求6所述离体快繁方法，其特征在于，所述移栽为将炼苗后的离体快繁苗移栽入基质中，所述基质包括椰糠和蛭石。

9.根据权利要求8所述离体快繁方法，其特征在于，所述椰糠和蛭石的体积比为(1～

4)：1 。

说明书

一种金铁锁离体快繁方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种金铁锁离体快繁方法。

背景技术

[0002] 金铁锁(Psammosilene tunicoides)为石竹科金铁锁属药用植物，是中国西南地区特有单种属植物。金铁锁为中国传统名药“云南白药”的主要成分之一，也是多种知名中成药的主要成分。近年来随着人们对金铁锁药用价值的不断深入认识，需求量与日俱增。但由于受自然环境因素和人为作用的影响，金铁锁野生资源数量急剧下降，目前已作为珍稀濒危物种列入《中国植物红皮书》，属于国家二级重点保护植物，是研究石竹科系统进化非常重要的材料。生产中用金铁锁主要采用种子进行繁殖，但该方法发芽率极低，且不能保证繁育种苗品质的优良性。组织培养技术可以在短时间内获得大量的繁殖体，对解决金铁锁资源紧缺问题具有重要意义。

[0003] 目前国内也有少量有关金铁锁组织培养的文献报道，但多通过诱导愈伤组织进行金铁锁组织培养技术的研究，如陈杰等(2016)、李斌等(2016)、李景滨等(2011)均采用先诱导愈伤组织发生，然后通过诱导愈伤组织分化后获得金铁锁组培苗，该方法不仅操作繁琐其愈伤组织发生变异的概率较高，不能很好的保持母本的优良性状；采用常规的固体培养基诱导金铁锁生根率低，且粘附的固体培养基不易清洗，从而影响组培苗的移栽成活率。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种金铁锁离体快繁方法，突变频率低，能最大程度保持母株的优良性状，不仅操作简单，成本低廉，而且生根率高，根系发达，其组培苗移栽成活率高。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种金铁锁离体快繁方法，包括以下步骤：1)以金铁锁幼嫩组织为外植体，消毒后接种于诱导培养基上进行诱导培养，得诱导苗；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.3～0.5mg/L的6-BA、0.2～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖和4～7g/L的琼脂；2)将步骤1)得到的所述诱导苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得丛生苗；
所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.2～0.3mg/L的BA、0.2～0.4mg/L的NAA、0.01～0.03mg/L的PP333、25～35g/L的蔗糖和4～7g/L的琼脂；3)将从步骤2)得到的所述丛生苗中分离出的单芽接种于生根培养基中进行生根培养，得金铁锁离体快繁苗；所述生根培养基以改良B5培养基为基本培养基，还包括0.4～0.8mg/L的NAA、0.01～0.03mg/L的PP333和25～36g/L的蔗糖。

[0007] 优选的，步骤1)所述幼嫩组织包括幼嫩茎段。

[0008] 优选的，步骤1)所述消毒包括将所述外植体置于含洗洁精的水溶液中浸泡3～5min，取出后清洗干净；再置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡5～8min，取出，冲洗4～
5次。

[0009] 优选的，步骤1)所述诱导培养的光照时间为10～15h/d，光照强度为1500～2000lx，所述诱导培养的温度为23～25℃，所述诱导培养的时间为20～28d。

[0010] 优选的，步骤2)所述增殖培养的光照时间为10～15h/d，光照强度为1500～2000lx，所述增殖培养的温度为23～25℃，所述增殖培养的时间为20～25d。

[0011] 优选的，步骤3)所述生根培养的光照时间为10～15h/d，光照强度为1500～2000lx，所述生根培养的温度为23～25℃，所述生根培养的时间为20～25d。

[0012] 优选的，步骤3)所述生根培养后，还包括炼苗和移栽，得大田苗。

[0013] 优选的，所述炼苗为将离体快繁苗置于温室大棚中炼苗5～7d。

[0014] 优选的，所述移栽为将炼苗后的离体快繁苗移栽入基质中，所述基质包括椰糠和蛭石。

[0015] 优选的，所述椰糠和蛭石的体积比为(1～4)：1。

[0016] 本发明提供了一种金铁锁离体快繁方法，外植体直接诱导成苗，突变频率低，能最大程度保持母株的优良性状；利用液体培养基进行生根培养，不仅操作简单，成本低廉，而且生根率高，根系发达，其组培苗移栽成活率高。在本发明实施例中，外植体诱导率达95％，增殖系数达20～25倍，生根率达90％以上，移栽成活率达95％以上，未发现变异植株。

