C22orf41作为胰腺癌肿瘤标记物的应用

摘要

本发明公开了一种胰腺癌相关的肿瘤标记物C22orf41，并证实了C22orf41基因在胰腺癌癌变的组织细胞中高表达。本发明还提供了用于检测C22orf41的表达水平的试剂盒在胰腺癌检测诊断或预后中的应用。本发明利用RNAi技术干扰C22orf41基因抑制胰腺癌细胞增殖，证实了C22orf41可作为靶向治疗的分子靶点，并提供了一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物和药物组合物。本发明胰腺癌相关肿瘤标记物C22orf41具有作为诊断检测、预后评估和治疗靶点的潜在价值，有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

权利要求

1.肿瘤标记物C22orf41在制备胰腺癌辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒中的应用。

2.肿瘤标记物C22orf41在制备抑制胰腺癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述药物包含C22orf41基因表达抑制剂，所述抑制剂选自以C22orf41蛋白或它的转录本为靶序列、且能够抑制其蛋白表达或基因转录的反义核酸；或能表达或形成所述反义核酸的构建物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为一种shRNA分子，其编码序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；和/或SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16中的一对或多对所示。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为一种shRNA分子，其编码序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

说明书

C22orf41作为胰腺癌肿瘤标记物的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及C22orf41作为胰腺癌肿瘤标记物的 应用。

背景技术

[0002] 胰腺癌是世界上最致命的癌症之一，5年生存率低于5％。造成胰腺癌预 后较差的原因主要是胰腺癌发病隐匿，诊断滞后，远处转移较早、局部侵袭 性强，缺乏有效治疗药物。目前，手术切除被认为是唯一确定有效的治疗方 法。由于胰腺癌发现时多伴有转移，手术根治在多数情况下已无法实现。到 目前为止，大约仅有20％的胰腺癌患者可以进行根治性切除，即使在这些患 者中，由于早期转移或复发其5年生存率依然很低。目前可用于诊断有症状 的胰腺癌的方法主要是影像学：电脑断层扫描(CT)，内窥镜超声(EUS)， 内镜下逆行胰胆管造影(ERCP)，但早期诊断仍十分困难。高敏感性和特异 性的胰腺癌无创诊断方法有望提高胰腺癌早期诊断率和预后生存率，提高手 术切除的可能性，降低胰腺癌死亡率。

发明内容

[0003] 为了实现胰腺癌的早期诊断，提高预后生存率，降低死亡率，本发明的 目的在于提供一种新的胰腺癌相关肿瘤标记物以及该肿瘤标记物的应用。所 述肿瘤标记物为C22orf41。C22orf41有望成为胰腺癌诊断和预后判断的标记 物，同时为胰腺癌的治疗提供新的靶点。

[0004] The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库包含了多种肿瘤类型多种层次 的数据信息，包括：miRNA、mRNA、蛋白质谱、突变谱、临床诊断信息等。 这些数据为肿瘤数据分析提供了丰富的资源。因此，本发明的发明人首先借 助TCGA数据库对C22orf41基因与胰腺癌的相关性进行分析。

[0005] 本发明的C22orf41基因是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：

[0006] Genbank登录号：C22orf41GeneID:644186，来源于人类基因组。

[0007] C22orf41(又称SYCE3，synaptonemal complex central elementprotein 3， 重组人联会丝复合体中心元蛋白3)，是一个蛋白编码基因。联会丝复合体 是减数分裂Ⅰ的偶线期中，配对的两条同源染色体之间形成的一种复合结构， SYCE3蛋白是启动同源染色体之间突触必不可少的，与染色体的配对，交换 和分离密切相关。

[0008] 本发明的发明人研究发现，C22orf41在胰腺癌样品中高表达，表达水平 与病人不良生存预后存在显著相关性，敲低C22orf41对于胰腺癌细胞生长有 明显的抑制作用，提示C22orf41在胰腺癌的发生发展过程中可能十分重要。 C22orf41可用于制备胰腺癌辅助诊断、疗效预测及预后判断制剂，还可以用 于制备辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒，甚至可作为新兴治疗靶点， 用于制备治疗胰腺癌的药物。

