一种富氧温敏型水凝胶及其制备方法

摘要

本发明公开了一种富氧温敏型水凝胶及其制备方法，其由CS酸溶液、β‑GP溶液、HEC溶液和潘氟隆乳液混合而成；所述水凝胶中潘氟隆含量为5.0vol%～15.0vol%。本富氧温敏型水凝胶无毒副作用，具有良好的理化性质、释氧性能及微观结构，组织相容性好，可被完全代谢清除，能够促进骨缺损愈合，适合被当作氧气的缓释载体用于骨组织工程领域。本富氧温敏型水凝胶具有CS的基本生物特性，已通过实验证明具有良好的组织相容性和降解性，对周围组织无明显刺激及毒副作用，可被逐渐完全代谢清除；这一降解过程可以为新生骨组织提供生长空间，有利于骨质愈合。

权利要求

1.一种富氧温敏型水凝胶，其特征在于：其由CS酸溶液、β-GP溶液、HEC溶液和潘氟隆乳液混合而成；所述水凝胶中潘氟隆含量为5.0vol%～15.0vol%。

2.根据权利要求1所述的一种富氧温敏型水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中各成分的含量为：CS0.0 10 ～0.015g/ml、β-GP0.015～0.020g/ml、HEC 0.003～0.007g/ml。

3.一种富氧温敏型水凝胶的制备方法，采用权利要求1所述的成分配比，其特征在于：取CS酸溶液、β-GP溶液、HEC溶液和潘氟隆乳液混合，在冰浴条件下充分混合，即可得到水凝胶胶液。

4.根据权利要求3所述的一种富氧温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于：所述CS酸溶液由CS粉末与盐酸溶液或醋酸溶液配制而成，所述CS酸溶液中CS含量为0.010～0.050g/ml。

5.根据权利要求3所述的一种富氧温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于：所述β-GP溶液由β-GP粉末和水配制而成，β-GP含量为0.10～0.25g/ml。

6.根据权利要求3所述的一种富氧温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于：所述HEC溶液由HEC粉末和水配制而成，HEC含量为0.01～0.06g/ml。

7.根据权利要求3－6任意一项所述的一种富氧温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述潘氟隆乳液的配置过程为：将蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液或PBS盐缓冲液中，混合后乳化，得到基础乳液；在基础乳液中加入潘氟隆原液，混合后乳化，得到乳化液；

乳化液在高压氧环境下充氧，即可得到所述的潘氟隆乳液。

8.根据权利要求7所述的一种富氧温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述潘氟隆乳液中潘氟隆含量为10vol%～45vol%。

9.根据权利要求7所述的一种富氧温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述蛋黄卵磷脂80～110mg加入到550～900μL的Tyrode盐缓冲液或PBS盐缓冲液之中。

10.根据权利要求7所述的一种富氧温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述乳化均采用超声乳化。

说明书

一种富氧温敏型水凝胶及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种富氧骨填充材料，尤其是一种富氧温敏型水凝胶及其制备方法。

背景技术

[0002] 高能性创伤所致的骨损伤已成为创伤领域的主要病种之一。如何高效的修复并重建此类损伤所导致的骨缺损、骨不连甚至骨坏死已成为目前骨科研究的重点课题。开展应用骨组织工程学原理修复此类损伤的研究成为骨缺损修复研究领域的新希望。骨组织损伤后，由于损伤部位的血流中断或血肿形成，造成局部氧分压降低。有研究表明：骨折血流中断后，中央部位氧分压甚至降低到0%～2%。而缺氧可导致骨的代谢异常，骨髓微环境缺氧对骨形成和骨吸收之间的动态平衡有很大的影响。因此，通过研究构建一种富氧材料，并将其与骨组织工程材料相复合用于修复骨缺损，能改善组织工程骨移植后内部早期缺氧环境，提高干细胞（种子细胞）的成活及活性，从而促进骨的再生与愈合。

[0003] 氧是维持生命必不可少的物质。人体正常组织和组织间隙中的氧分压为24～66mmHg(1mmHg=0.133kPa)，即3％～9％(体积分数)。而目前细胞体外培养环境的氧分压通常为159mmHg，即氧的体积分数约为21％。Papandreou等认为外界氧供和细胞的氧需应该维持平衡，从而保证细胞的良好生长环境。骨组织损伤后，由于损伤部位的血流中断或血肿形成，造成局部氧分压降低。有研究表明：骨折血流中断后，中央部位氧分压甚至降低到0%～
2%。而缺氧可导致骨的代谢异常，骨髓微环境缺氧对骨形成和骨吸收之间的动态平衡有很大的影响。因此，维持骨组织损伤后的氧稳态，使损伤局部的氧浓度在特定的范围内波动，对于促进骨再生和愈合至关重要，其中及时有效的复氧已经被认为是关键的一步。

[0004] 另外，目前当接种有细胞的组织工程骨移植入体内时，早期细胞的氧供状态，往往劣于体外培养环境。而且越是位于支架内部中心位置的细胞，越是难以得到充足的氧供。而当细胞处于缺氧状态时，它们的粘附、增殖、活性以及功能状态将大打折扣，甚者会发生凋亡或坏死。这不仅会严重影响种子细胞修复功能的发挥，而且细胞坏死所产生的产物将会进一步阻碍缺损的修复。因此，构建一种富氧材料，并将其与组织工程骨复合，会改善组织工程支架内部早期低氧环境，促进移植的种子细胞的存活，从而提高功能化组织工程支架的修复能力。目前在富氧骨填充材料方面还未见相关报道。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种修复效果好的富氧温敏型水凝胶；本发明还提供了一种富氧温敏型水凝胶的制备方法。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：其由CS酸溶液、β-GP溶液、HEC溶液和潘氟隆乳液混合而成；所述水凝胶中潘氟隆含量为5.0vol%～15.0vol%。

[0007] 本发明所述水凝胶中各成分的含量为：CS0.010 ～0.015g/ml、β-GP0.015～0.020g/ml、HEC 0.003～0.007g/ml。

[0008] 本发明方法采用上述的成分配比，其方法工艺为：取CS酸溶液、β-GP溶液、HEC溶液和潘氟隆乳液混合，在冰浴条件下充分混合，即可得到所述的水凝胶胶液。

[0009] 本发明方法所述CS酸溶液由CS粉末与盐酸溶液或醋酸溶液配制而成，所述CS酸溶液中CS含量为0.010～0.050g/ml。

[0010] 本发明方法所述β-GP溶液由β-GP粉末和水配制而成，β-GP含量为0.10～0.25g/ml。

[0011] 本发明方法所述HEC溶液由HEC粉末和水配制而成，HEC含量为0.01～0.06g/ml。

[0012] 本发明方法所述潘氟隆乳液的配置过程为：将蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液或PBS盐缓冲液中，混合后乳化，得到基础乳液；在基础乳液中加入潘氟隆原液，混合后乳化，得到乳化液；乳化液在高压氧环境下充氧，即可得到所述的潘氟隆乳液。所述潘氟隆乳液中潘氟隆含量为10vol%～45vol%。所述蛋黄卵磷脂80～110mg加入到550～900μL的Tyrode盐缓冲液或PBS盐缓冲液之中。所述乳化均采用超声乳化。

