柑橘溃疡病感病基因Cs9g12620.1

摘要

一种柑橘溃疡病感病基因Cs9g12620.1，在柑橘中的序列如SEQ ID NO.1所示，启动子区域序列长度为1317 bp；ORF序列长度为1122 bp。基因启动子中存在被柑橘溃疡病菌PthA4特异性结合的UPT box，其序列如SEQ ID NO.3所示，长度为19 bp。本发明获得的Cs9g12620.1基因由于启动子中含有能被来自柑橘溃疡菌的主效毒性蛋白PthA4特异性识别的UPT box，所以此基因可被激活并转录，从而导致柑橘溃疡病的发生。利用基因编辑技术对此基因的UPT box区域进行修饰，可获得具有持久抗性的柑橘种质新材料。

权利要求

1. 柑橘溃疡病感病基因Cs9g12620.1在培育持久抗性的柑橘种质中的应用，柑橘溃疡病感病基因Cs9g12620.1，其序列如SEQ ID NO.1所示，启动子及开放阅读框序列总长度为

2439 bp，在柑橘中编码373个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该基因能被柑橘溃疡病菌效应蛋白PthA4特异性激活转录。

说明书

柑橘溃疡病感病基因Cs9g12620.1

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柑桔溃疡病感病基因Cs9g12620.1、启动子及其编码蛋白。

背景技术

[0002] 柑橘是重要的热带、亚热带果树，全世界有145个国家生产柑橘，生产分布十分广泛，产量居世界水果之首。目前，由柑橘黄单胞菌（Xanthomonas citri subsp. citri）引起的柑橘溃疡病是柑橘上为害最为严重的病害之一，其为害后，在柑橘叶、枝和果实上形成火山口状的病斑，严重时引起落叶、落果，树势衰退，直接影响柑橘的生长结果，特别是果实感病后，失去鲜销商品价值。由于病原菌可以随果实传播，因此被30多个国家和地区定为植物检疫对象。

[0003] 柑橘黄单胞菌（Xcc）在与寄主植物互作过程中, 由III型分泌系统（Type Ⅲ secretion system，T3SS），将细菌的效应蛋白（Effector proteins）注射进入寄主植物细胞，引起病原菌在寄主植物上的致病性。这些效应蛋白能够调节寄主细胞的功能，破坏寄主细胞正常的生理代谢功能，以及调控对寄主的吸附、侵染、定殖、扩展和最终显症等过程。在已报道的Xcc的效应蛋白中，PthA4是Xcc在柑橘上引起病害发生的关键毒性因子，此基因突变后的病原菌不能在柑橘上引起溃疡病害的发生；且在柑橘寄主上单独诱导pthA4基因可产生溃疡症状。PthA4属黄单胞菌AvrBs3/PthA家族成员，是具有转录激活活性的效应蛋白（Transcription Activator Like Effector，TALE），经III型分泌系统进入柑橘植物细胞后，依赖34个氨基酸串联重复单元中的12和13位可变位点与寄主基因启动子DNA序列识别，类似于真核生物转录因子激活植物基因的表达。依据TALE与寄主靶基因识别的分子密码，两家实验室先后报道了溃疡病菌PthA4蛋白在柑橘中识别并诱导表达了感病基因CsLOB1。

[0004] 防治柑橘溃疡病的措施有很多，主要是以化学防治为主，农业防治为辅，但是在流行年份此病害仍然不能得到有效控制，因此，培育柑橘抗病品种是控制柑桔溃疡病的有效策略。由于转基因植物的安全释放上仍受到严格限制，因此，利用基因编辑技术对柑桔溃疡病菌的感病基因序列进行修饰，是目前较为合理的选择，如，运用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1及其启动子序列进行修饰，也确实可以减轻溃疡病的发生。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为柑橘溃疡病的防治提供线索与理论基础，为获得抗病柑橘新品种提供科学线索，为基于基因编辑技术提供一种柑橘溃疡病新的感病基因Cs9g12620.1作为靶点基因。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 本发明提供的是柑橘的Cs9g12620.1基因，其编码的蛋白产物为细胞分裂后期促进复合物，其启动子能被柑橘溃疡菌主效效应蛋白PthA4识别。该基因被激活后过量表达，可直接导致柑橘溃疡病的发生。Cs9g12620.1是此基因在Citrus sinensis Annotation Project网站（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）上的编号，其启动子及其开放阅读框（ORF）序列如SEQ ID NO.1所示，序列总长度为2439 bp。该序列前1317 bp部分为启动子，其序列如SEQ ID NO.1所示，在柑橘中编码373个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。启动子中能被PthA4特定识别的序列如SEQ ID NO.3所示，序列长度为19 bp。

