利用可溶解膜进行化学反应的方法及包括可溶解膜的检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种利用可溶解膜进行化学反应的方法，包括：a)制备包括一种或多种反应物的可溶解膜，包括：i)将所述一种或多种反应物与所述可溶解膜的成膜高分子聚合物配制成均匀液体，以及ii)让所述均匀液体形成膜状物；以及b)让所述可溶解膜加入反应体系，其中所述反应体系含有能够溶解所述可溶解膜的溶剂，所述溶剂溶解所述可溶解膜，导致所述可溶解膜中的所述一种或多种反应物释放至所述反应体系中，参与化学反应。本发明还提供了采用可溶解膜的检测试剂盒。本发明将可溶解膜作为化学试剂和/或生物分子的载体，能够大大提高实验效率，尤其在采用试剂卡的医学检测方面有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种利用可溶解膜进行多步骤化学反应的方法，包括：

a)制备多个包括一种或多种反应物的可溶解膜，包括：

i)将所述一种或多种反应物与所述可溶解膜的成膜高分子聚合物配制成均匀液体，以及ii)让所述均匀液体形成膜状物；

b)所述多步骤化学反应在包括有多个附属容器的反应容器中进行，所述附属容器与所述反应容器内部在结构上通过通道彼此相通，其中在所述通道上设置空白可溶解膜，并且将至少一个所述可溶解膜置于所述附属容器中；以及c)让所述可溶解膜和空白可溶解膜加入反应体系，

其中所述反应体系含有能够溶解所述可溶解膜和空白可溶解膜的溶剂，所述溶剂溶解所述可溶解膜和空白可溶解膜，导致所述可溶解膜中的所述一种或多种反应物释放至所述反应体系中，参与化学反应；所述空白可溶解膜用于延迟所述空白可溶解膜之后的可溶解膜与所述反应体系中的溶剂接触。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述可溶解膜为水溶性膜，所述溶剂为水。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述反应物的至少一种为酶。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述可溶解膜的厚度为1nm至1mm。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述可溶解膜的成膜高分子聚合物选自聚乙烯醇系列、纤维素衍生物、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基壳聚糖及其组合。

6.一种检测试剂盒，包括多种反应物，其中所述反应物分别固化在可溶解膜中，所述可溶解膜能够在接触待检测样品时溶解并释放固化在其中的反应物，所述检测试剂盒还包括具有反应腔的试剂卡，所述试剂卡的反应腔包括有附属腔室，所述附属腔室与所述反应腔内部在结构上通过通道彼此相通，其中在所述通道上设置有空白可溶解膜，并且至少一个所述可溶解膜被置于所述附属腔室中。

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其中所述反应物的至少一种为酶。

8.如权利要求6所述的检测试剂盒，其中所述可溶解膜的成膜高分子聚合物选自聚乙烯醇系列、纤维素衍生物、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基壳聚糖及其组合。

9.如权利要求6所述的检测试剂盒，其中所述待检测样品为全血、血清、血浆、或尿液，所述可溶解膜为水溶性膜。

说明书

利用可溶解膜进行化学反应的方法及包括可溶解膜的检测试

剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及进行化学反应的方法，尤其是利用可溶解膜来进行化学反应的方法。本发明还涉及包括可溶解膜的检测试剂盒。

背景技术

[0002] 工业上，在进行化学反应时常常对某些反应物加入到反应体系的方式有一些要求。例如，对于非常剧烈的化学反应，往往需要通过控制反应物的加入速度来控制反应的剧烈程度；对于多步骤的化学反应，需要按时间顺序加入不同的反应物。在自动化的反应设备中，一般采用专用的加样装置来加入这些反应物。为了方便定量，一些固体反应物可能需要以溶液形式加入，但某些反应物在溶液状态不稳定，这就需要在加入反应体系前临时配制。另外，一些反应物本身不太稳定，在加入反应体系前还要考虑如何保存。