具体实施方式

[0017] 本发明提供了一种金铁锁离体快繁方法，包括以下步骤：1)以金铁锁幼嫩组织为外植体，消毒后接种于诱导培养基上进行诱导培养，得诱导苗；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.3～0.5mg/L的6-BA、0.2～0.5mg/L的NAA、25～36g/L的蔗糖和3～10g/L的琼脂；2)将步骤1)得到的所述诱导苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得丛生苗；所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.2～0.3mg/L的BA、0.2～0.4mg/L的NAA、0.01～0.03mg/L的PP333、25～35g/L的蔗糖和4～7g/L的琼脂；3)将从步骤2)得到的所述丛生苗中分离出的单芽接种于生根培养基中进行生根培养，得金铁锁离体快繁苗；所述生根培养基以改良B5培养基为基本培养基，还包括0.4～0.8mg/L的NAA、0.01～0.03mg/L的PP333和25～36g/L的蔗糖。

[0018] 在本发明所述金铁锁离体快繁方法中，以消毒后的金铁锁幼嫩组织为外植体，将所述外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养，得诱导苗；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.3～0.5mg/L的6-BA、0.2～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖和4～7g/L的琼脂。本发明所述幼嫩组织优选的包括幼嫩茎段，本发明对所述幼嫩茎段的来源并没有特殊限定，优选来源于生长健壮、无病虫害的金铁锁植株。本发明所述消毒优选包括将所述外植体置于含洗洁精的水溶液中浸泡3～5min，取出后清洗干净；再置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡5～8min，取出，冲洗4～5次。本发明对所述含洗洁精的水溶液的浓度并没有特殊限定，利用本领域的常规洗洁精水溶液即可。本发明在所述含洗洁精的水溶液中浸泡时，优选包括用软毛刷清洗表面污垢。本发明所述升汞溶液浸泡优选在无菌条件下进行，所述无菌条件优选为超净工作台。本发明所述诱导培养优选为将所述外植体的生物学下端垂直竖插于诱导培养基中进行诱导培养。本发明所述诱导培养基中包含6-BA，所述6-BA在所述诱导培养基中的浓度优选为0.33～0.48mg/L，更优选为0.38～0.42mg/L，最优选为0.4mg/L。本发明所述诱导培养基中包含NAA，所述NAA在所述诱导培养基中的浓度优选为0.27～0.45mg/L，更优选为0.3～0.4mg/L，最优选为0.35mg/L。本发明所述诱导培养基中包含蔗糖，所述蔗糖在所述诱导培养基中的浓度优选为27～34g/L，更优选为28～32g/L，最优选为30g/L。本发明所述诱导培养中包含琼脂，所述琼脂在所述诱导培养基中的浓度优选为
4.5～7.8g/L，更优选为5～7g/L，最优选为6g/L。本发明对所述诱导培养基中的各原料来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述诱导培养的光照时间优选为10～15h/d，更优选为11～13h/d。最优选为12h/d。本发明所述诱导培养的光照强度优选为
1500～2000lx，更优选为1600～1900lx，最优选为1800lx。本发明所述诱导培养的温度优选为23～25℃，更优选为24℃。本发明所述诱导培养的时间优选为20～28d，更优选为22～
26d，最优选为25d。在本发明实施例中，诱导培养20d时统计萌发率为95％。

[0019] 得诱导苗后，本发明将所述诱导苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得丛生苗；所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.2～0.3mg/L的BA、0.2～0.4mg/L的NAA、0.01～0.03mg/L的PP333、25～35g/L的蔗糖和4～7g/L的琼脂。本发明所述增殖培养基包含BA，所述BA在所述增殖培养基中的浓度优选为0.22～0.28mg/L，更优选为0.24～
0.26mg/L，最优选为0.25mg/L。本发明所述增殖培养基中包含NAA，所述NAA的在所述增殖培养基中的浓度优选为0.22～0.38mg/L，更优选为0.28～0.36mg/L，最优选为0.3mg/L。本发明所述增殖培养基中包含PP333，所述PP333在所述增殖培养基中的浓度优选为0.014～
0.028mg/L，更优选为0.018～0.024mg/L，最优选为0.02mg/L。本发明所述增殖培养基中包含蔗糖，所述蔗糖在所述增殖培养基中的浓度优选为27～33g/L，更优选为28～32g/L，最优选为30g/L。本发明所述增殖培养中包含琼脂，所述琼脂在所述增殖培养基中的浓度优选为
4.5～7.2g/L，更优选为5～6.5g/L，最优选为6g/L。本发明对所述增殖培养基中的各原料来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述增殖培养的光照时间优选为
10～15h/d，更优选为11～13h/d。最优选为12h/d。本发明所述增殖培养的光照强度优选为
1500～2000lx，更优选为1600～1900lx，最优选为1800lx。本发明所述增殖培养的温度优选为23～25℃，更优选为24℃。本发明所述增殖培养的时间优选为20～28d，更优选为24-26d，最优选为25d。在本发明实施例中，增殖培养25d时统计增殖率为25倍。

