一种骆驼刺泛菌及其菌剂和应用

摘要

本发明公开了一种骆驼刺泛菌，其分类命名为骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)，菌株号为XK‑11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15525；更进一步公开了骆驼刺泛菌在增强农作物抗旱性中的应用。本发明公开了以骆驼刺泛菌为活性微生物的菌剂；进一步公开了菌剂在增强农作物抗旱性中的应用。骆驼刺泛菌XK‑11可黏附于植物根系，亦可进入植物内与植物共生，提高植物对外界营养元素的吸收，改善自身代谢系统，维持植物内部水势等，从而促进植物生长发育，提高产量，同时增强植物抗旱能力。对充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等具有极其重要意义和应用价值。

权利要求

1.一种骆驼刺泛菌，其分类命名为骆驼刺泛菌（Pantoea alhagi），菌株号为XK-11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年3月29日，保藏编号为CGMCC NO.15525。

2.权利要求1所述骆驼刺泛菌在提高农作物产量、提升农作物品质、增强农作物抗旱性中任意一种或几种中的应用，所述提升农作物品质为提高维生素C含量和降低硝酸盐含量。

3.权利要求1所述骆驼刺泛菌在发酵制备胞外多糖中的应用。

4.一种活性微生物菌剂，其特征在于，它包含权利要求1所述骆驼刺泛菌。

5.权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：将权利要求1所述骆驼刺泛菌接种于LB培养基中25-35 ℃活化12-24 h，将活化的骆驼刺泛菌转接于发酵培养基中，

30-35 ℃培养36-50 h得到发酵液，发酵液或发酵液后处理得到的体系即为菌剂，即所述发酵液或发酵液后处理得到的体系为发酵液、发酵液浓缩得到的浓缩液或发酵液干燥得到的粉剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述菌剂的剂型为溶液、悬浮液、颗粒剂、粉剂或棒剂，所述菌剂中菌体浓度为1×109-9×1010 CFU/g。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基配方如下：碳源10-

100 g/L，氮源1-30 g/L，无机盐0.01-50 g/L，pH 5.0-9.0。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种或几种的组合；所述氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)

2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。

9.权利要求4所述菌剂在提高农作物产量、提升农作物品质、增强农作物抗旱性中任意一种或几种中的应用，所述提升农作物品质为提高维生素C含量和降低硝酸盐含量。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述菌剂施用于农作物、园林作物、沙漠植物。

说明书

一种骆驼刺泛菌及其菌剂和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物菌剂领域，具体涉及一种骆驼刺泛菌及其菌剂和应用。

背景技术

[0002] 土壤干旱化是影响现代农业生产的最主要非生物胁迫因子之一，干旱对全世界农作物产量的影响在其它非生物胁迫所造成的影响中占第一位，其对植物的危害程度是其他自然灾害之首。我国大部分地区属于亚洲季风区，干旱灾害具有季节性、普遍性、连续性、区域性的特点，半干旱、干旱面积占我国国土面积的52％。即便是非干旱区，也面临季节性干旱和不均匀降水的问题。

[0003] 微生物菌剂自1888年在全球范围内首次使用起至今在数量与质量上已经获得了大范围的推广以及深远的进步。由于微生物繁殖速度快，可人工大量繁殖后再施入农作土壤中，调节植物根系微生态环境，如增加有益微生物类群，抑制有害病原微生物，缓解土壤板结、高盐等障碍。微生物菌剂具有很多特性，如对环境相对安全，不易使病原菌产生耐药性，生产工艺简单等，所以用微生物防治植物土传病害、非生物胁迫方面，具有极大的潜力。

[0004] 胞外多糖产生菌是从土壤中分离出的一种能高效增强抗干旱能力的植物内生菌。其能作为微生物肥料，提高植物对外界营养元素的吸收或者改善自身代谢系统等方面来促进植物生物量的增加，促进植物生长，能提高植物内外的渗透压差，增强植物在干旱环境下的生长能力。