[0003] 在生物学反应中，也经常遇到这方面的问题，包括不同反应物的加入时机，加入量，加入速度，加入顺序，等等。然而，例如在医学检测中，一般是希望将用于检测的反应物全部预先加入到反应容器中，再通过向反应容器中加入待检样品，等反应结束后就直接或间接读取检测结果，因为在反应前临时加入反应物或者在反应过程中加入反应物都会增加操作难度和增加检测仪器的复杂性。但这往往会遇到一些问题，例如，在生物学检测中，经常会用到具有生物活性的酶(包括蛋白酶以及非蛋白酶类)，而该酶可能在该检测反应的条件下不稳定，并不适合提前加入到反应容器中。还有一些检测反应需要分多步进行，这种情况下，也不适合将所有的检测用反应物都提前加入到反应容器中。微流控芯片(或微流控试剂卡)目前在医学检测中的应用越来越广泛，其可以大大减少样品消耗，提高检测效率，但其同样存在反应物如何加入以及反应物在反应腔内如何保存的问题。

发明内容

[0004] 为了克服上述问题，本发明在一方面提供了一种利用可溶解膜进行化学反应的方法，包括：

[0005] a)制备包括一种或多种反应物的可溶解膜，包括：

[0006] i)将所述一种或多种反应物与所述可溶解膜的成膜高分子聚合物配制成均匀液体，以及

[0007] ii)让所述均匀液体形成膜状物；以及

[0008] b)让所述可溶解膜加入反应体系，

[0009] 其中所述反应体系含有能够溶解所述可溶解膜的溶剂，所述溶剂溶解所述可溶解膜，导致所述可溶解膜中的所述一种或多种反应物释放至所述反应体系中，参与化学反应。

[0010] 优选地，所述可溶解膜为水溶性膜，所述溶剂为水。

[0011] 在一些实施方案中，所述反应物的至少一种为酶。

[0012] 在一些实施方案中，所述可溶解膜的厚度为1nm至1mm。

[0013] 在一些实施方案中，所述可溶解膜为多个，分别包括不同的反应物。

[0014] 在一些实施方案中，所述多个可溶解膜具有不同的溶解时间，使得所述多个可溶解膜在同时接触所述溶剂时其中包括的反应物能够以不同的时间释放至所述反应体系中。

[0015] 在一些实施方案中，所述方法还包括让所述多个可溶解膜在反应容器中分层排列，使得所述反应体系中的溶剂依次溶解所述多个可溶解膜，从而让所述多个可溶解膜中的反应物依次释放至所述反应体系中。

[0016] 在一些实施方案中，所述方法还包括在分层排列的所述多个可溶解膜之间加入一个或多个空白可溶解膜，用于延迟所述空白可溶解膜之后的可溶解膜与所述反应体系中的溶剂接触。

[0017] 在一些实施方案中，所述化学反应在包括有附属容器的反应容器中进行，所述附属容器与所述反应容器内部在结构上通过通道彼此相通，其中在所述通道上设置空白可溶解膜，并且将可溶解膜的至少一个置于所述附属容器中，由此通过所述空白可溶解膜溶解所需的时间来延迟所述附属容器内可溶解膜与所述反应体系中的溶剂接触。

[0018] 在一些实施方案中，所述化学反应在试剂卡的反应腔内进行，步骤b)还包括将所述可溶解膜置于所述试剂卡的反应腔内。

[0019] 在另一方面，本发明还提供了一种检测试剂盒，其包括一种或多种反应物，其中至少一种反应物固化在可溶解膜中，所述可溶解膜能够在接触待检测样品时溶解并释放固化在其中的反应物。

[0020] 在一些实施方案中，所述可溶解膜为多个，分别固化有不同的反应物。

[0021] 在一些实施方案中，所述反应物的至少一种为酶。

[0022] 在一些实施方案中，所述试剂盒还包括试剂卡，所述可溶解膜位于所述试剂卡的反应腔内。

[0023] 在一些实施方案中，多个可溶解膜在所述反应腔内分层排列。

[0024] 在一些实施方案中，在分层排列的多个可溶解膜之间还包括一个或多个空白可溶解膜。

[0025] 在一些实施方案中，所述试剂卡的反应腔包括有附属腔室，所述附属腔室与所述反应腔内部在结构上通过通道彼此相通，其中在所述通道上设置有空白可溶解膜，并且所述可溶解膜的至少一个置于所述附属腔室中。

[0026] 在一些实施方案中，所述可溶解膜的成膜高分子聚合物选自聚乙烯醇系列、纤维素衍生物、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基壳聚糖及其组合。

[0027] 在一些实施方案中，所述待检测样品为全血、血清、血浆、或尿液。

[0028] 本发明将可溶解膜作为化学试剂和/或生物分子的载体，可以有效控制这些反应物加入反应体系的顺序和加入速度；可以将各种反应物都预先加入并保存在反应容器中；可以有效防止反应物在期望的反应发生之前互相干扰，这些都有利于实验操作和实验器材的简化，能够大大提高实验效率，尤其在采用试剂卡的医学检测方面有广阔的应用前景。

