一种诊断和监测口腔癌的新方法转让专利
申请号 : CN201710330835.7
文献号 : CN108872578B
文献日 : 2021-07-02
发明人 : 关晓兵 , 周宇 , 陈莉
申请人 : 首都医科大学附属北京口腔医院 , 北京捷腾生物科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.检测唾液外泌体的试剂在制备监测口腔白斑向口腔癌转化的方法中使用的试剂或试剂盒中的用途,所述方法包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度,其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示白斑伴有异常增生,需要严密监视,但唾液外泌体的浓度相对于正常人显著下降,提示口腔白斑已从异常增生向口腔癌转化;
所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
2.检测唾液外泌体的试剂在制备预测口腔白斑向口腔癌转化风险的方法中使用的试剂或试剂盒中的用途,所述方法包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度,其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示口腔白斑向口腔癌转化的风险增大;
所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
3.权利要求2的用途,其中唾液外泌体的浓度由相对于正常人显著升高转变为相对于正常人显著下降提示口腔白斑已从异常增生转化为口腔癌的可能。
4.检测唾液外泌体的试剂在制备辅助诊断口腔白斑所处病理阶段的方法中使用的试剂或试剂盒中的用途,所述方法包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度,其中所述唾液外泌体的浓度相对于正常人无显著差异,提示口腔白斑处于单纯增生阶段,所述唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高,提示口腔白斑伴有异常增生,所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
5.权利要求4的用途,其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
6.检测唾液外泌体中miRNA185的水平的试剂在制备疑似口腔白斑的辅助鉴别方法中使用的试剂或试剂盒中的用途,所述方法包括测定唾液外泌体中miRNA185的水平,其中该水平比正常人显著下降提示受试者罹患口腔白斑的可能。
7.权利要求6的用途,包括对测定结果为miRNA185水平显著下降的受试者进一步测定所述受试者唾液外泌体的浓度来确定口腔白斑所处病理阶段,其中外泌体的浓度与正常人相比无显著差异提示所述受试者的口腔白斑处于单纯增生阶段,唾液外泌体浓度相对于正常人显著升高提示受试者的口腔白斑伴有异常增生,唾液外泌体的浓度相对于正常人显著降低,提示受试者的口腔白斑已转化为口腔癌的可能。
8.权利要求7的用途,其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
说明书 :
一种诊断和监测口腔癌的新方法
技术领域
变高风险患者,及时对其实施治疗措施,实现口腔癌的早期、有效防治。
背景技术
[1‑2]
见,其五年生存率约为35‑57%,每年约有13万口腔癌患者死亡 。口腔癌主要发生于中老
年人。尽管近年来在诊断技术、外科手术以及化疗、放疗方面取得了进步,但不幸的是患者
的5年存活率仍然徘徊在50%左右。有效防治口腔癌的关键在于正确识别具有恶变潜能的
口腔疾病,也称癌前病变。如果能够做到早期正确诊断、持续监测、及时干预,则对于口腔癌
的预防和治疗具有重要意义。
黑斑及色素痣等,其中口腔白斑被公认为口腔斑纹疾病中最典型的癌前病变之一,其癌变
率高达10‑36%。
病变。口腔黏膜白斑常见于中老年人群,好发于唇、颊、舌、腭等黏膜上,一般无自觉症状,初
起时呈乳白色斑块,表面光滑、平或稍高出正常黏膜。白斑从癌前病变到发展为口腔癌可以
经历几年到十几年,其癌变的过程也是一个多阶段、多步骤的过程,都要经历增生→鳞状上
[3‑4]
皮化生→轻度、中度、重度异常增生→原位癌→浸润癌的演变 ,而且大部分口腔白斑可
长期处于良性状态不发生癌变,只有少部分经历癌前病变、癌前状态发展成癌。近年来,口
腔癌发病率有增高及明显年轻化的趋势。尽管对口腔癌的外科手术、放疗及化疗技术在不
断进步,但患者的5年存活率仍然不到50%。其中肿瘤局限者5年生存率大约为80%,而发生
[5]
转移者则下降到20% 。
做到正确诊断、持续监测和早期发现。如果口腔癌患者能够早期诊断并得到及时治疗,其预
后会大大改善。因此如何争取早期发现口腔癌变的蛛丝马迹就成为众多学者研究的热点。
果。仅凭临床检查是不能判断是否有癌变倾向的,还需要组织病理学检查进一步确诊。
于操作者的经验以及刷取细胞的数量、部位等。
目前口腔科常用的是甲苯胺蓝,但其假阳性率高,容易出现误诊。
应用的主要是VELscope技术,VELscope发射出一种蓝色激光,波长在400‑460nm之间,它可
以激发口腔组织自体荧光团中的绿色荧光。这种光学上的改变,可以揭露黏膜细胞的新陈