[0009] 所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒和免疫学检测试剂盒。实时 荧光定量PCR检测试剂盒所述特异性引物适用于SYBR Green的检测。另外， 试剂盒中还包括标准DNA模板和PCR反应体系，PCR反应体系中的PCR 反应液为实时荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光 定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green，Taq酶为热启动酶。免疫学检测试剂盒所用C22orf41抗体适用于免 疫组化检测。试剂盒包括标准切片阳性对照和免疫组化检测相关试剂。

[0010] 所述胰腺癌C22orf41检测诊断试剂盒用途包括：检测C22orf41基因在 受试者的测定细胞即胰腺癌细胞中的表达；将所述值与参考值相比较， C22orf41基因明显同时高于参考值，表明受试者患有胰腺癌。所述参考值水 平是C22orf41基因在正常细胞即正常人胰腺组织细胞中的表达水平，所述正 常细胞与测定细胞同一品系且无癌变。所述测定细胞已知或被怀疑包含肿瘤 细胞。

[0011] 为了验证发明的在靶向治疗上有效性，本发明通过以下方法验证：构建 RNAi慢病毒重组质粒，转染胰腺癌细胞BxPC-3敲低C22orf41基因表达， 并建立C22orf41过表达的胰腺癌细胞株，检测不同组细胞增殖情况。结果显 示C22orf41基因表达被敲除时细胞增殖明显被抑制。

[0012] 本发明证实了C22orf41基因在胰腺癌癌变的组织中高表达，可作为胰腺 癌检测指标以及靶向治疗的分子靶点。本发明为胰腺癌的辅助诊断提供了强 有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

[0013] 因此，本发明提供了一种肿瘤生物标记物C22orf41作为胰腺癌相关肿瘤 标记物的应用。所述肿瘤标记物C22orf41在胰腺癌中高表达。

[0014] 本发明还提供了所述的肿瘤标记物C22orf41在制备胰腺癌辅助诊断、疗 效预测及预后判断试剂盒中的应用。

[0015] 一种肿瘤生物标记物C22orf41检测试剂盒，包括特异性扩增 C22orf41mRNA的探针或引物，或者是特异性结合C22orf41的抗体。其采用 定量PCR、基因芯片或免疫学方法检测C22orf41基因的表达，所述特异性扩 增C22orf41mRNA的引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。所述试剂 盒还包括内参特异性引物，所述内参特异性引物是GAPDH RNA引物，上游 引物的序列如SEQ ID NO.3所示，GAPDH的下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。所述试剂盒还可以进一步包含抽提总RNA所用试剂，例如包含 Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、DEPC水所述试剂盒可以进一步包括实时荧 光定量SYBR染料。

[0016] 所述试剂盒还可以进一步包含将总RNA逆转录为cDNA所用试剂。总 RNA逆转录为cDNA所用试剂也选择市售的逆转录试剂  盒，例如promega逆转录试剂盒(GoScriptTMReverse Transcriptase，A5003)，包括:GoScriptTM5X Reaction Buffer、MgCl2、PCR Nucleotide  Mix、Recombinant Ribonuclease  Inhibitor、Go ScriptTMReverse Transcriptase、Nuclease-Free Water。

[0017] 所述试剂盒可以是通过免疫学方法进行定量检测的试剂盒，其通过检测 C22orf41的表达产物检测C22orf41的表达水平，其包括特异性结合C22orf41 的抗体。通过免疫学方法，例如免疫印迹法、免疫组化法和酶联免疫吸附测 定法中的至少一种检测C22orf41的表达水平，比如，通过免疫印迹法(Western Blot)进行检测的试剂盒，其中包含免疫印迹法(Western Blot)相关试剂。进一 步地还可以包含从细胞中抽提总蛋白所用试剂，例如包括RIPA裂解液、蛋 白酶抑制剂或者是特异性结合C22orf41的抗体。

[0018] 本发明还提供了肿瘤标记物C22orf41作为胰腺癌药物靶点的应用。

[0019] 本发明提供了一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物，所述药物包含C22orf41 基因表达抑制剂，所述抑制剂选自以C22orf41蛋白或它的转录本为靶序列、 且能够抑制其蛋白表达或基因转录的反义核酸；或能表达或形成所述反义核 酸的构建物。