附图说明

[0029] 图1显示了本发明可溶解膜的溶解时间和膜厚度的关系曲线。

[0030] 图2为本发明钙离子检测用可溶解膜在37℃加速不同时间后的复溶检测液对不同钙离子浓度样品的检测结果的折线图。

[0031] 图3为本发明钙离子检测用可溶解膜的复溶检测液对不同钙离子浓度血清样品检测结果的折线图，提示检测结果与钙离子浓度具有线性关系，并且与对比检测液的检测结果一致。

[0032] 图4为本发明尿素检测用可溶解膜在37℃加速不同时间后的复溶检测液对血清样品中尿素浓度检测结果的折线图。

[0033] 图5为本发明尿素检测用可溶解膜的复溶检测液对血清样品中不同尿素浓度的血清样品检测结果的折线图，提示检测结果与尿素浓度具有线性关系，并且与对比检测液的检测结果一致。

[0034] 图6为肌酐检测用成分单试剂保存和采用本发明可溶解膜的双试剂37℃加速保存导致的空白吸光度变化的折线图。

[0035] 图7为采用本发明可溶解膜分开保存肌酐检测用成分，在复溶后检测样品中肌酐含量的计算机软件截图。

具体实施方式

[0036] 除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

[0037] 本文中所用的“膜”、“薄膜”或“膜状物”是指通过成膜高分子聚合物形成的片层状结构，其厚度通常比长度和宽度小得多。在成膜高分子聚合物的选择方面，一般选择水溶性高分子材料，并且可以根据需要选择使用中性高分子材料、酸性高分子材料或碱性高分子材料。该高分子材料应该在化学性质方面较为稳定，不会与可能与其接触的反应物或待检测物发生化学反应。该高分子材料可以与蛋白以微弱的分子间作用力结合，能有效地吸附蛋白，而在该高分子材料形成的膜溶解时蛋白又易于解离。另外，希望该高分子材料的溶液在不同浓度均具有较佳的成膜性能。适合的成膜高分子聚合物例如包括，但不限于，聚乙烯醇系列(聚乙烯醇1788、聚乙烯醇2088、聚乙烯醇2280、聚乙烯醇2488，改性聚乙烯醇等)、纤维素衍生物(羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙级甲基纤维素)、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基壳聚糖等中的一种或者几种的组合。溶液状态的高分子材料可以采用多种合适的方法形成膜状物，例如，采用吹塑法、流延法、静电纺丝法等。在成膜时，可以向溶液状态的高分子材料溶液中加入一定量的反应物(例如，化学试剂、酶、抗体等)，这样，在形成的膜中就包括或夹带有该反应物。具体步骤例如可以包括：将反应物(试剂或者酶)配成一定浓度的缓冲溶液，再将成膜高分子聚合物配成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照所需的比例共混，最后，采用常用的成膜方法，例如，吹塑法、流延法、静电纺丝法等，形成不同厚度的薄膜。吹塑法主要步骤包括：将流体加热挤出，形成管坯吹胀成型，再冷却、牵引、卷取；流延法主要步骤包括：用一定尺寸的刮刀将液体平铺在水平不锈钢板或玻璃板上，然后干燥成膜；静电纺丝是一种纤维薄膜制造工艺，主要步骤包括：将聚合物溶液在强电场中进行喷射纺丝，在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形(即"泰勒锥")，并从圆锥尖端延展得到纤维细丝，再喷到接收器上形成薄膜。所形成的膜状物经过干燥，就可以进行长期保存。反应物在膜中的含量可以通过控制成膜前该反应物与成膜高分子聚合物的混合比例来控制。

[0038] 由上述可溶性高分子材料形成的薄膜在接触溶剂(例如水)时可以完全或部分溶解，在本文中也称为“可溶解膜”。仅由成膜高分子聚合物自身形成的薄膜，由于其中不包括在膜溶解后可加入反应体系中的反应物，本文中将这种膜称为“空白可溶解膜”。

[0039] 所形成的可溶解膜或空白可溶解膜的厚度可以为1nm至1mm或者更厚，优选10nm至0.5mm，例如约20nm、100nm、500nm、2μm、10μm、50μm、100μm。

