一种芽孢杆菌复合制剂及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及微生物制剂领域，提供一种芽孢杆菌复合制剂，由蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌发酵含有甲壳素的培养基得到，所述蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387。在本发明所述的芽孢杆菌复合制剂中，壳聚糖与本发明筛选到的两株芽孢杆菌复配具有显著的协同增效作用，本发明提供的芽孢杆菌复合制剂应用于淡水鱼养殖后，其增重效果相对于对照组提高了20％以上。本发明提供的芽孢杆菌复合制剂能够有效控制淡水鱼病害并提高淡水鱼免疫机能、防治淡水鱼病害，促进机体生长，还能够降低水体重金属含量、减轻水体富营养化。

权利要求

1.一种芽孢杆菌复合制剂，所述芽孢杆菌复合制剂的制备方法包括：以蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌发酵含有胶质甲壳素的培养基60～80h，所得发酵液即为芽孢杆菌复合制剂；所述含有胶质甲壳素的培养基中胶质甲壳素的含量为18～25g/L；

所述蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387；

所述胶质甲壳素的制备方法为：将甲壳素粉碎，以粉碎后的甲壳素用质量体积分数为

10％的乙酸溶液浸泡48小时以上；浸泡完成后清洗所得固体为胶质甲壳素。

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌复合制剂，其特征在于，所述芽孢杆菌复合制剂中的有效活菌数为21×107～62×107个/mL。

3.权利要求1～2任意一项所述芽孢杆菌复合制剂的制备方法，包括以下步骤：以蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌发酵含有胶质甲壳素的培养基60～80h，所得发酵液即为芽孢杆菌复合制剂；所述含有胶质甲壳素的培养基中胶质甲壳素的含量为18～25g/L；

所述蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387；

所述胶质甲壳素的制备方法为：将甲壳素粉碎，以粉碎后的甲壳素用质量体积分数为

10％的乙酸溶液浸泡48小时以上；浸泡完成后清洗所得固体为胶质甲壳素。

4.根据权利要求3所述芽孢杆菌复合制剂的制备方法，其特征在于，所述含有胶质甲壳素的培养基包括蔗糖2.0～4.0g/L、蛋白胨2.0～4.0g/L、胶质甲壳素18～25g/L、磷酸二氢钾0.4～0.8g/L、磷酸氢二钾0.2～0.4g/L、氯化钠0.3～0.6g/L、硫酸亚铁0.05～0.08g/L和硫酸锰0.02-0.05g/L，所述培养基的pH值为6.2～6.8。

5.根据权利要求4所述芽孢杆菌复合制剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的接种量为4％～6％，所述蜡样芽孢杆菌的接种量为4％～6％。

6.根据权利要求4或5所述芽孢杆菌复合制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为28～35℃。

7.根据权利要求6所述芽孢杆菌复合制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵时伴随振荡，所述振荡的转速为180～260rpm。

8.权利要求1～2任意一项所述芽孢杆菌复合制剂或权利要求3～7任意一项所述制备方法制备获得的芽孢杆菌复合制剂在制备促进锦鲤生长的药物中的应用。

9.权利要求1～2任意一项所述芽孢杆菌复合制剂或权利要求3～7任意一项所述制备方法制备获得的芽孢杆菌复合制剂在制备防治由嗜水气单胞菌导致的淡水鱼病害的药物中的应用。

10.权利要求1～2任意一项所述芽孢杆菌复合制剂或权利要求3～7任意一项所述制备方法制备获得的芽孢杆菌复合制剂在降低水体中亚硝酸盐、氨态氮和磷含量中的应用。

说明书

一种芽孢杆菌复合制剂及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及一种芽孢杆菌复合制剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 淡水鱼养殖过程中，为了防治鱼类疾病、保证健康生长，使用了大量的抗生素和有机农药。但是，长期使用抗生素和有机农药会造成鱼类病原菌产生较强的抗药性，对于自然环境也会产生直接或间接的污染，抗生素和农药残留在鱼体内也会间接危害人体健康。因此，在淡水鱼养殖中还需要继续研发对环境和生态友好的新型微生物制剂。