[0013] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明无毒副作用，具有良好的理化性质、释氧性能及微观结构，组织相容性好，可被完全代谢清除，能够促进骨缺损愈合，适合被当作氧气的缓释载体用于骨组织工程领域。本发明具有CS的基本生物特性，已通过实验证明具有良好的组织相容性和降解性，对周围组织无明显刺激及毒副作用，可被逐渐完全代谢清除；这一降解过程可以为新生骨组织提供生长空间，有利于骨质愈合。

附图说明

[0014] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0015] 图1是本发明5%和10%潘氟隆浓度富氧温敏型水凝胶的放氧率曲线图；

[0016] 图2和图3是本发明富氧温敏型水凝胶冻干后断面的电镜扫描图；

[0017] 图4是富氧温敏型水凝胶包埋于兔大腿肌肉中2周时组织的电镜扫描图；

[0018] 图5是富氧温敏型水凝胶包埋于兔大腿肌肉中4周时组织的电镜扫描图；

[0019] 图6是富氧温敏型水凝胶包埋于兔大腿肌肉中6周时组织的电镜扫描图；

[0020] 图7是富氧温敏型水凝胶包埋于兔大腿肌肉中8周时组织的电镜扫描图；

[0021] 图8是修复兔股骨髁骨缺损实验第4周时实验组的X线检查图；

[0022] 图9是修复兔股骨髁骨缺损实验第4周时对照组的X线检查图；

[0023] 图10是修复兔股骨髁骨缺损实验第4周时空白组的X线检查图；

[0024] 图11是修复兔股骨髁骨缺损实验第12周时实验组的X线检查图；

[0025] 图12是修复兔股骨髁骨缺损实验第12周时对照组的X线检查图；

[0026] 图13是修复兔股骨髁骨缺损实验第12周时空白组的X线检查图；

[0027] 图14是修复兔股骨髁骨缺损实验第4周时三维Micro-CT图；

[0028] 图15是修复兔股骨髁骨缺损实验第4周时伪彩Micro-CT图；

[0029] 图16是修复兔股骨髁骨缺损实验第4周时二维Micro-CT图；

[0030] 图17是修复兔股骨髁骨缺损实验第6周时三维Micro-CT图；

[0031] 图18是修复兔股骨髁骨缺损实验第6周时伪彩Micro-CT图；

[0032] 图19是修复兔股骨髁骨缺损实验第6周时二维Micro-CT图；

[0033] 图20是修复兔股骨髁骨缺损实验第8周时三维Micro-CT图；

[0034] 图21是修复兔股骨髁骨缺损实验第8周时伪彩Micro-CT图；

[0035] 图22是修复兔股骨髁骨缺损实验第8周时二维Micro-CT图；

[0036] 图23是修复兔股骨髁骨缺损实验第12周时三维Micro-CT图；

[0037] 图24是修复兔股骨髁骨缺损实验第12周时伪彩Micro-CT图；

[0038] 图25是修复兔股骨髁骨缺损实验第12周时二维Micro-CT图；

[0039] 图26是修复兔股骨髁骨缺损实验Micro-CT数据分析TMD图；

[0040] 图27是修复兔股骨髁骨缺损实验Micro-CT数据分析BVF图；

[0041] 图28是修复兔股骨髁骨缺损实验Micro-CT数据分析Tb.N图；

[0042] 图29是修复兔股骨髁骨缺损实验Micro-CT数据分析Tb.Th图；

[0043] 图30是修复兔股骨髁骨缺损实验Micro-CT数据分析SMI图；

[0044] 图31是修复兔股骨髁骨缺损实验4周时实验组的组织形态图；

[0045] 图32是修复兔股骨髁骨缺损实验4周时对照组的组织形态图；

[0046] 图33是修复兔股骨髁骨缺损实验4周时空白组的组织形态图；

[0047] 图34是修复兔股骨髁骨缺损实验4周时CD31免疫组化图片；

[0048] 图35是修复兔股骨髁骨缺损实验6周时实验组的组织形态图；

[0049] 图36是修复兔股骨髁骨缺损实验6周时对照组的组织形态图；

[0050] 图37是修复兔股骨髁骨缺损实验6周时空白组的组织形态图；

[0051] 图38是修复兔股骨髁骨缺损实验6周时CD31免疫组化图片；

[0052] 图39是修复兔股骨髁骨缺损实验8周时实验组的组织形态图；

[0053] 图40是修复兔股骨髁骨缺损实验8周时对照组的组织形态图；

[0054] 图41是修复兔股骨髁骨缺损实验8周时空白组的组织形态图；

[0055] 图42是修复兔股骨髁骨缺损实验8周时CD31免疫组化图片；

[0056] 图43是修复兔股骨髁骨缺损实验12周时实验组的组织形态图；

[0057] 图44是修复兔股骨髁骨缺损实验12周时对照组的组织形态图；

[0058] 图45是修复兔股骨髁骨缺损实验12周时空白组的组织形态图；

[0059] 图46是修复兔股骨髁骨缺损实验12周时CD31免疫组化图片；

[0060] 图47为是修复兔股骨髁骨缺损实验CD31免疫组化微血管计数统计图。

具体实施方式

[0061] 本富氧温敏型水凝胶由壳聚糖（CS）溶液、β-甘油磷酸钠（β-GP）溶液、羟乙基纤维素（HEC）溶液和潘氟隆乳液混合而成；每毫升水凝胶中各成分的含量为：CS0.010～0.015g、β-GP0.015～0.020g、HEC 0.003～0.007g、0.050～0.150ml。

[0062] 本富氧温敏型水凝胶的治病机理、成分作用如下所述：水凝胶是由亲水性的聚合物通过物理缠绕或某些化学键的作用而形成的三维多孔网状立体交联结构，不在水中溶解但能够吸收大量水分而溶胀形成固体的“胶冻”形态。由于其吸水、保水的特点使其含水量超过95%，与人体组织相似，表面柔软、湿润，与组织相容性良好，对机体刺激性小，而且水凝胶作为载体易与其它物质相复合，这些优点使其在组织工程、载体药物缓释等医药领域的应用前景非常广阔。胶原、明胶、透明质酸、CS等许多高分子天然化合物都可以被当作制备水凝胶的原料，其中以CS为原料制备水凝胶应用最为广泛。