[0020] 优选的，所述抑制剂为一种shRNA分子，其编码序列如SEQ ID NO.11 和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；和/或SEQ ID NO.15和 SEQ ID NO.16中的一对或多对所示。

[0021] 优选的，所述抑制剂为一种shRNA分子，其编码序列如SEQ ID NO.15 和SEQ ID NO.16所示。

[0022] 本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括C22orf41基因表 达抑制剂作为活性成分，和药学上可接受的载体。

[0023] 本发明的有益效果如下：

[0024] 本发明公开了一种胰腺癌相关肿瘤标记物C22orf41并证实了C22orf41 基因在胰腺癌癌变的组织细胞中高表达，可作为胰腺癌检测指标以及靶向治 疗的分子靶点。本发明为胰腺癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具， 胰腺癌相关肿瘤标记物C22orf41具有作为诊断检测、预后评估和治疗靶点的 潜在价值，有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

[0025] 图1为PCR验证C22orf41在胰腺癌组织中高表达；

[0026] 图2为PCR检测shRNA沉默C22orf41基因的情况；

[0027] 图3为C22orf41对细胞增殖的影响；a:增殖实验显示C22orf41敲低 (C22orf41-shRNA)可抑制细胞增殖；b：增殖实验显示C22orf41表达增高 后(C22orf41-plasmid)可促进细胞增殖。

具体实施方式

[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指 明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的 试剂可以商业购买得到。

[0029] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照 常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社， 2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

[0030] 实施例1基于TCGA数据库信息进行胰腺癌的生存分析筛选相关基因

[0031] 1、临床信息筛选

[0032] 检索TCGA数据库中的胰腺癌患者临床信息，截至2015年12月10日， TCGA数据库中总共记载了185例胰腺癌临床病例。对这些数据进行筛选， 共有160例患者纳入研究。筛选时排除具有其他恶性肿瘤病史、曾接受过放 疗或化疗的患者，同时纳入研究的患者需含临床信息和mRNA数据。

[0033] 2、生存期研究样本统计

[0034] 160例胰腺癌患者生存时间的统计结果如下表所示:

[0035] 表1 160例胰腺癌患者生存时间统计

[0036]

[0037] 3、mRNA表达数据生存分析研究方案

[0038] (1)对胰腺癌高通量mRNA转录组数据检索、数据下载及样本挑选和归 类。由下载的转录组数据通过生物信息学分析筛选得出与胰腺癌生存时间相 关的mRNA。

[0039] (2)用Cytoscape软件构建由mRNAs组成的生物信息网络，通过DAVID 对生物信息网络中与胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO分析和Pathway 分析。

[0040] 4、胰腺癌mRNA表达数据的生存分析结果

[0041] 将胰腺癌组织的转录组数据下载后，去除read count＝0小于20％的mRNA 后用做下一步分析，包括17100个mRNA。提取mRNA基因表达量和胰腺 癌TCGA数据库生存时间数据，采用survival包的coxph函数完成，经单因 素Cox回归分析，筛选得到单因素Cox回归中p值<0.05的mRNA有580个， 包括328个风险性mRNA和252个保护性mRNA。

[0042] 为了更好的研究与生存时间相关的mRNA的功能，我们通过GORILLA 和GeneCodis软件对胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO功能富集合 KEGG通路富集，筛选标准皆为FDR<0.05。其中基因C22orf41高表达组病 人生存率显著降低，生存率差异存在统计学意义(HR>
1为风险性mRNA)。

[0043] 实施例2 RT-PCR检测胰腺癌和癌旁组织中基因C22orf41的表达情况

[0044] 1、材料

[0045] 1.1组织病理标本

[0046] 收集经外科手术切除、并经病理学检查确诊的20例胰腺癌患者组织及对 应癌旁组织标本，癌旁组织定义为距肿瘤边缘3cm以外的胰腺组织。取样来 源于北京协和医院2014年10月到2016年12月期间确诊为胰腺癌并接受外 科手术切除的病人。手术切除胰腺癌组织后在病理科医生的指导下立即取胰 腺癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。