[0020] 得丛生苗后，本发明将所述丛生苗中分离出的单芽接种于生根培养基中进行生根培养，得金铁锁离体快繁苗；所述生根培养基以改良B5培养基为基本培养基，还包括0.4～0.8mg/L的NAA、0.01～0.03mg/L的PP333和25～36g/L的蔗糖。本发明对所述分离的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规丛生苗分离方法即可。本发明所述生根培养基包含NAA，所述NAA在所述生根培养基中的浓度优选为0.45～0.72mg/L，更优选为0.55～0.68mg/L，最优选为0.6mg/L。本发明所述生根培养基包含PP333，所述PP333在所述生根培养基中的浓度优选为0.012～0.028mg/L，更优选为0.018～0.022mg/L，最优选为0.02mg/L。本发明所述生根培养基包含蔗糖，所述蔗糖在所述生根培养基中的浓度优选为26～35g/L，更优选为28～32g/L，最优选为30g/L。本发明所述生根培养为液体培养基，可以提高生根率，使根系发达，提高其组培苗移栽成活率，同时避免了移栽时清洗培养基的步骤，减轻工作量，提高工作效率。
本发明对所述生根培养基中的各原料来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。
本发明所述生根培养的光照时间优选为10～15h/d，更优选为11～13h/d。最优选为12h/d。
本发明所述生根培养的光照强度优选为1500～2000lx，更优选为1600～1900lx，最优选为
1800lx。本发明所述生根培养的温度优选为23～25℃，更优选为24℃本发明所述生根培养的时间优选为20～25d，更优选为22～24d，最优选为23d。在本发明实施例中，生根培养25d时统计生根率为95％。

[0021] 本发明在所述生根培养后，优选还包括炼苗和移栽，得大田苗。本发明所述炼苗优选为将离体快繁苗置于温室大棚中炼苗5～7d。本发明所述移栽优选为将炼苗后的离体快繁苗移栽入基质中，所述基质优选包括椰糠和蛭石。本发明所述椰糠和蛭石的体积比优选为(1～4)：1，更优选为(1.5～3)：1，最优选为2:1。本发明中椰糠具有保水性好，且在一定程度上可以提供幼苗生长所需的营养物质，而蛭石为轻盈的颗粒状，通透性好；将两者按所述比例混合后，形成了保水性和通气性均较为理想的混合基质。

[0022] 下面结合实施例对本发明提供的金铁锁离体快繁方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0023] 实施例1

[0024] 选取生长健壮、无病虫害植株的金铁锁幼嫩茎段，剪掉其叶片后放入加有洗洁精的水中，用软毛刷清洗表面污垢，在流水中冲洗干净；在超净工作台上，用0.1％升汞浸泡处理5min，再用无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分。

[0025] 在无菌条件下，将茎段切成带一个腋芽的单芽茎段，将生物学下端垂直竖插于诱导培养基MS+0.3mg/L 6-BA+NAA 0.2mg/L+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)中进行培养。培养条件：培养温度为23℃、光照条件为1500lx、光照时间为12h/d，培养周期为25天。20d后测得萌发率为95％。

[0026] 将培养的无菌苗单芽茎段转入增殖培养基：MS+BA  0.2mg/L+NAA0.2mg/L+PP3330.01mg/L+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂。培养条件为：培养温度为23℃、光照条件为1500lx、光照时间为12h/d，培养周期为25天。增殖率为24.3倍。

[0027] 将单芽茎段接种到生根培养基：改良B5+NAA0.4mg/L+PP3330.01mg/L+30.0g/L蔗糖中诱导植株生根，生根培养条件为：培养温度为23℃、光照条件为1500lx、光照时间为12h/d，培养周期为25天。20d后生根率可达90％。

[0028] 将株高3～4cm、生长健壮、根系发达的无菌瓶苗从培养室移入温室大棚炼苗5d，然后取出幼苗，洗净附着的液体培养基，栽入椰糠：蛭石(2:1)混合基质的营养钵中。测得移栽成活率为98％，且无变异植株出现。

[0029] 实施例2

[0030] 选取生长健壮、无病虫害植株的幼嫩茎段，剪掉其叶片后放入加有洗洁精的水中，用软毛刷清洗表面污垢，在流水中冲洗干净。在超净工作台上，用0.1％升汞浸泡处理8min，再用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分。