[0063] CS是甲壳素脱去N-乙酰基的产物，分子中主要的重复单元为“葡萄糖胺”，是哺乳动物组织的天然成分，其含量与脱乙酰的程度成正比。以CS为主要原料制备的水凝胶其生物相容性良好，无毒副作用，在机体内可逐步代谢清除。人血清中所含的溶菌酶可降解CS并使其分解为对人体无害的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，且乙酰氨基葡萄糖是产生ATP的三羧酸循环的中间产物，有利于提高细胞活性，促进细胞生长。CS的脱乙酰度十分重要，本水凝胶选择的是高脱乙酰的CS，脱乙酰度较高时（≥90%），CS的降解速度慢，其在体内引起的急性炎症反应也较轻，脱乙酰度低时（<80%）其降解速度快，在体内短时间内产生大量低分子量物质而引起急性炎症反应。脱乙酰度还可以影响CS基支架材料的细胞黏附性及所黏附细胞的活性。此外，由于CS本身溶解性很低，当脱乙酰度增加时，其分子链的-NH2数量增加，在盐酸溶剂中-NH+与H+发生质子化作用，CS的溶解性会大幅增加。CS本身还具有生物活性，能促进细胞的黏附、增殖、分化，其单体能够诱导丝裂原活化碱性磷酸酶（ALP）和蛋白激酶（PK）基因等4个信号转导基因的表达且低浓度CS单体还可以直接提高成骨细胞信号转导mRNA的水平，调节细胞活性。CS本身还具有抑菌、杀菌、止血作用，其杀菌原理是由细菌表面带负电荷的结构与CS的正电荷分子相结合，破坏细菌细胞壁，抑制基础呼吸功能从而导致细菌死亡。此外，CS还可提高免疫细胞活性，其脱乙酰度越高，补体的激活效应就越强。由于红细胞表面的神经氨酸残基带负电荷，可与CS的正电荷分子链相互作用，介导红细胞的聚集，故而CS可促进血液凝固使损伤部位快速止血。CS为主要成分的水凝胶能够促进伤口愈合，加速肉芽组织生长。其上述肌肉包埋实验结果中，免疫细胞增殖，肌肉组织修复迅速，无明显出血、感染，凝胶完全被代谢清除等现象可能与CS的这些特性有关。

[0064] 多数骨替代材料填补形状不规则的骨缺损时常留有死腔，实际操作时受到限制，为解决此问题，用高脱乙酰度的CS和β-GP混合，制备得到的温敏型水凝胶能够在成胶之前以液态形式充分填充于需修复的缺损处，在体温37℃的环境中逐渐凝胶化。对于这种温度敏感型水凝胶的凝胶原理，研究者至今仍未得出确切的结论。有研究者认为是由于加入了β-GP后，当温度上升时β-GP与CS分子间产生的分子力升高使得凝胶液中疏水作用加强从而形成固体凝胶。但还有学者认为，当温度升高时两者间的分子作用力反而减弱，是由于CS与β-GP中的阳离子胺基基团和带负电荷的磷酸盐离子发生质子转换，才引起凝胶化。CS-β-GP水凝胶的成胶时间和温度随着pH值的增大而缩小，pH过小则成胶时间和成胶温度会增加甚至不能成胶。所以为中和溶解CS的HCl溶液，呈碱性的β-GP必须达到一定浓度才能使CS-β-GP混合溶液在人体体温转变成胶，为了进一步减少成胶时间必须增加β-GP用量，但是β-GP浓度过高时会使凝胶呈强碱性，偏离人体正常酸碱度，此外高浓度的β-GP还会对细胞产生毒副作用，例如β-GP浓度达到800mg/ml时其渗透压高达1080mOsm，远高于人体生理渗透压，从而破坏细胞正常结构。因此，在此基础上加入易溶于水且无毒无害的交联剂HEC可使37℃时中性胶液的凝胶化过程明显缩短，从而大幅降低β-GP用量。HEC可促进成胶过程可能是由于HEC的羟基和CS、β-GP上的氨基及羟基产生氢键作用，另外HEC大分子链还可与CS分子形成物理缠结，这两种原因使CS-β-GP-HEC胶液在37℃环境中成胶时间明显缩短。

[0065] 潘氟隆（1-溴十七氟辛烷）是一种全氟碳化合物，此类化合物为一种惰性物质，因其结构相似而具有共同的理化特性，其化学结构稳定，无毒、无色、无味、有较低的脂溶性，不溶于水。更重要的是它是良好的氧气运输介质，对氧气的溶解度为水的20倍，是全血的2～3倍。作为最新一代“人工血液”的主要成分其携氧性和临床安全性已得到证实。

[0066] 富氧凝胶缓释的氧气能够在损伤早期能够改善骨损伤部位修复初期的内环境的缺氧状态，并促进种子细胞的成活及成骨活性的提高，从而起到促进骨再生和提高骨修复能力的效果。还可避免骨缺损区域在修复早期形成过度缺氧的环境，使周围残存的“修复细胞”不至于因过度缺氧而失去活性甚至死亡。

[0067] 组织工程支架的多孔结构能够促进组织生长，有利于细胞的黏附及血管长入。经扫描电镜观察，本富氧温敏型水凝胶呈三维多孔网状的微观结构，孔径约为100～200μm，孔隙致密，有利于气体分子释放、扩散至周围组织，也有利于周围体液及活性物质的交换、代谢废物的排出。支架材料所携带的氧气只能在早期缓解缺氧环境，在后期当细胞或新生组织长入支架后只能通过周围新生毛细血管的扩散作用获得氧气，所以支架材料的血管化非常重要，三维多孔网状结构可使新生血管通过孔道顺利长入支架内部，促进支架材料的血管化。本富氧温敏型水凝胶具有CS的基本生物特性，已通过实验证明具有良好的组织相容性和降解性，对周围组织无明显刺激及毒副作用，可被逐渐完全代谢清除。这一降解过程可以为新生骨组织提供生长空间，有利于骨质愈合。

[0068] 本富氧温敏型水凝胶的制备方法如下所述：（1）配制壳聚糖（CS）酸溶液：按CS含量为0.01～0.05g/ml称取CS粉末、和盐酸溶液或醋酸溶液，盐酸溶液或醋酸溶液浓度为0.05～0.15mol/L；混合后在室温环境下以800～1500r/min速度持续搅拌2～5h，直至CS溶液近乎清澈，4℃及以下冷藏隔夜，再以直径为0.5～1.2μm滤膜过滤杂质，最终得到CS溶液，再用牛皮纸封装置于100～150℃高压锅中灭菌5～15min，4℃及以下冷藏备用。

[0069] （2）配制β-甘油磷酸钠（β-GP）溶液：按β-GP含量为0.10～0.25g/ml称取β-GP粉末和水；混合后在室温环境下以800～1500r/min搅拌10～20min至澄清，0.15～0.22μm滤膜过滤除菌，4℃及以下冷藏保存备用。

[0070] （3）配制羟乙基纤维素（HEC）溶液：按HEC含量为0.01～0.06g/ml称取HEC粉末和水；混合后在室温环境下以800～1500r/min搅拌0.5～2h，用0.15～0.22μm滤膜过滤除菌，4℃及以下冷藏保存备用。

[0071] （4）配制潘氟隆乳液：按蛋黄卵磷脂80～110mg、Tyrode盐缓冲液或PBS盐缓冲液550～900μL的配比，将蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液或PBS盐缓冲液中，在200～500w功率下超声乳化至少两次，每次间隔1～2min，每次10～20s，得到基础乳液。按潘氟隆含量为10vol%～45vol%称取，然后将基础乳液与潘氟隆原液混合，在200～500w功率下超声乳化至少10次，每次间隔1～2min，每次10～20s；即可得到所述的潘氟隆乳液。将上述潘氟隆乳液用0.5～0.8μm滤膜除菌后置于高压氧舱内充氧至少10min，4℃及以下密闭封存备用。