发明内容

[0005] 发明目的：为了解决植物干旱的问题，本发明提供了一种骆驼刺泛菌，本发明进一步地提供了以骆驼刺泛菌为活性微生物的菌剂，本发明进一步地提供了骆驼刺泛菌及其菌剂在增强农作物抗干旱能力中的应用。

[0006] 技术方案：本发明所述一种骆驼刺泛菌，其分类命名为骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)，菌株号为XK-11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年3月29日，保藏编号为CGMCC NO.15525，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏中心，邮编100101。该菌株是发明人于2017年10月从浙西大峡谷选育的菌株。

[0007] 骆驼刺泛菌XK-11具有下述性质：

[0008] 1、菌落形态学特征

[0009] 在LB培养基30℃培养16-24h后显微镜观察到细胞为单细胞，杆状，菌体长1.4-2.0μm，宽0.7-1.0μm。属于革兰氏阴性菌、具有鞭毛能够运动、兼性厌氧。在上述培养基中30℃培养12h菌体可以大量生长，菌落呈米黄色，圆形，表面光滑，粘状，中间凸起。其生长的温度范围是7-48℃，最适温度为35-39℃，生长的pH范围是5.0-9.5，最适pH为6.5-7.5。具有氨苄霉素抗性(100μg/mL)，能在LB、R2A、NA、TSA、MC等培养基中正常生长。

[0010] 2、16SrDNA序列分析

[0011] 16SrDNA序列长度1488bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.1。将16SrDNA序列和GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株XK-11与骆驼刺泛菌达到100％同源。所以认定本发明的菌株为骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)，菌株号为Pantoea alhagi XK-11。

[0012] 本发明进一步提供了所述骆驼刺泛菌在提高农作物产量、提升农作物品质、增强农作物抗旱性中任意一种或几种中的应用。骆驼刺泛菌XK-11可以产生胞外多糖，由于该胞外多糖具有吸水性，通过与植物共生，能维持干旱条件下植物内部的水势，因此具有增强植物抗干旱的能力。上述胞外多糖产生菌可与有机肥混合使用，也可以单独使用，改善根际微生物环境，促进植物生长，增强植物抗干旱能力，减少化肥使用量。

[0013] 优选地，所述农作物为粮食作物、蔬菜类作物或瓜果类作物。

[0014] 本发明进一步提供了所述骆驼刺泛菌在发酵制备胞外多糖中的应用，制备步骤如下：将所述骆驼刺泛菌接种于LB培养基中25-35℃活化12-24h，将活化的骆驼刺泛菌转接于发酵培养基中，30-35℃培养36-50h得到发酵液，发酵液中胞外多糖产量高达5g/L。

[0015] 所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/L，氮源1-30g/L，无机盐0.01-50g/L，pH5.0-9.0，所述溶剂为水。

[0016] 所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种几种的组合，优选为葡萄糖、乳糖、木糖、柠檬酸和淀粉中的任意一种或几种的组合；所述氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合，优选为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。

[0017] 本发明更进一步提供一种活性微生物菌剂，它包含所述骆驼刺泛菌。

[0018] 本发明更进一步提供所述菌剂的制备方法，步骤如下：将所述骆驼刺泛菌接种于LB培养基中25-35℃活化12-24h，将活化的骆驼刺泛菌转接于发酵培养基中，30-35℃培养36-50h得到发酵液，发酵液或发酵液后处理得到的体系即为菌剂，即所述发酵液、发酵液浓缩得到的浓缩液或发酵液干燥得到的粉剂即为菌剂。

[0019] 所述菌剂的剂型为溶液、悬浮液、颗粒剂、粉剂或棒剂，所述菌剂中菌体浓度为1×109-9×1010CFU/g。

[0020] 所述LB培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH6.0-8.0，所述溶剂为水。

[0021] 所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/L，氮源1-30g/L，无机盐0.01-50g/L，pH5.0-9.0，所述溶剂为水。

[0022] 所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种几种的组合，优选为葡萄糖、乳糖、木糖、柠檬酸和淀粉中的任意一种或几种的组合；所述氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合，优选为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。