[0008] 本发明的Cs9g12620.1基因及其启动子被PthA4识别的片段由以下方法获得。

[0009] 将健康的柑橘叶片和注射接种柑橘溃疡病菌的叶片，若干天后收集一定量的叶片，提取总RNA并反转录成cDNA，分别进行转录组学分析。将得到的表达水平显著上调的基因，在Citrus sinensis Annotation Project网站中搜索获得其启动子序列，根据TALE-DNA互作识别的分子密码，获得潜在的靶基因，其中包括Cs9g12620.1基因。将纯化蛋白PthA4与Cs9g12620.1基因的启动子区域特异性识别序列进行凝胶阻滞（EMSA）实验，证明PthA4可以与Cs9g12620.1基因的启动子区域特异性识别序列结合识别；将Cs9g12620.1基因上游1281 bp的序列构建到具有gus报道基因的载体上，利用农杆菌瞬时表达方法，检测得到Cs9g12620.1基因启动子可以被PthA4激活；在柑橘寄主上分别单独诱导pthA4基因和Cs9g12620.1基因，可以产生相同的表型，即溃疡的症状。

[0010] 本发明的优点在于：

[0011] 本发明获得了柑橘中与柑橘溃疡病菌互作的感病基因Cs9g12620.1系首次报道，并得到了被柑橘溃疡病菌PthA4蛋白识别的DNA序列，此序列也为首次报道。该感病基因的获得，为运用分子遗传学方法改良柑橘品种提供了资源，具有极大的应用价值。Cs9g12620.1基因的序列可在Citrus sinensis Annotation Project网站（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）上查询得到。涉及pthA4（NC_020800.1）的序列可以在NCBI数据库中查询（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

附图说明

[0012] 图1是柑橘Cs9g12620.1基因启动子被PthA4蛋白结合的DNA序列位置图（下划线部分序列），其中红色部分为Cs9g12620.1 的翻译起始密码。

[0013] 图2是柑橘溃疡病菌PthA4蛋白与Cs9g12620.1基因启动子特定序列结合。

[0014] 图3是柑橘溃疡病菌PthA4蛋白激活Cs9g12620.1基因启动子。

[0015] 图4是Cs9g12620.1基因过量表达导致柑橘溃疡症状。

具体实施方式

[0016] 以下实施例用于进一步阐述本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning：a laboratory manual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0017] 实施例1

[0018] 柑橘溃疡病菌PthA4蛋白与Cs9g12620.1基因启动子特定序列的识别[0019] 本实施例纯化柑橘溃疡病菌PthA4蛋白，并人工合成Cs9g12620.1基因启动子中预测的UPT box，通过凝胶阻滞（EMSA）实验，证明了Cs9g12620.1基因启动子中的UPT box与PthA4互作结合。以烟草基因组作为模板，设计引物5’-TGCCATGGATCCATGAGAGGAGGATTGTGGCA-3’和5’-CCGAGCTCAGCTCCTAGACCTGTTAACCGA-3’进行PCR扩增aminomethyltransferase基因片段，PCR产物回收后用NcoI-SacI酶分别对PCR产物和原核表达载体pET32a进行酶切。aminomethyltransferase基因片段连接进入pET32a(+)，该重组质粒用BamHI处理酶切以后，与从pUFR034:pthA4质粒上用BamHI切下的pthA4片段连接。得到的重组质粒载体经酶切验证后送公司测序，确定连接片段正确。本构建策略没有先行连接的小片段切除，但不影响pthA4与pET32a(+)的融合表达，pthA4序列经BamHI酶切后的3’端序列最后2个碱基CC，正好与将与aminomethyltransferase基因片段5’端序列-ATGA-顺读，出现终止密码子，提前终止翻译。测序验证正确后，再将其质粒转入到大肠杆菌BL21（DE3）里。根据分子克隆实验手册中的IPTG诱导原核纯化表达方法，纯化出蛋白PthA4。对Cs9g12620.1基因启动子中预测的能被PthA4识别的特定序列进行人工合成，并利用Thermo公司的Biotin 3’End DNA labeling Kit（89818）对此序列进行生物素标记。将标记好的片段和纯化的蛋白PthA4利用Thermo公司的LightshiftTM EMSA Optimization& Control Kit（20148Ⅹ）试剂盒方法进行EMSA实验，利用Thermo公司的Chemiuminescent Nucleic Acid Detection Module（89880）进行显色，结果显示PthA4可以与Cs9g12620.1基因启动子中的特定序列结合（参见图2），证明了Cs9g12620.1基因是PthA4的靶基因。