[0031] 在无菌条件下，将茎段切成带一个腋芽的单芽茎段，将生物学下端垂直竖插于诱导培养基：MS+0.5mg/L 6-BA+NAA 0.5mg/L+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)中进行培养。培养条件：培养温度为25℃、光照条件为2000lx、光照时间为12h/d，培养周期为25天。20d后萌发率为95％。

[0032] 将培养的无菌苗单芽茎段转入增殖培养基：MS+BA  0.3mg/L+NAA0.4mg/L+PP3330.03mg/L+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂。培养条件：培养温度为25℃、光照条件为2000lx、光照时间为12h/d，培养周期为20天。增殖率为23.7倍。

[0033] 将单芽茎段接种到生根培养基：改良B5+NAA0.8mg/L+PP3330.03mg/L+30.0g/L蔗糖中诱导植株生根，生根培养条件：培养温度为25℃、光照条件为2000lx、光照时间为12h/d，培养周期为20天。20d后生根率可达90％。

[0034] 将株高3～4cm、生长健壮、根系发达的无菌瓶苗从培养室移入温室大棚炼苗7d，然后取出幼苗，洗净附着的液体培养基，栽入椰糠：蛭石(2:1)混合基质的营养钵中，移栽成活率为96％，且无变异植株出现。

[0035] 实施例3

[0036] 选取生长健壮、无病虫害植株的幼嫩茎段，剪掉其叶片后放入加有洗洁精的水中，用软毛刷清洗表面污垢，在流水中冲洗干净。在超净工作台上，用0.1％升汞浸泡处理8min，再用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分。

[0037] 在无菌条件下，将茎段切成带一个腋芽的单芽茎段，将生物学下端垂直竖插于诱导培养基：MS+0.4mg/L 6-BA+NAA 0.35mg/L+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)中进行培养。培养条件：培养温度为24℃、光照条件为1800lx、光照时间为12h/d，培养周期为25天。20d后萌发率为95％。

[0038] 将培养的无菌苗单芽茎段转入增殖培养基：MS+BA 0.25mg/L+NAA0.3mg/L+PP3330.02mg/L+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂。培养条件：培养温度为24℃、光照条件为1800lx、光照时间为12h/d，培养周期为25天。增殖率为24.8。

[0039] 将单芽茎段接种到生根培养基：改良B5+NAA0.6mg/L+PP3330.02mg/L+30.0g/L蔗糖中诱导植株生根，生根培养条件：培养温度为24℃、光照条件为1800lx、光照时间为12h/d，培养周期为20天。20d后生根率可达90％。

[0040] 将株高3～4cm、生长健壮、根系发达的无菌瓶苗从培养室移入温室大棚炼苗7d，然后取出幼苗，洗净附着的液体培养基，栽入椰糠：蛭石(2:1)混合基质的营养钵中，移栽成活率为96.2％，且无变异植株出现。

[0041] 对比例

[0042] 选取幼嫩茎段，剪掉其叶片后放入加有洗洁精的水中，用软毛刷清洗表面污垢，在流水中冲洗干净。在超净工作台上，用75％酒精消毒处理15s后，再用0.1％升汞处理10min，再用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分。

[0043] 在无菌条件下，将外植体切成长约1cm的茎段，平铺于MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/L TDZ+0.05mg/LNAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)培养基进行诱导培养，培养温度为20℃，光照条件为1800lx、光照时间为12h/d，培养周期为30d，平均诱导率为51.5％。

[0044] 将分化培养中获得的长约1cm的芽苗转入增殖培养基MS+0.3mg/L6-BA+0.05mg/L TDZ+0.01mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L(pH，5.8)，培养温度为20℃，光照条件为1800lx、光照时间为12h/d，培养周期为30d，增殖倍数为5.77。

[0045] 将单芽茎段接种到生根培养基：1/2MS+0.3mg/L IBA+0.1mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)，培养温度为20℃，光照条件为1800lx、光照时间为12h/d，培养周期为
30d，生根率为68.1％。

[0046] 将株高3～4cm、生长健壮、根系发达的无菌瓶苗从培养室移入温室大棚炼苗5d，然后取出幼苗，清洗附着的固体培养基，栽入椰糠：蛭石(2:1)混合基质的营养钵中，移栽成活率为70.1％。

[0047] 本发明提供了一种金铁锁的离体快繁方法，外植体诱导率达95％，增殖系数达20～25倍，生根率达90％以上，移栽成活率达95％以上，本发明方法能最大程度保持母株的优良性状，不仅操作简单，成本低廉，而且生根率高，根系发达，其组培苗移栽成活率高。

[0048] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。