代谢、生物化学和结构信息,并且可以定位区域癌变。目前这项技术的应用都是基于已经在
病理活检确定存在口腔黏膜的异常增生或癌变的条件下,所以还需要进一步的临床验证。
成区嗜银蛋白、Ki 67 Mi b-1、端粒酶等;2.与细胞凋亡相关的标志物,如Bcl-2/Bax,
Survivin,环氧化物酶2等。;3.特异性基因,如p53基因及其表达产物;4.染色体畸变,如微
[6]
卫星标志及杂合性缺失、DNA含量等 。Mendez等发现,与正常组织相比,口腔癌中有314个
[7]
基因表达有差异,其中239个基因表达上调,75个基因表达下调 。越来越多的研究显示唾
液中的生物标记物与口腔癌的发生和发展以及预后相关,然而口腔癌的生物标志物目前还
没有一个或一组的指标能获得公认的可靠效果。
是切取活检。病变的高危相不一定均匀分布,须观察可疑点,必要时多位点活检。
测而言,组织病理学检查因其需要反复获取活体组织而难以用作常规的监测手段。
[8]
一旦由口腔黏膜白斑转变为口腔鳞状细胞癌,其5年的生存率不到50% 。因此,需要寻找
一种能准确及时监测白斑向口腔癌转化的方法,这种方法不仅需要反映病变转化的动态过
程,而且要易于实施,患者能够接受。
度相对于正常人差异不显著;但白斑进展到异常增生阶段时,唾液外泌体的浓度相对于正
常人明显升高,差异显著;一旦异常增生转化为口腔癌,唾液外泌体的浓度相对于正常人反
而明显下降,并且差异显著。伴随白斑从单纯增生、异常增生到癌变的病理变化,患者唾液
外泌体的浓度发生先升高后降低的动态变化过程。这一发现提示可以通过测定患者唾液外
泌体的浓度监测白斑的不同病理阶段的转化,同样,可以通过定期监测患者唾液外泌体的
浓度来监测白斑向口腔癌转化的病理过程。唾液外泌体的浓度有望成为诊断白斑和口腔
癌、以及预测白斑癌变风险、监测白斑癌变过程等的新方法。
发明内容
者唾液外泌体的浓度,判断出病变所处的状态(阶段),做出相适应的随访计划和治疗方案。
同时,通过监测受试者唾液外泌体的浓度,对口腔白斑的癌变趋势做出判断,及时发现口腔
癌高风险患者,并对其进行适宜的治疗。
密监视,但唾液外泌体的浓度相对于正常人显著下降,提示口腔白斑已从异常增生向口腔
癌转化。
的风险增大。
单纯增生阶段,所述唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高,提示口腔白斑伴有异常增
生,所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔
癌。
人相比无显著差异提示所述受试者的口腔白斑处于单纯增生阶段,唾液外泌体浓度相对于
正常人显著升高提示受试者的口腔白斑伴有异常增生,唾液外泌体的浓度相对于正常人显
著降低,提示受试者的口腔白斑已转化为口腔癌的可能。
受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
的浓度,其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示白斑伴有异常增生,需要严密
监视,但唾液外泌体的浓度相对于正常人显著下降,提示口腔白斑已从异常增生向口腔癌
转化。
泌体的浓度,其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示口腔白斑向口腔癌转化的
风险增大。
外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者罹患口腔癌的可能。
泌体的浓度,其中所述唾液外泌体的浓度相对于正常人无显著差异,提示口腔白斑处于单
纯增生阶段,所述唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高,提示口腔白斑伴有异常增生,
所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
该水平比正常人显著下降提示受试者罹患口腔白斑的可能。
度与正常人相比无显著差异提示所述受试者的口腔白斑处于单纯增生阶段,唾液外泌体浓
度相对于正常人显著升高提示受试者的口腔白斑伴有异常增生,唾液外泌体的浓度相对于
正常人显著降低,提示受试者的口腔白斑已转化为口腔癌的可能。
插页,所述包装插页上带有通过检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度辅助诊断口腔癌的
方法的说明,所述方法包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度,其中所述受试者唾液
外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
页,所述包装插页上带有通过监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度监测口腔白斑向口
腔癌转化的方法的说明,所述方法包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度,其中唾
液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示白斑伴有异常增生,需要严密监视,但唾液外
泌体的浓度相对于正常人显著下降,提示口腔白斑已从异常增生向口腔癌转化。