发明内容

[0003] 本发明为了解决淡水鱼养殖中抗生素、农药滥用问题，提供了一种能够有效地促进淡水鱼生长、防治淡水鱼病害的芽孢杆菌复合制剂，所述芽孢杆菌复合制剂对环境和人体友好，能够部分替代抗生素。

[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

[0005] 本发明提供了一种芽孢杆菌复合制剂，包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲壳素和壳聚糖复合制剂，所述蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387。

[0006] 优选的，所述芽孢杆菌复合制剂中的有效活菌数为21×107～62×107个/mL。

[0007] 本发明提供了上述技术方案所述芽孢杆菌复合制剂的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 以蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌发酵含有甲壳素的培养基60～80h，发酵液为芽孢杆菌复合制剂；

[0009] 所述蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387。

[0010] 优选的，所述含有甲壳素的培养基包括蔗糖2.0～4.0g/L、蛋白胨2.0～4.0g/L、胶质甲壳素18～25g/L、磷酸二氢钾0.4～0.8g/L、磷酸氢二钾0.2～0.4g/L、氯化钠0.3～0.6g/L、硫酸亚铁0.05～0.08g/L和硫酸锰0.02～0.05g/L，所述培养基的pH值为6.2～6.8。

[0011] 优选的，所述枯草芽孢杆菌的接种量为4％～6％，所述蜡样芽孢杆菌的接种量为4％～6％。

[0012] 优选的，所述发酵的温度为28～35℃。

[0013] 优选的，所述发酵时伴随振荡，所述振荡的转速为180～260rpm。

[0014] 本发明还提供了前述技术方案所述芽孢杆菌复合制剂或上述技术方案所述制备方得到的芽孢杆菌复合制剂在促进淡水鱼生长、防治淡水鱼病害的药物中的应用。

[0015] 本发明还提供了前述技术方案所述芽孢杆菌复合制剂或上述技术方案所述制备方得到的芽孢杆菌复合制剂在治理富营养化水体中的应用。

[0016] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

[0017] 本发明提供了一种芽孢杆菌复合制剂，包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲壳素和壳聚糖，所述蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387。本发明提供的芽孢杆菌复合制剂中，总有效活菌数至少为20×107个/mL，pH值7.78～8.69。采用本发明提供的芽孢杆菌复合制剂作为淡水鱼养殖的添加剂，能够有效促进淡水鱼的生长，并能够防治淡水鱼病害，降低水体富营养化。

[0018] 在本发明提供的芽孢杆菌复合制剂中，采用的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌具有显著的分解甲壳素的能力，通过其分泌的几丁质酶和脱乙酰酶能够将甲壳素分解为壳聚糖。本发明中的芽孢杆菌降解甲壳素形成的复合制剂能够有效地防治淡水鱼病害并提高免疫机能，促进机体生长，相对于对照(仅投喂饲料组)提高至少20％的增重效果。

[0019] 本发明提供的芽孢杆菌复合制剂中不但含有芽孢杆菌及其分解的壳聚糖，还含有大量的几丁质酶、脱乙酰酶等酶以及培养基成分。在所述芽孢杆菌复合制剂使用后，其中所含的甲壳素可以继续被转化为壳聚糖，从而使壳聚糖较长时间地维持在一个较高浓度范围；同时，其中的芽孢杆菌也能够继续利用剩余的发酵培养基生长繁殖，维持有效活菌数量。即，本发明提供的芽孢杆菌复合制剂使用后持效时间长，作用较直接。

[0020] 生物保藏说明

[0021] 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2018年6月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学校内；生物保藏编号为CCTCC NO：M 2018386。

[0022] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2018年6月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学校内；生物保藏编号为CCTCC NO：M 2018387。

具体实施方式

[0023] 本发明提供了一种芽孢杆菌复合制剂，包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲壳素和壳聚糖，所述蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387。