[0072] （5）配制水凝胶：取CS溶液、β-GP溶液、HEC溶液和潘氟隆乳液，按下述成分含量：CS 0.010～0.015g/ml、β-GP0.015～0.020g/ml、HEC 0.003～0.007g/ml、潘氟隆5.0vol%～
15.0vol%，称取混合。混合后密封，冰浴环境下，用振动仪充分混合，即可得到所述的富氧温敏型水凝胶胶液，在37度环境下数分钟后成胶。所得水凝胶胶液分装到若干个冻存管中，4℃及以下密闭保存。

[0073] 实施例1：本富氧温敏型水凝胶的制备方法采用下述具体工艺。

[0074] （1）配置CS酸溶液：称取0.75g的CS粉末，量取25ml浓度为0.1mol/L的盐酸溶液于烧杯中；CS粉末与盐酸溶液混合，在室温环境下用磁力搅拌器以1000r/min速度持续搅拌3h，直至CS溶液近乎清澈。4℃冷藏隔夜，再以直径为1.2μm滤膜过滤杂质，最终得到0.03g/ml的CS酸溶液，再用牛皮纸封装置于120℃高压锅中灭菌10min，4℃冷藏备用。

[0075] （2）配制β-GP溶液：称取1.725g 的β-GP粉末；量取10ml去离子水于烧杯中，加入β-GP粉末；在室温环境下，用磁力搅拌器以1000r/min搅拌15min至澄清，0.22μm滤膜过滤除菌，得到0.1725g/ml的β-GP溶液，4℃冷藏保存备用。

[0076] （3）配制HEC溶液：称取0.375g的HEC粉末；量取10ml去离子水于烧杯中，加入HEC粉末；在室温环境下，用磁力搅拌器以1000r/min搅拌1h，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到0.0375g/ml的HEC溶液，4℃冷藏保存备用。

[0077] （4）配制潘氟隆乳液：首先，将95mg的蛋黄卵磷脂加入850μL的Tyrode盐缓冲液，于300w功率下，超声乳化两次，两次间隔1min，每次15s，得到基础乳液。然后将其与150μL潘氟隆原液混合，同上法乳化10次得到1ml的15vol%的潘氟隆乳液。因每次超声乳化液体量有限，以上操作需重复多次以制备适量潘氟隆乳液。将上述潘氟隆乳液用0.8μm滤膜除菌后置于高压氧舱内充氧10min，4℃密闭封存备用。

[0078] （5）配制富氧温敏型水凝胶：取8ml、0.03g/ml的CS溶液与2ml、0.1725g/ml的β-GP溶液，2.5ml、0.0375g/ml的HEC溶液，6.25ml、15vol%的潘氟隆乳液混合密封，冰浴环境下，振动仪充分混合，制备得到富氧水凝胶胶液，分装到若干个冻存管中，4℃密闭保存。所得氧水凝胶胶液中每毫升水凝胶中各成分的含量为：CS 0.0128g、β-GP0.0184g、HEC 0.005g、潘氟隆0.05ml。

[0079] 实施例2：本富氧温敏型水凝胶的制备方法采用下述具体工艺。

[0080] 步骤（1）-（3）与实施例1相同，步骤（4）和（5）除下述不同之处，其余与实施例1相同，不同之处为：

[0081] （4）将95mg的蛋黄卵磷脂与700μLTyrode盐缓冲液及300μL潘氟隆原液混合制备得浓度为0.30g/ml的潘氟隆乳液。

[0082] （5）配制富氧温敏型水凝胶：取8ml、0.03g/ml的CS溶液与2ml、0.1725g/ml的β-GP溶液，2.5ml、0.0375g/ml的HEC溶液，6.25ml、30% vol%的潘氟隆乳液混合密封，冰浴环境下，振动仪充分混合，制备得到富氧水凝胶胶液，分装到若干个冻存管中，4℃密闭保存。所得富氧水凝胶胶液中每毫升水凝胶中各成分的含量为：CS0.0128g、β-GP 0.0184g、HEC 0.005g、潘氟隆0.10ml。

[0083] 实施例3：本富氧温敏型水凝胶的制备方法采用下述具体工艺。

[0084] 步骤（1）-（3）与实施例1相同，步骤（4）和（5）除下述不同之处，其余与实施例1相同，不同之处为：

[0085] （4）将80mg的蛋黄卵磷脂与550μLTyrode盐缓冲液及450μL潘氟隆原液混合制备得浓度为45vol%的潘氟隆乳液。

[0086] （5）配制富氧温敏型水凝胶：取8ml、0.029g/ml的CS溶液与2ml、0.1725g/ml的β-GP溶液，2.5ml、0.0375g/ml的HEC溶液，6.25ml、45vol%的潘氟隆乳液混合密封，冰浴环境下，振动仪充分混合，制备得到富氧水凝胶胶液，分装到若干个冻存管中，4℃密闭保存。所得富氧水凝胶胶液中每毫升水凝胶中各成分的含量为：CS 0.0124g、β-GP 0.0184g、HEC 0.005g、潘氟隆0.15ml。

[0087] 实施例4：本富氧温敏型水凝胶的制备方法采用下述具体工艺。

[0088] （1）配制CS酸溶液：按CS含量为0.015g/ml称取CS粉末和盐酸溶液，盐酸溶液浓度为0.12mol/L；混合后在室温环境下以900r/min速度持续搅拌4h，直至CS溶液近乎清澈，4℃冷藏隔夜，再以直径为1.2μm滤膜过滤杂质，最终得到CS溶液，再用牛皮纸封装置于150℃高压锅中灭菌12min，4℃冷藏备用。

[0089] （2）配制β-GP溶液：按β-GP含量为0.20g/ml称取β-GP粉末和水；混合后在室温环境下以800r/min搅拌20min至澄清，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冷藏保存备用。

[0090] （3）配制HEC溶液：按HEC含量为0.03g/ml称取HEC粉末和水；混合后在室温环境下以1500r/min搅拌1h，用0.15μm滤膜过滤除菌，4℃冷藏保存备用。

[0091] （4）配制潘氟隆乳液：按蛋黄卵磷脂90mg、Tyrode盐缓冲液600μL的配比，将蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液中，在400w功率下超声乳化两次，每次间隔1.5min，每次10s，得到基础乳液。然后将基础乳液与潘氟隆原液混合，同上法乳化10次；即可得到所述的潘氟隆乳液，潘氟隆含量为40vol%。将上述潘氟隆乳液用0.8μm滤膜除菌后置于高压氧舱内充氧10min，4℃密闭封存备用。

[0092] （5）配制水凝胶：取16.7ml的CS溶液、2.5ml的β-GP溶液、2.5ml的HEC溶液和3.3ml潘氟隆乳液，混合后密封，冰浴环境下，用振动仪充分混合，即可得到所述的富氧温敏型水凝胶。所得水凝胶胶液分装到若干个冻存管中，4℃密闭保存。所得富氧温敏型水凝胶胶液中每毫升水凝胶中各成分的含量为：CS 0.010g、β-GP 0.020g、HEC 0.003g、潘氟隆0.0528ml。