[0020] 实施例2

[0021] 柑橘溃疡病菌PthA4蛋白转录激活Cs9g12620.1基因

[0022] 本实施例将Cs9g12620.1基因上游序列构建到具有gus报道基因的载体上，利用农杆菌瞬时表达方法，证明Cs9g12620.1基因启动子可以被PthA4激活。以柑橘基因组为模板，设计 引物 5’- TC GA AT TC GA CT AAG AC TT TG GGG GC AT -3’和 5’-TCGGATCCTGATGAAGCAACTAGGATGAATA-3’，克隆Cs9g12620.1基因的启动子序列到携带gus报道基因的植物双元表达载体pCAMBIA1381中；以pUFR034:pthA4质粒为模板，设计引物5’-TGCAAGCTTATGGATCCCATTCGTTCGCGCACA-3’和5’-CCATGCATGCACTGCCTCCACTG-3’克隆带有酶切位点HindIII和SphI的pthA4基因5’端828  bp片段、设计引物5’-TTTGCATGCATTCGCCGATTCGCT-3’和5’-TGCTCTAGATCACTGAGGCAATAGCTCCAT-3’克隆带有酶切位点SphI和XbaI的 pthA4基因3’端380 bp片段，将这两片段分别用HindIII和SphI、SphI和XbaI酶切后，连接到用HindIII和XbaI酶切后的pHB载体上得到重组质粒，用BamHI分别酶切此重组质粒和pUFR034:pthA4质粒，分别回收重组质粒中切下的带BamHI的pHB载体和pUFR034:pthA4质粒酶切下的5’和3’端均带有BamHI的pthA4部分片段，并将两酶切产物连接，构建成pHB：pthA4质粒。将pCAMBIA1381：Cs9g12620.1和pHB：pthA4质粒分别转化农杆菌GV3101；将2株农杆菌分别组合，共同注射烟草植物叶片，以单独注射携带启动子构建的农杆菌处理为对照，根据(Hu, Y., Zhang, J., Jia, H., Sosso, D., Li, T., Frommer, W.B., Yang, B., White, F.F., Wang, N., and Jones, J.B. 2014. Lateral organ boundaries  1 is a disease susceptibility gene for citrus bacterial canker disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, E521-529.)的方法，检测结果显示Gus活性被PthA4蛋白诱导显著增强（见图3），证明PthA4激活Cs9g12620.1基因启动子并转录。

[0023] 实施例3

[0024] 在柑橘叶片上过量诱导Cs9g12620.1基因产生溃疡症状。

[0025] 本实施例在寄主柑橘叶片上过量诱导在柑橘寄主上分别单独诱导pthA4基因和Cs9g12620.1基因，均可以产生溃疡的症状。以柑橘基因组为模板，设计引物5’-TGCTGCAGATGGCTTGGTTTCTCTCTCTT-3’和5’-TCGAGCTCCTATCGGAGAGGAAGAACACTAA-3’，克隆Cs9g12620.1基因到植物双元表达载体pHB；将得到的重组质粒与实施例2中的pHB：pthA4分别转化农杆菌GV3101；将得到的农杆菌分别在柑橘叶片上注射接种，4天后，接种叶均出现溃疡症状（见图4）。证明，该基因的过量表达可以直接导致柑橘发生柑橘溃疡病，这为防治柑橘溃疡病提供了极大的应用前景。

[0026] 产业上的可利用性

[0027] 培育柑橘抗病品种是控制柑橘溃疡病的有效策略，采用基因编辑手段对Cs9g12620.1启动子区中能与PthA4结合的序列进行修饰，提高柑橘对溃疡病的抗性，在柑橘产业的抗病育种中的有着极大的应用前景。

[0028] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。