[0023] 本发明进一步提供所述菌剂在提高农作物产量、提升农作物品质、增强农作物抗旱性中任意一种或几种中的应用；所述菌剂通过灌根或喷施处理，施用于农作物、园林作物、沙漠植物或盐碱地作物。菌剂可与有机肥混合使用，也可以单独使用，改善根际微生物环境，促进植物生长，增强植物抗干旱能力，减少化肥使用量。

[0024] 优选地，所述农作物为粮食作物、蔬菜类作物或瓜果类作物。

[0025] 有益效果：(1)本发明从土壤中筛选出具有增强植物抗旱能力并产生胞外多糖的胞外多糖产生菌骆驼刺泛菌XK-11，并以骆驼刺泛菌XK-11为菌种发酵培养制备得到骆驼刺泛菌XK-11菌剂。骆驼刺泛菌XK-11可黏附于植物根系，亦可进入植物内与植物共生，提高植物对外界营养元素的吸收，改善自身代谢系统，维持植物内部水势等，从而促进植物生长发育，提高产量，同时增强植物抗旱能力。对充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等具有极其重要意义和应用价值。(2)本发明提供的骆驼刺泛菌XK-11菌剂不存在生产过程中向环境排放污染物，骆驼刺泛菌XK-11是一种真正意义上的环保型肥料；且本发明提供的骆驼刺泛菌XK-11菌剂的制备方法，生产工艺简单，生产效率高，能实现工业化大生产，具有良好的经济效应和社会效应。

具体实施方式

[0026] 实施例1骆驼刺泛菌XK-11的筛选和鉴定

[0027] 骆驼刺泛菌XK-11是发明人从浙西大峡谷谷地土壤选育(以产多糖为标准)的菌株，筛选过程如下：

[0028] 将采集的土样溶于无菌水中，震荡、混匀。将样品溶液进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6三个浓度梯度的稀释液在固体培养基(培养基成分：蔗糖20g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏1g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L)上均匀涂布。置于30℃恒温培养箱中培养48h，期间每天查看平板，观察菌落特征，以粘性菌落作为筛选目标。从中挑取能够产高粘胞外多糖的单菌落在固体培养难平板上采用划线法纯化。

[0029] 将上步获得的单菌落分别接种到液体培养基(培养基成分：蔗糖20g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏1g/L，NaCl 5g/L)中养，于摇床上30℃进行震荡发酵培培养，48h后对比不同菌株的发酵液粘度，其中发酵液粘度最高的菌株即为本发明所述的骆驼刺泛菌XK-11。

[0030] 骆驼刺泛菌XK-11具有下述性质：

[0031] 1、菌落形态学特征

[0032] 在蛋白胨琼脂培养基30℃培养16-24h后显微镜观察到细胞为单细胞，杆状，菌体长1.4-2.0μm，宽0.7-1.0μm。属于革兰氏阴性菌、具有鞭毛能够运动、兼性厌氧。在上述培养基中30℃培养12h菌体可以大量生长，菌落呈米黄色，圆形，表面光滑，粘状，中间凸起。其生长的温度范围是7-48℃，最适温度为35-39℃，生长的pH范围是5.0-9.5，最适pH为6.5-7.5。具有氨苄霉素抗性(100μg/mL)，能在LB、R2A、NA、TSA、MC等培养基中正常生长。

[0033] 2、16SrDNA序列分析

[0034] 16SrDNA序列长度1488bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.1。将16SrDNA序列和GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株XK-11与骆驼刺泛菌达到100％同源。所以认定本发明的菌株为骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)，具体为Pantoea alhagi XK-11。

[0035] 实施例2骆驼刺泛菌XK-11菌剂

[0036] 将4℃斜面保存的Pantoea alhagi XK-11活化，接种于茄子瓶培养基(即活化培养基)上，活化温度为32℃，活化时间为16h。挑取茄子瓶上大量的菌种，接种于发酵培养基中，发酵罐中无菌空气的通气量为0.2vvm，搅拌速度为200rpm，30℃培养48h得发酵液，菌剂中的菌体数量可达到5×109CFU/g以上。