[0024] 本发明从湖畔土壤中筛选出具有显著降解甲壳素作用的芽孢杆菌，将具有显著降解甲壳素作用的芽孢杆菌进行组合并发酵含有甲壳素的培养基，所得发酵液中含有被芽孢杆菌分解的壳聚糖以及复合芽孢杆菌。将发酵得到的复合制剂应用到淡水鱼养殖水体中，筛选其中对淡水鱼的生长有显著促进作用的组合。将筛选到的芽孢杆菌进行保藏，即本发明所述芽孢杆菌复合制剂中采用的蜡样芽孢杆菌(CCTCC NO：M 2018386)和枯草芽孢杆菌(CCTCC NO：M 2018387)。

[0025] 得到兼具降解甲壳素和促进淡水鱼生长的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌后，本发明进一步优化发酵条件，获得了含有甲壳素、壳聚糖、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵产物，即为本发明提供的芽孢杆菌复合制剂。

[0026] 在本发明所述芽孢杆菌复合制剂中，总有效活菌数为21×107～62×107个/mL，更优选为30×107～50×107个/mL。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌具有提高淡水鱼抗逆性、控制病害发生、改善水质、促进生长的作用。

[0027] 在本发明中，所述芽孢杆菌复合制剂中，壳聚糖的含量优选在6.0～12mg/mL以上，更优选为7.0～10.0mg/mL。在本发明中，所述壳聚糖具有抗菌、杀虫、增强免疫、吸附重金属以及净化水体的作用。

[0028] 在本发明中，所述芽孢杆菌复合制剂的剂型包括但不限于溶液剂、粉剂、乳油剂、颗粒剂或悬浮剂。将发酵得到的复合制剂按照本领域已知的剂型制备方法添加辅料制成相应剂型即可，本发明对此无特殊限定。

[0029] 在本发明所述的芽孢杆菌复合制剂中，甲壳素、壳聚糖与本发明筛选到的两株芽孢杆菌复配具有显著的协同增效作用，本发明提供的芽孢杆菌复合制剂应用于淡水鱼养殖后，其增重效果相对于对照组提高了20％以上。

[0030] 本发明提供的芽孢杆菌复合制剂能够有效控制淡水鱼病害并提高淡水鱼免疫机能，促进机体生长，还能够降低重金属含量、减轻水体富营养化。

[0031] 本发明提供的芽孢杆菌复合制剂属于生物制剂，无污染，对环境和人体无害，能够起到与淡水鱼养殖中抗生素和有机农药的作用，可部分替代抗生素，安全可靠。

[0032] 本发明还提供了一种上述技术方案所述芽孢杆菌复合制剂的制备方法，包括以下步骤：

[0033] 以蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌发酵含有甲壳素的培养基60～80h，发酵液即为芽孢杆菌复合制剂。

[0034] 在本发明中，所述含有甲壳素的培养基包括蔗糖、蛋白胨、胶质甲壳素、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰和水，pH6.2～6.8。优选的，以水为溶剂，所述含有甲壳素的培养基包括：蔗糖2.0～4.0g/L、蛋白胨2.0～4.0g/L、胶质甲壳素18～25g/L、磷酸二氢钾0.5～0.8g/L、磷酸氢二钾0.2～0.3g/L、氯化钠0.3～0.5g/L、硫酸亚铁0.05～0.06g/L和硫酸锰0.02～0.05g/L，调节pH值为6.4～6.6；最优选为蔗糖2.0g/L、蛋白胨
4.0g/L、胶质甲壳素20g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸亚铁0.06g/L和硫酸锰0.04g/L，调节pH值为6.5。

[0035] 本发明对于所述甲壳素的来源无特殊限定，制备所述胶质甲壳素时，按照以下方式进行：

[0036] 将甲壳素粉碎，粉碎后的甲壳素用质量体积分数10％的乙酸溶液浸泡48h以上；浸泡完成后清洗，即得胶质甲壳素。

[0037] 在本发明中所述甲壳素的粉碎粒径优选为40～60目。

[0038] 本发明将甲壳素制备为胶质甲壳素的目的是为了获得更优的溶解性。

[0039] 在本发明中，所述蜡样芽孢杆菌的接种量优选为4～6％，更优选为5％。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌的接种量优选为4-6％，更优选为6％。本发明优选的，所述蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的接种比例优选为1:0.8～1.2，更优选为1:1。