[0093] 实施例5：本富氧温敏型水凝胶的制备方法采用下述具体工艺。

[0094] （1）配制CS酸溶液：按CS含量为0.04g/ml称取CS粉末和盐酸溶液，盐酸溶液浓度为0.15mol/L；混合后在室温环境下以1500r/min速度持续搅拌3h，直至CS溶液近乎清澈，4℃冷藏隔夜，再以直径为1.0μm滤膜过滤杂质，最终得到CS溶液，再用牛皮纸封装置于130℃高压锅中灭菌15min，4℃冷藏备用。

[0095] （2）配制β-GP溶液：按β-GP含量为0.15g/ml称取β-GP粉末和水；混合后在室温环境下以1200r/min搅拌10min至澄清，0.18μm滤膜过滤除菌，4℃冷藏保存备用。

[0096] （3）配制HEC溶液：按HEC含量为0.06g/ml称取HEC粉末和水；混合后在室温环境下以1200r/min搅拌0.5h，用0.20μm滤膜过滤除菌，4℃冷藏保存备用。

[0097] （4）配制潘氟隆乳液：按蛋黄卵磷脂95mg、Tyrode盐缓冲液750μL的配比，将蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液中，在500w功率下超声乳化两次，每次间隔2min，每次12s，得到基础乳液。然后将基础乳液与潘氟隆原液混合，同上法乳化15次；即可得到所述的潘氟隆乳液，潘氟隆含量为25vol%。将上述潘氟隆乳液用0.8μm滤膜除菌后置于高压氧舱内充氧10min，4℃密闭封存备用。

[0098] （5）配制水凝胶：取10ml的CS溶液、3ml的β-GP溶液、3.5ml的HEC溶液和13.5ml潘氟隆乳液，混合后密封，冰浴环境下，用振动仪充分混合，即可得到所述的富氧温敏型水凝胶。所得水凝胶胶液分装到若干个冻存管中，4℃密闭保存。所得富氧温敏型水凝胶胶液中每毫升水凝胶中各成分的含量为：CS 0.0133g、β-GP 0.015g、HEC 0.007g、潘氟隆0.1125ml。

[0099] 实施例6：本富氧温敏型水凝胶的制备方法采用下述具体工艺。

[0100] （1）配制CS酸溶液：按CS含量为0.025g/ml称取CS粉末和盐酸溶液，盐酸溶液浓度为0.05mol/L；混合后在室温环境下以1200r/min速度持续搅拌2h，直至CS溶液近乎清澈，0℃冷藏隔夜，再以直径为0.5μm滤膜过滤杂质，最终得到CS溶液，再用牛皮纸封装置于140℃高压锅中灭菌5min，0℃冷藏备用。

[0101] （2）配制β-GP溶液：按β-GP含量为0.25g/ml称取β-GP粉末和水；混合后在室温环境下以1500r/min搅拌12min至澄清，0.15μm滤膜过滤除菌，0℃冷藏保存备用。

[0102] （3）配制HEC溶液：按HEC含量为0.01g/ml称取HEC粉末和水；混合后在室温环境下以800r/min搅拌2h，用0.18μm滤膜过滤除菌，0℃冷藏保存备用。

[0103] （4）配制潘氟隆乳液：按蛋黄卵磷脂110mg、Tyrode盐缓冲液700μL的配比，将蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液中，在200w功率下超声乳化三次，每次间隔1.5min，每次20s，得到基础乳液。然后将基础乳液与潘氟隆原液混合，同上法乳化12次；即可得到所述的潘氟隆乳液，潘氟隆含量为30vol%。将上述潘氟隆乳液用0.5μm滤膜除菌后置于高压氧舱内充氧15min，0℃密闭封存备用。

[0104] （5）配制水凝胶：取14ml的CS溶液、2ml的β-GP溶液、10ml的HEC溶液和7ml潘氟隆乳液，混合后密封，冰浴环境下，用振动仪充分混合，即可得到所述的富氧温敏型水凝胶。所得水凝胶胶液分装到若干个冻存管中，0℃密闭保存。所得富氧温敏型水凝胶胶液中每毫升水凝胶中各成分的含量为：CS 0.0106g、β-GP 0.0152g、HEC 0.0030g、潘氟隆0.0636ml。

[0105] 实施例7：本富氧温敏型水凝胶的制备方法采用下述具体工艺。

[0106] （1）配制CS酸溶液：按CS含量为0.05g/ml称取CS粉末和醋酸溶液，醋酸溶液浓度为0.08mol/L；混合后在室温环境下以800r/min速度持续搅拌5h，直至CS溶液近乎清澈，4℃冷藏隔夜，再以直径为1.2μm滤膜过滤杂质，最终得到CS溶液，再用牛皮纸封装置于100℃高压锅中灭菌15min，4℃冷藏备用。

[0107] （2）配制β-GP溶液：按β-GP含量为0.22g/ml称取β-GP粉末和水；混合后在室温环境下以1000r/min搅拌18min至澄清，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冷藏保存备用。

[0108] （3）配制HEC溶液：按HEC含量为0.02g/ml称取HEC粉末和水；混合后在室温环境下以1000r/min搅拌1.5h，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冷藏保存备用。

[0109] （4）配制潘氟隆乳液：按蛋黄卵磷脂100mg、Tyrode盐缓冲液900μL的配比，将蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液中，在450w功率下超声乳化两次，每次间隔1.5min，每次15s，得到基础乳液。然后将基础乳液与潘氟隆原液混合，同上法乳化15次；即可得到所述的潘氟隆乳液，潘氟隆含量为10vol%。将上述潘氟隆乳液用0.8μm滤膜除菌后置于高压氧舱内充氧12min，4℃密闭封存备用。

[0110] （5）配制水凝胶：取9ml的CS溶液、2.5ml的β-GP溶液、6ml的HEC溶液和18ml潘氟隆乳液，混合后密封，冰浴环境下，用振动仪充分混合，即可得到所述的富氧温敏型水凝胶。所得水凝胶胶液分装到若干个冻存管中，4℃密闭保存。所得富氧温敏型水凝胶胶液中每毫升水凝胶中各成分的含量为：CS0.0 127g、β-GP0.0155g、HEC 0.0034g、潘氟隆0.0507ml。

[0111] 实施例8：本富氧温敏型水凝胶的制备方法采用下述具体工艺。

[0112] （1）配制CS酸溶液：按CS含量为0.045g/ml称取CS粉末和盐酸溶液，盐酸溶液浓度为0.10mol/L；混合后在室温环境下以1000r/min速度持续搅拌4h，直至CS溶液近乎清澈，0℃冷藏隔夜，再以直径为1.2μm滤膜过滤杂质，最终得到CS溶液，再用牛皮纸封装置于150℃高压锅中灭菌10min，0℃冷藏备用。

[0113] （2）配制β-GP溶液：按β-GP含量为0.10g/ml称取β-GP粉末和水；混合后在室温环境下以900r/min搅拌20min至澄清，0.22μm滤膜过滤除菌，0℃冷藏保存备用。

[0114] （3）配制HEC溶液：按HEC含量为0.04g/ml称取HEC粉末和水；混合后在室温环境下以900r/min搅拌2h，用0.22μm滤膜过滤除菌，0℃冷藏保存备用。