[0040] 本文中采用的术语“反应物”泛指可以夹带在膜中并且在膜溶解后可以进入到反应体系的物质。“反应物”可以例如是化学试剂(包括缓冲剂)或诸如酶、抗体、核酸引物等的生物分子。应理解的是，“反应物”为反应体系中所需的物质，但不一定在加入反应体系后本身发生化学变化。

[0041] 由成膜高分子聚合物形成的膜的“溶解”一般包括两个阶段：溶胀和溶解。溶胀是指溶剂分子扩散进入膜的内部，使其体积膨胀。随着溶剂分子的不断渗入，溶胀的高分子材料体积不断增大，大分子链段运动增强，直至整个大分子逐渐进入溶液中，形成热力学稳定的均相体系，即完全溶解。夹带有反应物的可溶解膜在溶胀阶段，不会导致反应物从可溶解膜释放，只有可溶解膜继续溶解，反应物才逐渐释放。由于反应物是在可溶解膜溶解后才能释放出来，在本文中也称反应物“固化”在可溶解膜中。成膜高分子聚合物聚合单体本身的性质(例如亲水性)、聚合度、对聚合物分子的后续处理(例如聚乙烯醇的醇解度)以及形成的膜的厚度等都可以影响溶胀时间。因而，可以通过控制可溶解膜的溶胀时间(以及完全溶解时间)来控制其中夹带的反应物进入反应体系的时间。这在一些多步骤的反应中是尤其有利的。例如，可以将夹带有不同反应物的两种可溶解膜预先放置或保存在反应容器中，通过向反应容器中加入含水液体(例如，待检血清或血浆)引起膜溶解，如果这两种膜的溶胀时间有足够的差异，则可以实现一种膜(快速溶解膜)内的反应物完全释放并发生反应产生反应产物后，另一种膜(慢速溶解膜)内的反应物才开始释放，并与之前产生的反应产物进行反应。例如，A膜溶胀时间为10s，溶解时间为5s，那么选取溶胀时间为40s，溶解时间为45s的B膜，就可以实现在A膜溶解以后B膜片才开始溶解的目的。

[0042] 空白可溶解膜也可以用于控制同一反应容器内不同膜的溶解时间，从而控制这些膜内反应物的释放时间，这可以以多种方式实现。在一些实施方案中，可以让多个膜分层放置在反应容器(例如试管、离心管、试剂卡的反应腔)内，并在这些膜之间加入一个或多个空白可溶解膜。在向反应容器内加入含溶剂(例如水)的液体时，利用空白可溶解膜溶解所需的时间来控制其下方可溶解膜(或后续可溶解膜)接触溶剂的时间。在另一些实施方案中，可以在反应容器(尤其是试剂卡的反应腔)内设置一个或多个与反应容器内部相通的附属容器或附属腔室，将含有反应物的可溶解膜分别置于不同的附属容器内，然后以具有不同溶解时间的(例如不同厚度的)空白可溶解膜封闭附属容器与反应容器内部之间的通道。这样，在向反应容器内加入可导致空白可溶解膜和附属腔室内可溶解膜溶解的溶剂时，不同腔室内的反应物会以不同的时间加入到反应体系中。通过上述方式都可以实现让反应物依次释放或者延迟其中一种或多种反应物释放的目的。

[0043] 显然，将不同的反应物保存在不同的可溶解膜中，可防止它们相互接触，这对于保存可能互相干扰(发生不希望的反应)的反应物是尤其有利的。

[0044] 以可溶解膜的形式向反应容器内加入反应物来代替直接向反应容器加入反应物有诸多优点，例如包括但不限于以下方面：

[0045] 1.可以在进行反应前将反应物全部加入反应容器中，或者将这些反应物一直保存在反应容器中，而无需在反应之前临时或反应过程中分别加入各种反应物。这大大简化了操作步骤，提高了效率。特别在每个操作都要被重复多次甚至几千次的分析实验中，这种简化就非常有必要。通过将不同的反应物保存在不同的可溶解膜中，可以解决按不同时间向反应体系释放反应物的问题，也可以防止有干扰的反应物互相接触；

[0046] 2.微流控试剂卡目前在基础研究和医学检测方面都有广泛应用，但如何让反应物有序地参与反应一直是个有待解决的关键问题，而本发明通过让可溶解膜分层排列、加入空白可溶解膜、或控制不同可溶剂膜的溶解时间等方式可有效解决这个问题；