[0040] 在本发明中，所述发酵时间优选为28～35℃，更优选为30℃。在本发明中所述发酵时间优选为72h。在本发明中，所述发酵培养时优选的进行摇床振荡培养，所述摇床转速优选为180～260rpm，更优选为200rpm。

[0041] 本发明优选的，当含甲壳素的培养基中蔗糖与蛋白胨的质量比为2:4、且培养基pH为6.5、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的接种量分别为6％和5％时，本发明制备得到的芽孢杆菌复合制剂中几丁质酶和脱乙酰酶的总含量最高，进而其发酵效率最高。

[0042] 本发明还提供了前述技术方案所述的芽孢杆菌复合制剂在促进淡水鱼生长、防治淡水鱼病害中的应用。

[0043] 在本发明所述的应用中，优选的将含有前述技术方案所述的芽孢杆菌复合制剂混入淡水鱼养殖饲料中或投入水体中，以发挥其作用。

[0044] 本发明还提供了前述技术方案所述芽孢杆菌复合制剂在治理富营养化水体中的应用。

[0045] 在本发明所述的应用中，优选的将前述技术方案所述的芽孢杆菌复合制剂投入淡水鱼养殖水体中，以发挥其作用。更优选的，所述芽孢杆菌复合制剂的投加质量为水体体积的0.08～0.2％；最优选为0.1％。

[0046] 为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0047] 实施例1

[0048] 制备胶质甲壳素：将甲壳素粉碎至40目，用质量体积分数10％的乙酸溶液浸泡48h，水洗过滤后取固体，即得胶质甲壳素。

[0049] 配制含有甲壳素的培养基：蔗糖2.0g/L、蛋白胨2.0g/L、胶质甲壳素18g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、氯化钠0.3g/L、硫酸亚铁0.05g/L、硫酸锰0.02g/L和余量的水，调节pH值为6.2，灭菌，得到含有甲壳素的培养基。

[0050] 取55ml含有甲壳素的培养基置于150ml三角瓶中，按照4％接种量分别接种枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387，蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386。

[0051] 在180rpm、28～30℃条件下发酵培养72h，所得发酵液即为芽孢杆菌复合制剂。

[0052] 采用DNS方法和乙酸测定换算法对几丁质酶和脱乙酰酶活性进行测定，并检测芽孢杆菌复合制剂中的有效活菌数和壳聚糖含量。

[0053] 测定结果显示，制备得到的芽孢杆菌复合制剂中几丁质酶41.71U/ml、脱乙酰酶35.87U/ml、芽孢杆菌总活菌数25.51×107个/ml、壳聚糖6.0mg/ml，pH值8.24。

[0054] 实施例2

[0055] 本次试验对制备得到的芽孢杆菌复合制剂对于淡水鱼养殖的生长影响[0056] 1、材料准备：

[0057] 锦鲤：购于南昌市花鸟鱼市上，选择大小均匀、颜色差异小的锦鲤，每条体质量约为4-5g。

[0058] 饲料：三友创美公司生产的锦鲤专用饲料(粗蛋白≥32％，粗脂肪≥4％，总氨基酸≥8％，总磷0.5～2.0％)。

[0059] 2、试验对象：

[0060] 以实施例1制备得到的芽孢杆菌复合制剂作为试验组，以仅用专用饲料作为对照组。

[0061] 3、试验过程：

[0062] 将锦鲤随机放在10L塑料桶内进行饲养，每个塑料桶中放40条锦鲤，选取6个塑料桶，分为2组，每组3个。

[0063] 按照质量体积分数0.1％的比例向水体中投加芽孢杆菌复合制剂，作为试验组；仅用专用饲料饲喂作为对照组，每组3个重复。

[0064] 每日按照体重的3％饲喂锦鲤饲料，分为上下午2次饲喂。培养时用充气泵充气，使水体内的溶解氧保持在5mg/L以上。培养2个月后对各组的锦鲤称重，比较芽孢杆菌复合制剂对锦鲤生长的影响。