[0115] （4）配制潘氟隆乳液：按蛋黄卵磷脂80mg、PBS盐缓冲液650μL的配比，将蛋黄卵磷脂加入到PBS盐缓冲液中，在350w功率下超声乳化四次，每次间隔1.5min，每次18s，得到基础乳液。然后将基础乳液与潘氟隆原液混合，同上法乳化12次；即可得到所述的潘氟隆乳液，潘氟隆含量为35vol%。将上述潘氟隆乳液用0.8μm滤膜除菌后置于高压氧舱内充氧10min，0℃密闭封存备用。

[0116] （5）配制水凝胶：取10ml的CS溶液、5ml的β-GP溶液、5ml的HEC溶液和10ml潘氟隆乳液，混合后密封，冰浴环境下，用振动仪充分混合，即可得到所述的富氧温敏型水凝胶。所得水凝胶胶液分装到若干个冻存管中，0℃密闭保存。所得富氧温敏型水凝胶胶液中每毫升水凝胶中各成分的含量为：CS 0.01.5g、β-GP 0.0167g、HEC 0.0067g、潘氟隆0.1167ml。

[0117] 性能检测：对上述实施例1所得潘氟隆5vol%的富氧温敏型水凝胶和实施例2所得潘氟隆10vol%的富氧温敏型水凝胶进行性能检测，检测过程和结果如下所述。

[0118] （1）成胶时间：两种潘氟隆浓度胶液样本分别取出10管放入37℃恒温水浴槽中，每间隔30s两组浓度各取出1管样本进行倒置观察，若30s内胶液不倒流则此次样本取出的时间点为成胶时间，实验重复5次。

[0119] 结果显示：潘氟隆浓度为5vol%和10vol%的富氧温敏水凝胶在37℃环境中经过一段时间后均由淡黄色流动性胶液变为淡黄色不可流动的胶体，且成胶时间均约为4.5分钟，无明显统计学差异（P>0.05）。

[0120] （2）pH值的检测：将两种潘氟隆浓度的富氧水凝胶胶液分别分装于5个小瓶中，在溶液凝胶化之前用电子pH计在常温下测量各小瓶内胶液的pH值并记录5组数据。

[0121] 结果显示：潘氟隆浓度为5%和10%的富氧水凝胶胶液的pH值接近中性，且两组无明显统计学差异（P>0.05）。

[0122] （3）释氧性能检测：将两种不同潘氟隆浓度的富氧水凝胶分别按10ml/cm3 的标准浸入Tyrode盐缓冲液制作浸提液，每组浓度共5个样本。于0、1、2……10天分别取少量浸提液用生化血气仪测量氧气分压判断两种不同潘氟隆浓度富氧水凝胶释氧能力。

[0123] 通过应用血气分析仪在不同时间点检测持续浸泡富氧温敏型水凝胶胶体的浸提液氧分压，根据各时间点所测得数据，绘制了两种不同潘氟隆浓度富氧水凝胶的放氧率曲线图，曲线图见图1。结果显示：潘氟隆浓度为10%的富氧水凝胶其放氧量更大、放氧速率更快，较5%的富氧水凝胶具有更好的释氧性能；但二者放氧持续时间相同，约持续7天。

[0124] （4）超微结构检测：将潘氟隆浓度为10%的富氧水凝胶冻干后，用扫描电镜观察其横断面，扫描图见图2、图3，由图2、图3可以看出，冷冻干燥后凝胶的微观结构呈多孔三维立体网状构架（孔径约为100～200μm），纤维纵横交错，孔径致密。

[0125] （5）血液毒性检测：10%的富氧水凝胶进行血液相容性检测。取新鲜兔血20ml加入适量肝素备用。取抗凝兔血2ml，加入2.5ml生理盐水稀释（共4.5ml）。设计三组实验，每组5个样本，1、实验组：取浸提液（按上述方法制备）8ml与稀释后兔血0.2ml混合均匀；2、阳性对照组：取8ml蒸馏水与稀释后兔血0.2ml混合均匀；3、阴性对照组：取8ml生理盐水与稀释后兔血0.2ml混合均匀。三组样本37℃恒温放置1小时，取出试管离心机离心（2000r/min，5min），吸出上清液放于分光光度仪测量吸光度OD值（545nm波长）。

[0126] 检测结果：10%水凝胶组（实验组）离心后的上清液与阴性对照组相同均为无色透明，说明红细胞未被破坏。与此相反，阳性对照组呈现为红色液体，说明红细胞破裂。每组上清液经分光光度仪分析，其吸光光度值（OD值）结果显示：实验组与阳性对照组存在显著差异（P<0.01），与阴性对照组无明显差异（P>0.05）。

[0127] （6）肌肉包埋检测组织相容性及降解性：取12只新西兰白兔，随机分为4组，每组3只，实验兔麻醉消毒后，将10%潘氟隆浓度的富氧水凝胶胶体1cm3 平行于肌纤维钝性分离包埋于所有实验兔右侧大腿肌肉组织内。分别于2、4、6、8周处死，取出包埋处肌肉组织，石蜡切片HE染色观察组织反应及凝胶代谢清除情况。

[0128] 检测结果：术后所有兔子生命体征平稳，切口无感染，术后第二天可正常进食，体重逐渐增加。2周后切口Ⅰ期愈合，部分缝线自动脱落。将潘氟隆浓度为10%的富氧凝胶在成胶后包埋于兔大腿肌肉中2周时，样本大体可见移植物完整、呈乳白色、质软，大部分未被代谢清除，移植物与肌肉边界清楚；镜下可见片状均质红染的移植物，少许中性粒及淋巴细胞等炎症细胞渗入移植物内，无明显纤维增生及组织坏死，见图4。4周时，样本大体可见移植物明显缩小，有少许黄白色残留物、质软、形态不规则；镜下见，移植物周围大量炎症细胞，可见分叶核中性粒细胞及淋巴细胞，无明显组织坏死，见图5。6周时，样本大体未见明显移植物残留；镜下可见，移植物几乎完全代谢清除，正常肌纤维间存在少许炎症细胞，无明显组织坏死，见图6。8周时，样本大体未找到移植物；镜下见，正常肌肉组织炎症细胞消退，见图7。

[0129] 修复兔股骨髁骨缺损的实验：选用实施例2所得潘氟隆10vol%的富氧温敏型水凝胶进行修复兔股骨髁骨缺损的实验。

[0130] 1、实验过程：

[0131] （1）实验动物分组：6-9月龄成年新西兰白兔72只，重量2.5-3.5kg，雌雄各半。按照第4、6、8、12周，每周包括实验组（填充富氧温敏型水凝胶）、对照组（填充未充氧温敏型水凝胶）、空白组（不填充任何材料），随机分为12组，每组6只，每只兔右侧为手术操作侧。实验组中利用潘氟隆浓度为10%的富氧温敏型水凝胶严密填充至股骨外侧髁骨缺损处，对照组中将含有富氧剂“潘氟隆”但不充氧的无氧温敏型水凝胶填充至股骨外侧髁骨缺损处，空白组中的股骨外侧髁骨缺损处不做任何填充处理。