[0047] 3.对于一些过于剧烈的化学反应，经常需要通过控制反应物的加入速度来控制反应的剧烈程度，例如，可能将一些试剂通过滴加的方式加入。本发明可以通过以膜的溶解速度来控制反应物的释放，起到了与向反应体系缓慢加入反应物相同的效果；

[0048] 4.可溶解膜为固体，可以将现有的加入液体形式反应物转换为加入固定体积的膜，而在已知可溶解膜厚度的情况下，又可以将特定量反应物的加入转换为加入特定面积的可溶解膜。可溶解膜本身的厚度可以控制得很薄(直至纳米级)，通过切割加入特定面积的膜代替微量液体的加入，可以大大提高加样精度。

[0049] 相应地，利用上述可溶解膜，本发明提供了一种检测试剂盒，其尤其可用于生物医学检测方面。这里所用的术语“试剂盒”除了包括用于进行检测反应的反应物之外，还可包括用来进行检测反应的反应容器。包括有反应物的可溶解膜可以预置在反应容器中(例如对于微流控试剂卡的情况)，也可以与反应容器分开放置。这些可溶解膜以干燥状态保存，只有在待检样品与这些可溶解膜接触后才发生检测反应。应理解的是，试剂盒不必包括用于进行检测反应的全部反应物，例如一些实验室常用化学试剂可以不包括在试剂盒内。试剂盒还可以包括对其中的反应物进行说明以及阐述试剂盒如何使用的说明书。

[0050] 以下通过具体实施例来进一步说明本发明。

[0051] 实施例1制备含尿素酶的可溶解膜

[0052] (1)称取0.9g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)固体，加入7mL的水溶解，然后用琥珀酸的饱和溶液调节pH＝8.0，定容至10mL；

[0053] (2)称取0.1695g酮戊二酸钠，0.0355g二磷酸腺苷(ADP)，0.01064g NADH，量取35μl谷氨酸脱氢酶(GLDH，10U/μl)，200μl尿素酶(20U/μl)，用步骤(1)配制的缓冲液溶解并定容至10mL，于2-8℃冰箱内保存，备用；

[0054] (3)量取0.25mL的2％(wt)聚乙烯醇1788(聚合度1700，醇解度88％)溶液，向其中加入0.2mL步骤(2)配制的混合溶液，共混均匀，通过流延法成膜。

[0055] 实施例2制备含可溶解膜的钙离子检测试剂盒

[0056] (1)称取0.1164g偶氮砷III，0.2903g 8-羟基喹啉，0.3g Brij-35，用pH7.0的Tris-HCl缓冲液溶解并定容至200mL；

[0057] (2)量取0.25mL的2％聚乙烯醇1799(聚合度1700，醇解度99％)溶液，加入0.2mL步骤(1)制备的混合溶液，共混均匀，采用吹塑法成膜；

[0058] (3)将得到的膜切成小块后放于试剂卡的反应腔内，并真空密封保存。

[0059] 实施例3制备含可溶解膜的肌酐检测试剂盒

[0060] (1)称取3.65g的TAPS，用70g水溶解，然后用6mol/L的氢氧化钠调节pH值为8.1，定容至100mL；

[0061] (2)称取0.53g的DHBS，0.039g的肌酐酶(3000U，200KU/2.59g)，用步骤(1)的缓冲液溶解并定容至10mL，于2-8℃冰箱内保存；

[0062] (3)称取0.01g的4-氨基安替比林，0.0017g的亚铁氰化钾，0.0459g的肌酸酶(50KU/1.53g)，0.001g的抗坏血氧化酶(100KU/0.633g)，0.01836g的肌氨酸氧化酶(50KU/1.53g)，量取40μl的过氧化物酶(10U/μl)，用步骤(1)配制的缓冲液定容至10mL，于冰箱内保存；

[0063] (4)量取0.125mL的2％聚乙烯醇溶液(聚乙烯醇2280，聚合度2200，醇解度80％)，加入0.1mL步骤(2)配制的混合溶液，共混均匀，静电纺丝成膜；

[0064] (5)量取0.125mL的2％聚乙烯醇溶液(聚乙烯醇2280，聚合度2200，醇解度80％)，加入0.1mL步骤(3)配制的混合溶液，共混均匀，静电纺丝成膜；