[0065] 测定培养结束后的水体中亚硝酸盐、氨态氮和总磷含量，测定方法参考国家渔业水质标准(GB/11607-89)。

[0066] 养殖试验结束后每个处理组选择20条锦鲤，用嗜水气单胞菌进行功毒试验。嗜水5
气单胞菌的使用浓度为3×10个/ml，每条注射0.1ml，采用腹腔注射方法，20d后记录锦鲤累积死亡率。

[0067] 4、试验结果

[0068] 表1不同处理对锦鲤生长的影响

[0069]

[0070] 由表1数据可以看出，与对照组相比，本发明提供的芽孢杆菌复合制剂对锦鲤增重明显，其增重比对照组高20.32％。

[0071] 表2不同处理对水质以及嗜水气单胞菌功毒处理的影响

[0072]

[0073]

[0074] 由表2数据可以看出，与对照组相比，本发明提供的芽孢杆菌复合制剂处理对水质具有明显改善，亚硝酸盐、氨态氮和总磷分别比对照组降低46.9％、37.5％和63.5％。

[0075] 对照组死亡率为80％，芽孢杆菌复合制剂处理组为30％，对嗜水气单胞菌保护率为62.5％。表明本发明提供的芽孢杆菌复合制剂能够有效提高淡水鱼养殖的抗性，提高淡水鱼的抗病性能，有效防治淡水鱼病害。

[0076] 实施例3

[0077] 制备胶质甲壳素：将甲壳素粉碎至50目，用质量体积分数10％的乙酸溶液浸泡48h，水洗过滤后取固体，即得胶质甲壳素。

[0078] 配制含有甲壳素的培养基：蔗糖2.0g/L、蛋白胨4.0g/L、胶质甲壳素20g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸亚铁0.06g/L、硫酸锰0.04g/L和余量的水，调节pH值为6.5，灭菌，得到含有甲壳素的培养基。

[0079] 取55ml含有甲壳素的培养基置于150ml三角瓶中，按照6％接种枯草芽孢杆菌，5％接种蜡样芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387，蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386。

[0080] 在200rpm、30～32℃条件下发酵培养72h，所得发酵液即为芽孢杆菌复合制剂。

[0081] 采用DNS方法和乙酸测定换算法对几丁质酶和脱乙酰酶活性进行测定，并检测芽孢杆菌复合制剂中的有效活菌数和壳聚糖含量。

[0082] 测定结果显示，制备得到的芽孢杆菌复合制剂中几丁质酶64.33U/ml、脱乙酰酶7
43.27U/ml、芽孢杆菌总活菌数50.0×10个/ml、壳聚糖10.0mg/ml，pH值8.55。

[0083] 实施例4

[0084] 制备胶质甲壳素：将甲壳素粉碎至40目，用质量体积分数10％的乙酸溶液浸泡48d，水洗过滤后取固体，即得胶质甲壳素。

[0085] 配制含有甲壳素的培养基：蔗糖2.0g/L、蛋白胨3.0g/L、胶质甲壳素25g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钠0.6g/L、硫酸亚铁0.08g/L、硫酸锰0.05g/L和余量的水，调节pH值为6.8，灭菌，得到含有甲壳素的培养基。

[0086] 取75ml含有甲壳素的培养基置于150ml三角瓶中，按照5％接种量分别接种枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387，蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386。

[0087] 在200rpm、29～30℃条件下发酵培养72h，所得发酵液即为芽孢杆菌复合制剂。

[0088] 采用DNS方法和乙酸测定换算法对几丁质酶和脱乙酰酶活性进行测定，并检测芽孢杆菌复合制剂中的有效活菌数和壳聚糖含量。

[0089] 测定结果显示，制备得到的芽孢杆菌复合制剂中几丁质酶40.88U/ml、脱乙酰酶41.74U/ml、芽孢杆菌总活菌数59.8×107个/ml、壳聚糖8.2mg/ml，pH值8.39。