[0132] （2）手术操作及术后处理：速眠新0.3ml/kg在兔大腿部位肌注，辅以2%苯巴比妥按1.5ml/kg耳缘静脉注射，观察生命体征，待呼吸减弱减慢，肌肉松弛，无角膜反射时证明麻醉成功，取左侧卧位固定于手术台上，用电动剃毛刀刮除膝关节上下2cm兔毛，手术区域碘伏消毒2遍，铺无菌洞巾，触摸膝关节股骨外侧髁平台部位，于平台中央作纵形长约1.5㎝切口，依次切开皮肤及皮下筋膜，眼睑拉钩撑开切口，暴露股骨外侧髁及远端关节间隙，取直径6mm钻头，在离钻头1㎝处做标记，以距离股骨远端关节面2-3mm为中心由外向内钻孔，注意钻孔周围边距，避免额外的骨质破坏。成功钻取直径6mm，深1cm横向的圆柱形骨缺损模型，用手术刀片彻底刮除孔洞边缘隆起的骨膜及残存骨组织，用含20ml盐水的注射器反复冲洗孔洞，避免残存自体骨屑。从4℃冰箱中取出配置好的水凝胶胶液备用。实验组将富氧温敏型水凝胶胶液用2ml注射器快速注射至骨缺损处将孔洞填满，待其自然成胶；对照组将无氧温敏型水凝胶胶液快速注射至骨缺损处，将孔洞填满，待其自然成胶。空白组不做任何材料填充。逐层缝合切口，碘伏再次消毒皮肤皮缘。术后给予头孢呋辛（30mg/kg）肌注，连续
3天，按时换药预防感染，常规进食水，二周后切口愈合，缝线脱落。

[0133] （3）取材：术后第¬¬¬4、6、8、12周空气栓塞法处死动物，取出右侧股骨，将髁部软组织小心剔除，避免损伤骨缺损处骨痂，用电锯沿股骨干与股骨髁交界处切割，保留髁部，置于4%多聚甲醛中固定。

[0134] （4）检测：

[0135] A、标本大体解剖观察：观察骨缺损区域的颜色、质地、填充材料代谢清除情况及骨缺损大体修复效果。

[0136] B、X线检测：

[0137] 对兔股骨髁样本行X线检测（放射条件：50kV，320mA，7.5mS），观察骨缺损区域骨密度影的变化，评价并比较各组骨缺损愈合情况。

[0138] C、Micro-CT检测：对骨缺损区域行Micro-CT检测（扫描参数：扫描分辨率14μm，旋转角度360o，旋转角度增量0.4o，电压80kV，电流80μA，曝光时间3000ms），并应用Micview V2.1.2 三维重建处理软件及ABA专用骨骼分析软件进行三维重建，观察骨小梁形态、数量、密度。根据骨缺损修复区域的骨密度（TMD）、骨体积分数（BVF）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）、结构模型指数（SMI）指标，进一步评价并比较各组骨缺损区域修复效果。

[0139] （4）组织形态检测：骨样本经盐酸（HCL）快速脱钙后，对骨缺损区域进行HE、Masson染色，观察骨缺损区域组织形态结构；骨缺损修复区域经EDTA溶液脱钙2个月后进行CD31免疫组化染色，观察比较各组骨缺损区域新生微血管数量，阳性染色表现为棕色着色，定位于血管内皮细胞，从邻近毛细血管分离出来的染色表达阳性的内皮细胞簇也计数为血管，参照Chalkley等校对计数方法分析血管染色结果，每个样本重复计数3次取平均值。

[0140] （5）统计学方法：所有计量资料均以 ±s表示，采用SPSS21.0软件进行统计学分析，若样本数据服从正态分布且方差齐，则采用多个独立样本的方差分析（one-way ANOVA）；若样本总体方差不齐，则采用多个独立样本的秩和检验（Kruskai-wallis A检验），当样本有统计学差异时采用LSD法进行两两比较。统计结果以P<0.05为有统计学意义。

[0141] 2、实验结果：

[0142] （1）大体观察结果：

[0143] 术后4周：空白组见骨缺损处空腔明显，缺损内可见暗红色陈旧血痂，未见骨缺损修复迹象；对照组可见骨缺损明显，填充物部分代谢清除，与骨质界限清晰；实验组见骨缺损明显，填充物大部分代谢清除，与骨质界限不清。

[0144] 术后6周：空白组仍可见明显骨缺损，缺损壁周可见纤维组织长入；对照组填充物几乎完全代谢清除，缺损处可见新生骨，表面半透明纤维软骨覆盖，仍可见皮质缺损；实验组可见填充物完全代谢清除，新生骨增生明显，骨痂略突起，无明显缺损。

[0145] 术后8周：空白组纤维组织长入骨缺损处，按压质软，针尖可轻松插入缺损区，无明显阻抗，表面未见实质性新骨生长；对照组缺损处有新生骨质生长，皮质仍可见微小缺损；实验组可见骨缺损被新生骨完全填充，皮质骨表面粗糙。

[0146] 术后12周：空白组可见明显纤维组织增生，按压稍有阻力，未见明显实质性新骨生成；对照组骨缺损完全被新骨填充，新生皮质菲薄、略突起，表面呈暗红色，质硬，与正常骨质分界明显；实验组骨缺损处修复后皮质完整，表面平整光滑，质硬，与正常骨质无明显分界。

[0147] （2）X线检查结果：第4周时，X片显示3组骨缺损区域低密度影均较明显，实验组骨缺损边缘可见新增高密度影，见图8、图9、图10。6、8周时，空白组随时间推移低密度影减小不明显；对照组随时间推移骨缺损处密度逐渐增加；实验组圆形骨缺损高密度影快速增加。第12周时，空白组骨缺损处仍可见圆形低密度影；对照组骨缺损处可见模糊低密度影；实验组骨缺损处密度影与周围松质骨密度无明显差异，见图11、图12、图13。

[0148] 3.Micro-CT影像学结果：图14是第4周时三维Micro-CT图、图15是第4周时伪彩Micro-CT图、图16是第4周时二维Micro-CT图，其中，a为实验组、b为对照组、c为空白组。由图可见，4周时，空白组有极少骨小梁形成，且新生骨小梁细小未相互连接，三维重建示空洞明显；对照组有少许新生骨小梁形成，新生骨小梁细小有些相互连接，三维重建示骨缺损空洞明显；实验组有少许新生骨形成，较对照组多，新生骨小梁较细，有些相互连接，三维重建示皮质骨未完全修复，空洞明显缩小。

[0149] 图17是第6周时三维Micro-CT图、图18是第6周时伪彩Micro-CT图、图19是第6周时二维Micro-CT图，其中，a为实验组、b为对照组、c为空白组。6周时，空白组有少许新生骨小梁形成，三维重建示空洞明显；对照组较4周时新生骨小梁增多，骨小梁较细连接数目增多，三维重建示皮质骨骨质不连续；实验组较4周时新生骨小梁明显增多，骨小梁加粗，连接数目增多，三维重建示皮质骨不完整，但修复情况优于对照组。