[0047] 1.2纳入标准如下：

[0048] (1)接受外科手术切除的病例；

[0049] (2)术后病理确诊为胰腺癌并有相应的癌旁组织，癌旁组织定义为距肿 瘤边缘3cm以外的胰腺组织。

[0050] (3)病人均未接受过术前新辅助治疗。

[0051] 2、试验方法

[0052] 2.1对组织样本进行RNA提取

[0053] 依据编号分别对胰腺癌组织及对应的癌旁组织进行RNA提取，每例病 人的胰腺癌组织和对应癌旁组织编为一组，胰腺癌组织作为实验样本，对应 的癌旁组织作为对照样本，20例病人编为20组。

[0054] 采用 Reagent(invitrogen，货号15596-018)对20组样本进行 RNA提取，实验操作按产品说明书进行，每组实验的具体操作如下：

[0055] 收集样本后冻存于液氮，取出后把组织样本放入已预冷的研钵中进行研 磨，待组织样本成粉末状后：

[0056] (1)加入1mLTrizol，室温保存5分钟；

[0057] (2)加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温放置5-10分钟；

[0058] (3)12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心 管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的 -20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

[0059] (4)12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol 的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃ 下12000rpm高速离心5分钟；

[0060] (5)弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC 处理过的水溶解沉淀；

[0061] (6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于 -80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间； 总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图 谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

[0062] 2.2RNA样品的质量分析

[0063] RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样 品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过 NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品 要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

[0064] 2.3逆转录合成cDNA

[0065] 采用 III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044) 进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

[0066] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成 cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获 得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

[0067] 2.4 Real-Time PCR

[0068] (1)引物设计用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用 法进行数据 相对定量分析。

[0069] 采用在线引物设计软件，基因序列参照NM_001123225.2，内参选 GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如表2所示：

[0070] 表2引物序列

[0071]

[0072] (2)反应体系：用 Green PCR MasterMix(invitrogen，货 号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃预 变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循 环。

[0073] (3)样本RealTime-PCR检测

[0074] 以SYBR Green作为荧光标记物，在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进 行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，采用 法进行数 据的相对定量分析。

[0075] 3、数据处理及实验结果

[0076] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应 管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增 效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特 异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较基因在胰腺 癌组织和癌旁组织中的表达水平。

[0077] 采用统计学软件SPSS 17.0，统计学显著性差异定义为P＜0.05。应用 Mann–Whitney U检验比较基因在胰腺癌组织与癌旁正常胰腺组织中表达的 差异。在胰腺癌组织中的总体表达水平均高于癌旁组织(如图1所示)，p＜ 0.001，提示可能具有很好的胰腺癌辅助诊断价值。

[0078] 实施例3沉默C22orf41表达对胰腺癌细胞增殖的影响

[0079] 1、shRNA序列的设计

[0080] 针对目的基因靶基因序列，利用Pubmed网站中提供的RNA干扰序列设 计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，根据相关设计经验和设计软件进行 评估测定，3个RNA干扰靶点序列的siRNA，同时选用RNAi设计时公认的 scramble序列作为对照，序列见表3：scramble序列如SEQ ID NO.5所示， 干扰1的靶点序列如SEQ ID NO.6所示，干扰2的靶点序列如SEQ ID NO.7 所示，干扰3的靶点序列如SEQ ID NO.8所示。根据pLKO.1-TRC克隆载体 特性，将siRNA的DNA序列与其相应的互补序列以loop序列连接形成正义 链和反义链，并在两端引入接头序列，通过退火形成shRNA，具体序列如表 4所示。序列由上海吉满生物科技有限公司合成。 表3 siRNA序列

[0081] 名称 NO. 靶点序列NC SEQ ID NO.5 TTCTCCGAACGTGTCACGT
干扰1 SEQ ID NO.6 GACTTGGAAAAGCTATTAGAAGA
干扰2 SEQ ID NO.7 TAGAAGAGATGGAGAAAATCTCA
干扰3 SEQ ID NO.8 CACTGTACTTGTTTCTTAATAAA

[0082] 表4 shRNA序列

[0083]