[0090] 实施例5

[0091] 制备胶质甲壳素：将甲壳素粉碎至40目，用质量体积分数10％的乙酸溶液浸泡50h，水洗过滤后取固体，即得胶质甲壳素。

[0092] 配制含有甲壳素的培养基：蔗糖4.0g/L、蛋白胨2.0g/L、胶质甲壳素22g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钠0.4g/L、硫酸亚铁0.06g/L、硫酸锰0.04g/L和余量的水，调节pH值为6.8，灭菌，得到含有甲壳素的培养基。

[0093] 取75ml含有甲壳素的培养基置于150ml三角瓶中，按照6％接种量分别接种枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387，蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386。

[0094] 在200rpm、30～32℃条件下发酵培养72h，所得发酵液即为芽孢杆菌复合制剂。

[0095] 采用DNS方法和乙酸测定换算法对几丁质酶和脱乙酰酶活性进行测定，并检测芽孢杆菌复合制剂中的有效活菌数和壳聚糖含量。

[0096] 测定结果显示，制备得到的芽孢杆菌复合制剂中几丁质酶37.81U/ml、脱乙酰酶51.82U/ml、芽孢杆菌总活菌数45.14×107个/ml、壳聚糖8.2mg/ml，pH值7.96。

[0097] 实施例6

[0098] 制备胶质甲壳素：将甲壳素粉碎至50目，用质量体积分数10％的乙酸溶液浸泡50h，水洗过滤后取固体，即得胶质甲壳素。

[0099] 配制含有甲壳素的培养基：蔗糖2.0g/L、蛋白胨4.0g/L、胶质甲壳素25g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钠0.4g/L、硫酸亚铁0.5g/L、硫酸锰0.06g/L和余量的水，调节pH值为6.2，灭菌，得到含有甲壳素的培养基。

[0100] 取55ml含有甲壳素的培养基置于150ml三角瓶中，按照4％接种量分别接种枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387，蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386。

[0101] 在200rpm、28～29℃条件下发酵培养72h，所得发酵液即为芽孢杆菌复合制剂。

[0102] 采用DNS方法和乙酸测定换算法对几丁质酶和脱乙酰酶活性进行测定，并检测芽孢杆菌复合制剂中的有效活菌数和壳聚糖含量。

[0103] 测定结果显示，制备得到的芽孢杆菌复合制剂中几丁质酶49.51U/ml、脱乙酰酶33.58U/ml、芽孢杆菌总活菌数21.89×107个/ml、壳聚糖7.25mg/ml，pH值7.92。

[0104] 实施例7

[0105] 制备胶质甲壳素：将甲壳素粉碎至40目，用质量体积分数10％的乙酸溶液浸泡52h，水洗过滤后取固体，即得胶质甲壳素。

[0106] 配制含有甲壳素的培养基：蔗糖2.0g/L、蛋白胨4.0g/L、胶质甲壳素19g/L、磷酸二氢钾0.55g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸亚铁0.07g/L、硫酸锰0.03g/L和余量的水，调节pH值为6.5，灭菌，得到含有甲壳素的培养基。

[0107] 取75ml含有甲壳素的培养基置于150ml三角瓶中，按照4％接种枯草芽孢杆菌，6％接种蜡样芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018387，蜡样芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018386。

[0108] 在220rpm、30～32℃条件下发酵培养72h，所得发酵液即为芽孢杆菌复合制剂。

[0109] 采用DNS方法和乙酸测定换算法对几丁质酶和脱乙酰酶活性进行测定，并检测芽孢杆菌复合制剂中的有效活菌数和壳聚糖含量。

[0110] 测定结果显示，制备得到的芽孢杆菌复合制剂中几丁质酶41.71U/ml、脱乙酰酶35.87U/ml、芽孢杆菌总活菌数33.51×107个/ml、壳聚糖11.0mg/ml，pH值8.47。

[0111] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。