[0150] 图20是第8周时三维Micro-CT图、图21是第8周时伪彩Micro-CT图、图22是第8周时二维Micro-CT图，其中，a为实验组、b为对照组、c为空白组。8周时，空白组有新生骨小梁形成，较6周少许增加，骨小梁密度差，三维重建示皮质缺损，空洞明显；对照组较6周时新生骨小梁持续增多增粗，骨小梁密度增加，三维重建示缺损部位皮质凹陷；实验组较6周时新生骨小梁数目、密度明显增加且相互连接，三维重建示骨皮质连续，有少许点状缺损，修复效果优于对照组。

[0151] 图23是第12周时三维Micro-CT图、图24是第12周时伪彩Micro-CT图、图25是第12周时二维Micro-CT图，其中，a为实验组、b为对照组、c为空白组。12时周，空白组骨缺损仍未完全修复，空洞仍存在；对照组骨小梁密度明显增多，与周围正常骨小梁分界模糊，新生皮质略突起、连续；实验组骨小梁增粗，数量、密度与周围正常骨小梁无明显分界，骨皮质修复良好。

[0152] 4.Micro-CT数据分析结果：图26 TMD分析图，图27是BVF分析图，图28是Tb.N分析图，图29是Tb.Th分析图，图30是SMI分析图；由图可知，统计分析结果显示：在骨密度（TMD）、骨体积分数（BVF）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）方面，第4、6、8、12周4个时间点中，每个时间点的三组样本均具有统计学差异（P<0.05），且实验组>对照组>空白组。在结构模型指数（SMI）方面在第4、6周时三组数据无明显的统计学差异（P>0.05）且SMI值趋向于3，说明三组新生骨小梁均为幼稚杆状形态；在第8、12周时三组数据存在统计学差异（P<0.05），且空白组SMI值接趋向3而对照组与实验组更趋向于0，说明空白组新生骨小梁仍然呈幼稚杆状，而对照组与实验组新生骨小梁更多呈成熟板状，但实验组优于对照组。

[0153] 5.组织形态检测结果：图31为4周时实验组的组织形态，图32为4周时对照组的组织形态，图33为4周时空白组的组织形态，其中，1为HE染色、2为Masson染色。图34为4周时CD31免疫组化图片，其中，a为实验组、b为对照组、c为空白组。由图可见，4周时，空白组骨缺损区域HE染色可见血痂，内含大量红细胞，有少许炎症细胞，免疫组化示新生血管不明显；Masson染色可见浅蓝染的纤维组织，缺损区域未见新生骨细胞及新生骨质形成，未见成骨细胞。对照组HE染色可见材料稀疏，大部分代谢清除，炎症细胞渗入填充材料内，周围被间充质组织填充，免疫组化示少量新生血管；Masson染色可见缺损区域边缘出现少量散在蓝染的幼稚新生骨，骨陷窝内骨细胞周围分泌浅绿色胶原，代谢活跃，可见少量成骨细胞。实验组HE染色可见材料大部分代谢清除，炎症细胞渗入凝胶材料中，新生骨质周围被间充质填充，免疫组化示新生血管较对照组多；Masson染色可见骨缺损区域边缘有较多散在蓝染的新生幼稚骨生成，骨陷窝内可见骨细胞周围分泌浅绿色新生胶原，代谢活跃，可见大量成骨细胞。

[0154] 图35为6周时实验组的组织形态，图36为6周时对照组的组织形态，图37为6周时空白组的组织形态，其中，1为HE染色、2为Masson染色。图38为6周时CD31免疫组化图片，其中，a为实验组、b为对照组、c为空白组。由图可见，6周时，空白组HE染色可见血痂大部机化吸收，可见少量红细胞，周围被间充质填充，免疫组化示少量新生血管；Masson染色可见浅蓝染的纤维组织，骨缺损区域边缘存在少量孤立的蓝染幼稚新生骨小梁，骨陷窝内可见骨细胞，细胞周围可见浅绿色新生胶原，代谢活跃，可见少量成骨细胞。对照组HE染色可见填充材料几乎完全代谢清除，炎症细胞较4周时明显减少，周围填充间充质组织，免疫组化可见新生血管，较空白组多；Masson染色可见少量浅蓝色增生纤维组织及一些孤立的蓝染新生骨小梁，较空白组多，骨内陷窝中骨细胞分泌胶原，可见较多成骨细胞。实验组HE染色可见填充材料完全代谢清除，散在少量炎性细胞，其余被间充质填充，免疫组化示新生血管数量较对照组多；Masson染色可见骨缺损周边存在红蓝相间的略成熟骨小梁，部分相互连接，骨陷窝内成骨细胞分泌新鲜胶原，可见较多成骨细胞。

[0155] 图39为8周时实验组的组织形态，图40为8周时对照组的组织形态，图41为8周时空白组的组织形态，其中，1为HE染色、2为Masson染色。图42为8周时CD31免疫组化图片，其中，a为实验组、b为对照组、c为空白组。由图可见，8周时，空白组HE染色可见血痂完全吸收，散在大量纤维细胞，免疫组化示少量新生血管，较6周时增多不明显；Masson染色可见浅蓝色网状增生纤维，骨缺损区域边缘散在红蓝相间略成熟骨小梁，数量较6周增多，少量相互连接。对照组HE染色可见填充材料完全代谢清除，小梁间被间充质填充，免疫组化示新生血管较6周时增多；Masson染色可见骨缺损区域红蓝相间略成熟骨小梁，部分相互连接，数目空白组多。实验组HE染色可见填充材料完全代谢清除，周围填充间充质组织，免疫组化示较多新生血管，较6周时增多；Masson染色可见骨缺损区域大部红染的成熟板层状骨小梁，骨小梁数目多且形态较粗，大部分相互连接。

[0156] 图43为12周时实验组的组织形态，图44为12周时对照组的组织形态，图45为12周时空白组的组织形态，其中，1为HE染色、2为Masson染色。图46为12周时CD31免疫组化图片，其中，a为实验组、b为对照组、c为空白组。由图可见，12周时，空白组HE染色可见大量纤维细胞及网状纤维增生，免疫组化示仅少量新生血管；Masson染色可见大量蓝染细小网状增生纤维，散在红蓝相间略成熟骨小梁，数目较8周增多，个别相互连接，骨陷窝内可见成骨细胞周围存在少量浅绿色新生胶原。对照组HE染色可见材料完全代谢清除，免疫组化示较多新生血管；Masson染色可见蓝染网状纤维，较多红蓝相间略成熟骨小梁，部分成板层状，骨陷窝内可见成骨细胞周围存在少量浅绿色新生胶原。实验组HE染色可见填充材料完全代谢清除，免疫组化示大量新生血管；Masson染色可见大量红染板层状状成熟骨小梁，骨小梁较粗，骨陷窝内可见成熟骨细胞，细胞周围无新分泌的浅绿色胶原。

[0157] 6.CD31免疫组化微血管计数结果：图47为CD31免疫组化微血管计数统计图，由图可知，统计分析结果显示：在骨缺损区域新生微血管计数方面，第4、6、8、12周4个时间点中，每个时间点的三组样本均具有统计学差异（P<0.05），且实验组>对照组>空白组。