[0037] 所述活化培养基为LB培养基，发酵培养基组分为：葡萄糖40g/L，牛肉膏8g/L，NaCl 6g/L，蛋白胨10g/L，pH为7.0。

[0038] 实施例3骆驼刺泛菌XK-11产胞外多糖的能力测定

[0039] 使用苯酚硫酸法定量检测实施例2发酵液中的胞外多糖含量，根据无水葡萄糖制作的标准曲线计算骆驼刺泛菌XK-11的胞外多糖产生量。结果表明，骆驼刺泛菌XK-11胞外多糖的产量达到5g/L。

[0040] 实施例4骆驼刺泛菌XK-11可以显著提高小麦产量

[0041] 本发明所用菌剂制备方法同实施例2。

[0042] 以小麦为研究对象，开展小区实验。实验设置3种处理方式，每个处理方式设3次重复，共计9个小区，小区面积为5m×4m＝20m2，各小区随机分布。

[0043] 处理1(T1)不加菌剂处理，即为空白组；

[0044] 处理2(T2)施加实施例2制备的菌剂(16kg/hm2)；

[0045] 处理3(T3)施加灭活菌剂(16kg/hm2，由实施例2制备的菌剂经高压高温灭活)。

[0046] 三种处理的其他常规肥料施用量及日常管理均保持一致。在小麦成熟期检测小麦产量等各项指标，实验结果见表1。

[0047] 表1不同处理条件下小麦的生长状况

[0048]

[0049] 结果表明，在小麦实验中，骆驼刺泛菌XK-11明显促进了小麦的生长，产量提高了38.0％，而当骆驼刺泛菌XK-11灭活后，产量与对照组几乎相同。这说明，骆驼刺泛菌XK-11可以显著提高农作物产量。

[0050] 实施例5骆驼刺泛菌XK-11可以显著增强白菜抗旱能力

[0051] 本发明所用菌剂制备方法同实施例2。

[0052] 以白菜为实验对象，开展盆栽实验。试验设4种处理方式：

[0053] 处理1(T1)正常浇水；

[0054] 处理2(T2)按正常浇水量的30％浇水；

[0055] 处理3(T3)正常浇水并施用实施例2制备的菌剂(每盆加入5mL菌剂，菌剂含水量计入浇水量)；

[0056] 处理4(T4)按正常浇水量的30％浇水并施用实施例2制备的菌剂(每盆加入5mL菌剂，菌剂含水量计入浇水量)。

[0057] 四个处理的其他常规肥料施用量及日常管理均保持一致，在白菜收获期检测产量等各项指标，实验结果见表2。

[0058] 表2白菜盆栽实验中不同处理条件下的生长状况

[0059]

[0060] 在白菜盆栽实验中，正常浇水量下处理3与处理1相比，根长、叶长与鲜重均有明显的提升，增产达15.8％；在30％浇水量下，处理2产量下降了32.3％；而当施加菌剂时，处理4增产5.1％，且与处理2相比，在根长，叶长与产鲜重上都有大幅度的提升。说明骆驼刺泛菌XK-11不仅能促进农作物生长，在增强农作物抗旱能力上有非常显著的优异表现。

[0061] 实施例6骆驼刺泛菌XK-11可显著提高甜瓜的品质

[0062] 本发明所用菌剂制备方法同实施例2。

[0063] 以甜瓜为实验对象，开展大田实验。实验设置3种处理方式，每个处理方式设3次重复：

[0064] 处理1(T1)为不施加菌剂；

[0065] 处理2(T2)施加实施例2制备的菌剂(24kg/hm2)；

[0066] 处理3(T3)施加实施例2制备的灭活菌剂(24kg/hm2)。

[0067] 三个处理方式的其他常规肥料施用量及日常管理均保持一致，在甜瓜收获期检测与甜瓜品质相关的各项指标，实验结果见表3。

[0068] 表3骆驼刺泛菌XK-11对甜瓜Vc和硝酸盐含量的影响

[0069]

[0070] 与处理1相比，骆驼刺泛菌XK-11可以提高Vc含量51.2％，降低硝酸盐含量22.0％。当将菌剂灭活后，Vc含量和硝酸盐含量均与处理1类似。这说明，骆驼刺泛菌XK-11能显著提高农作物的品质。