[0084] 2、RNAi慢病毒重组质粒的构建

[0085] 应用BamHI和EcoRI双酶酶切pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体，于37℃ 酶切0.5-1h，酶切产物琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化载体，回收载体的 目的片段电泳检测。回收载体与退火形成的shRNA序列25℃水浴中孵育30 min进行连接，连接产物转化DH5α感受态细菌，挑选阳性克隆菌，摇菌后 菌液测序鉴定。

[0086] 3、干扰质粒转染胰腺癌BxPC-3细胞

[0087] 先将BxPC-3细胞(人胰腺癌细胞BxPC-3购自国家实验细胞资源共享服 务平台)置于12孔细胞培养板中培养，转染前24h以合适的细胞密度接种到 6cm培养皿中，待细胞达到90％的融合度时再进行转染；以未经转染的胰腺 癌细胞BxPC-3对嘌呤毒素最佳用药浓度进行筛选，将胰腺癌细胞接种于24 孔板，待次日细胞密度达50％～70％时，更换培养基并加入浓度分别为 0.5μg/ml，1μg/ml，1.5μg/ml，2μg/ml，2.5μg/ml，3μg/ml的嘌呤毒素开始筛 选，以10～14天内细胞全部死亡的最低浓度定为最佳筛选浓度。筛选结果确 定BxPC-3最佳用药浓度为2μg/ml。

[0088] 将测序结果显示构建成功的阳性克隆菌，大量摇菌按质粒提取试剂盒进 行质粒中量提取，将提取的质粒取8μg溶于500μl opti-MEM减血清培养基中， 另取20μl脂质体(lipofectimane2000)溶于500μl opti-MEM减血清培养基中， 将质粒混合液加入脂质体混合液中充分混匀，室温下置20min；吸弃转染前 更换的无血清培养基，将质粒与脂质体混合液滴加到每个孔中，37℃5％CO2培养箱中继续培养6h，更换含有嘌呤毒素(浓度为2μg/ml)的完全培养基继 续培养至48h，荧光显微镜下观察转染水平。

[0089] 4、应用ReaL-time PCR方法检测转染前后胰腺癌细胞BxPC-3中 C22orf41的转录水平

[0090] 利用RNA小量抽提试剂盒(AXYGEN)提取转染前和转染后的胰 腺癌BxPC-3细胞总RNA，获得的RNA经ReverTraAce qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反转录为cDNA，2倍稀释后，分别加入C22orf41引物 和内参基因GAPDH的引物，采用SYBR Green I荧光定量PCR(ABI 7300) 扩增基因C22orf41，每个样品做3个重复。结果显示转染的3个 C22orf41-shRNA组对胰腺癌细胞中C22orf41表达均起到一定抑制作用， C22orf41-shRNA1抑制率为45％，C22orf41-shRNA2抑制率为58％， C22orf41-shRNA3抑制效果最明显，抑制率达76％。

[0091] 5、C22orf41对胰腺癌细胞增殖的影响

[0092] 使用C22orf41-shRNA3干预胰腺癌细胞BxPC-3建立C22orf41敲低表达 的C22orf41-shRNA细胞株，对照实验组为正常组(未做转染的BxPC-3细胞 株)和空转等量慢病毒颗粒的Control组；同时通过合成C22orf41质粒接慢 病毒转染BxPC-3细胞(方法参照《袁月.TRADD基因过表达慢病毒的构建 及其对增生性瘢痕成纤维细胞选择性抑制的实验研究[D].第三军医大学, 2012.》)，建立C22orf41过表达的C22orf41-plasmid细胞株，对照实验组为 正常组(未做转染的BxPC-3细胞株)和空转等量接有空质粒的慢病毒颗粒 的Vector组；经CCK-8法检测细胞增殖率，分别使用酶标仪(Bio-Rad，美国) 检测在接种24h、48h、72h和96h时OD450nm的吸光度，各时间点检测之 前，每孔加入10ul CCK-8试剂(Beyotime，产品编号C0038)，放回细胞培 养箱中继续孵育2小时。结果表明，胰腺癌细胞BxPC-3敲低C22ofr41后可 显著抑制胰腺癌的增殖，如图3所示。

[0093] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员 而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或 改进，均属于本发明要求保护的范围。