[0065] (6)将步骤(4)和步骤(5)中得到的膜切割后分层放置于试剂卡的同一个反应腔内，并真空密封保存。

[0066] 实施例4可溶解膜的溶解时间

[0067] 以改性聚乙烯醇(聚乙烯醇1788，聚合度1700，醇解度88％)为成膜高分子聚合物，制备不同厚度的可溶解膜，绘制膜厚度和完全溶解所需时间的曲线(温度为25℃)，参见图1。

[0068] 从图中可以看出当可溶解膜的厚度从10-100μm逐渐增加时，溶解时间(包括溶胀过程和后续的溶解过程)呈现出从几秒到1分钟逐渐增加的趋势，所以控制可溶解膜的厚度，就可以控制可溶解膜的溶解时间，也就可控制其中包含的反应物的释放速率，最终可以通过可溶解膜的厚度来控制该反应物加入反应体系的时间。

[0069] 实施例5通过使用不同溶解时间的可溶解膜来控制反应时间

[0070] (1)取0.5g，10％的聚乙烯醇1788(以pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制)，添加0.01g的NADH，制备厚度为50μm的薄膜A(溶胀时间10s，完全溶解时间15s)；

[0071] (2)取0.5g，10％的聚乙烯醇2099(以pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制)，添加0.01gα-酮戊二酸、尿素酶8KU、谷氨酸脱氢酶700U制备厚度为50μm的薄膜B(溶胀时间40s，完全溶解时间45s)；

[0072] (3)将薄膜A和B放入反应容器中，加入纯水及少量尿素样本，然后在340nm测试不同时间吸光度的变化。

[0073] 结果发现在0-15s内A膜逐渐溶解，溶液吸光度增加至1.3，在15-40s内溶液吸光度稳定在1.3左右，而在45s以后，吸光度急剧下降。所以利用高分子量和高醇解度的聚乙烯醇来增加溶胀时间，可以很好地控制两个薄膜内反应物加入反应体系的时间间隔。

[0074] 实施例6通过添加空白可溶解膜来控制反应时间间隔

[0075] (1)取0.5g，10％的聚乙烯醇1788(聚合度1700，醇解度88％)溶液，制备厚度为100μm的空白薄膜R(溶解时间95s)；

[0076] (2)取0.5g，10％的聚乙烯醇1788(聚合度1700，醇解度88％)，添加0.001g柠檬黄制备厚度为50μm的薄膜A(溶解时间15s)；

[0077] (3)取0.5g，10％的聚乙烯醇1788(聚合度1700，醇解度88％)，添加0.001g考马斯亮蓝制备厚度为50μm的薄膜B(溶解时间15s)；

[0078] (4)按照从下到上的顺序依次将薄膜B，空白薄膜R和薄膜A平铺在空白试剂卡的反应腔中(具体的平铺操作例如可以这样进行：先将三层膜从下到上依次平铺在玻璃板上，裁剪成与反应腔内径相同的圆形，接着在膜的边缘涂上胶水(例如502胶)，并迅速将三层膜放入反应腔中，让膜周边的胶水在膜边缘和反应腔内壁间固化)，然后向反应腔内滴加去离子水；

[0079] (5)观察溶液颜色变化的时间。

[0080] 发现在10s时A膜开始溶解，溶液变为黄色，15s时全部溶解，溶液为黄色，在110s左右时B膜开始溶解，溶液开始显现绿色并逐渐加深，在125s时B膜完全溶解，溶液变为绿色。说明空白可溶解膜的使用可以很好地控制B薄膜内染料化合物向溶液体系释放的时间间隔。

[0081] 实施例7含化学试剂的可溶解膜的加速稳定性试验

[0082] 在含有8-羟基喹啉的反应体系中，镁离子被掩蔽，偶氮砷III与钙离子反应形成紫色络合物，在波长为650nm处有一吸收峰，反应液650nm处的吸光度与钙离子浓度在一定范围内成正比，可用于检测血清中钙离子浓度。

[0083] 采用实施例2制备的钙离子检测试剂盒进行本实施例钙离子浓度的检测。在检测实验前对所形成的可溶解膜于37℃进行不同时间的处理。检测时加水溶解可溶解膜，得到复溶检测液。同时配制具有相同浓度检测成分的对比检测液，其中不含成膜聚合物(聚乙烯醇)。所检测的血清样品中钙离子浓度分别为1.51mM、2.50mM和4.03mM。检测时加入的血清样品体积与复溶检测液或对比检测液的体积比为1:100。结果显示在表1、图2和图3中。

[0084] 表1血清样品中钙离子浓度检测结果(650nm处吸光度)

[0085]

[0086] 可溶解膜经过37℃加速，对含不同浓度钙离子的血清样品的检测结果稳定，平均值分别为1.2574、1.4168、1.6386，组内CV分别为1.4％、1.2％、1.0％。与不经成膜过程的原液体试剂(对比检测液)相比，检测结果均升高，升高值为聚乙烯醇产生的本底吸光度，但检测结果吸光度值与样品浓度依然呈线性。扣除本底吸光度后的结果与原液体试剂的检测结果一致。

[0087] 实施例8含酶的可溶解膜的加速稳定性试验

[0088] 尿素在尿素酶催化下，水解生成铵离子和二氧化碳。铵离子在α-酮戊二酸和还原型辅酶I(NADH)存在下，经GLDH催化，生成谷氨酸，同时，NADH被氧化成NAD+，可在340nm波长处检测吸光度下降速率，在一定范围内吸光度下降速率与尿素浓度成正比，可用于检测血清或血浆中尿素浓度。

[0089] 采用实施例1制备的可溶解膜进行本实施例尿素浓度的检测。检测时加水溶解可溶解膜，得到复溶检测液。同时配制具有相同浓度检测成分的对比检测液，其中不含成膜聚合物(聚乙烯醇)。所检测的血清样品中尿素浓度分别为2.05mM、5.10mM、和14.95mM。检测时加入的血清样品体积与复溶检测液或对比检测液的体积比为1:100。结果显示在表2、图4和图5中。

[0090] 表2血清样品中尿素浓度检测结果(吸光度下降速率ΔA/min)

[0091]

[0092] 尿素酶干燥成膜后进行加速实验，重新溶解后测定低中高值样本，结果平均值分别为0.01428、0.02975、0.08541，组内CV分别为1.9％、1.7％、1.8％，尿素酶在干燥成膜后酶活比较稳定(在7天加速试验期间酶活基本上无变化)。与未干燥酶试剂(对比检测液)相比，反应速度略所下降，下降值分别为0.00467、0.00515、0.01314，表明在干燥成膜过程中尿素酶活性有所下降，但样本浓度依然与反应速度成正比，对试剂检测结果无影响。

[0093] 实施例9试剂稳定性对比试验

[0094] 肌酐在肌酐酶的催化下水解生成肌酸。在肌酸酶的催化下肌酸水解生成肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化生成甘氨酸、甲醛和过氧化氢，最后偶联Trinder反应，比色法测定，反应形成的色素与肌酐浓度成正比，可用于检测血清或血浆中的肌酐浓度。

[0095] 肌酐检测所用的试剂成分：4-AAP(0.5mM)，DHBS(2mM)，肌酐酶(30KU/L)，肌酸酶(15KU/L)，肌氨酸氧化酶(6KU/L)，过氧化物酶(400U/L)，抗坏血酸氧化酶(1.5KU/L)。

[0096] 第一种方式(单试剂)是将以上试剂成分配制成液体单试剂，在37℃条件下保温，在520nm波长下检测试剂空白吸光度(即检测试剂自身吸光度)的变化。第二种方式(双试剂)是将试剂成分中的DHBS(2mM)单独配制成溶液，加入1％PVA1788成膜，而将其他试剂成分配制溶液，加入1％PVA1788成膜，得到含不同试剂成分的两种可溶解膜(双试剂)。将这两种膜放置在同一离心管里于37℃条件下保温，在不同时间加水溶解后同样在520nm测定空白吸光度。结果如图6所示。可见液体单试剂在37℃条件下试剂吸光度随时间不断升高，这会使检测结果偏高。以可溶解膜形式存在的双试剂组分在加水溶解后吸光度高于单试剂，但这部分为聚乙烯醇本底吸收。在加速测试时间范围内，双试剂溶解后吸光度无明显变化。

[0097] 双试剂组分加水溶解后对肌酐溶液样品进行检测，时间扫描结果显示能够正常显色(检测仪器为上海元析UV8000，软件为UV-vis analyse)，见计算机软件截图(图7)。说明将检测试剂中的组分以可溶解膜的形式干燥保存可以提高试剂稳定性。

[0098] 本发明所属领域技术员应理解，以上描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。