插页,所述包装插页上带有通过监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度预测口腔白斑向
口腔癌转化风险的方法的说明,所述方法包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度,
其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示口腔白斑向口腔癌转化的风险增大。
测受试者唾液外泌体的浓度筛查口腔癌的方法的说明,所述方法包括检测受试者唾液外泌
体的浓度,其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者罹患口腔癌
的可能。
页,所述包装插页上带有通过检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度辅助诊断口腔白斑所
处病理阶段的方法的说明,所述方法包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度,其中所
述唾液外泌体的浓度相对于正常人无显著差异,提示口腔白斑处于单纯增生阶段,所述唾
液外泌体的浓度相对于正常人显著升高,提示口腔白斑伴有异常增生,所述受试者唾液外
泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
插页上带有通过测定唾液外泌体中miRNA185的水平辅助鉴别疑似口腔白斑的方法的说明,
所述方法包括测定唾液外泌体中miRNA185的水平,其中该水平比正常人显著下降提示受试
者罹患口腔白斑的可能。
与正常人相比无显著差异提示所述受试者的口腔白斑处于单纯增生阶段,唾液外泌体浓度
相对于正常人显著升高提示受试者的口腔白斑伴有异常增生,唾液外泌体的浓度相对于正
常人显著降低,提示受试者的口腔白斑已转化为口腔癌的可能。
是指有形态学变化并具有癌变潜在可能性的口腔病变,临床上多见为口腔上皮性癌前病
变,例如临床常见的白斑、红斑、扁平苔藓、盘状红斑狼疮、黏膜下纤维性变、乳头状瘤、慢性
溃疡、黏膜黑斑及色素痣等。
患(Potentially Malignant Disorders,PMD)范畴,不包括吸烟、局部摩擦等局部因素去除
后可以消退的单纯性过角化病。本发明的口腔白斑也简称为白斑。
表现为:上皮增生,有过度正角化或过度不全角化,或者两者同时出现为混合角化;上皮单
纯性增生为良性病变,表现为上皮过度正角化,粒层明显和棘层增厚,没有非典型细胞。上
皮钉突可伸长且变粗,但仍整齐且基底膜清晰。固有层和黏膜下层中有淋巴细胞、浆细胞浸
润。白斑伴异常增生或称为白斑的异常增生阶段,恶变潜能随上皮异常增生程度的增加而
增加。上皮异常增生的组织病理变化为:上皮基底细胞极性消失;出现一层以上基底样细
胞;核浆比例增加;上皮钉突呈滴状;上皮层次紊乱;有丝分裂象增加,可见少数异常有丝分
裂;上皮浅表1/2出现有丝分裂;细胞多形性;细胞核浓染;核仁增大;细胞黏着力下降;在棘
细胞层中单个或成团细胞角化;根据上述项目出现的数目分为轻、中、重度上皮异常增生。
细胞间桥,在癌巢的中央可出现层状角化物,为角化珠或癌珠。分化较差的鳞状细胞癌无角
化珠形成,甚至也无细胞间桥,瘤细胞呈明显的异型性并见较多的核分裂象。
关的蛋白质、miRNA及mRNA等物质。外泌体既可以通过质膜受体直接激活受体细胞,也可以
转运蛋白质、mRNA、miRNA甚至细胞器进入受体细胞内,同时也可以携带处于不同病理状态
下的细胞所含有的特殊“信息”,进入体液(包括唾液,血液等),从而在生理学和病理学上都
发挥着重要作用。
态,利用流式细胞仪来分析细胞表面标记,通过蛋白免疫印迹(Western blot)和ELISA等方
法对蛋白进行分析,或通过qPCR和新一代测序(NGS)来分析RNA,包括检测miRNA及mRNA等物
[10]
质 。
附图说明
E‑钙粘蛋白以及波形蛋白表达出现异常,统计分析发现,正常口腔黏膜,口腔白斑单纯增
生,白斑伴异常增生以及口腔癌组织(早期浸润)中E‑钙粘蛋白表达水平明显降低,相反波
形蛋白表达水平逐渐增加,其染色强度随着正常黏膜转移至癌症的发展而逐渐增强,组间
差异有统计学意义(P<0.01)。
明显增加,而且AKT表达水平逐渐升高为正常黏膜组的500%。文献报道PI3K/AKT信号通路
活化诱导EMT的发生。此实验结果证实,E‑钙粘蛋白表达水平随着正常黏膜转移至口腔癌的
发展而逐渐降低,相反波形蛋白表达量明显升高(P<0.001)。
皮细胞核和包浆中出现强棕紫色反应,miR‑185表达呈现强阳性;在口腔黏膜白斑单纯增
生、白斑伴异常增生以及口腔癌病例中,miR‑185表达显著减弱;在口腔癌病例中,miR‑185
在癌上皮组织中表达消失。
染色后可见囊泡有完整的包膜,其内有低电子致密物,其直径大小约在100纳米左右(图
5A)。通过动态光散射发现收集、纯化的样品大小为108nm且通过ζ电位分析发现其具有高净
负电荷(图5B)。通过蛋白免疫印迹检测发现这些颗粒表达外泌体特异性结构蛋白CD81、
CD63或Foltillin‑1(图5C)。
自口腔黏膜白斑单纯增生、白斑伴异常增生、口腔癌患者唾液外泌体的miR‑185相对正常人
显著减少。
转化过程中的动态变化。
见如图1所示。
蛋白(Vimentin)实施免疫组化检测:加入抗E‑钙粘蛋白抗体(5μg/ml,Abcam,Cambridge,
MA)或抗‑波形蛋白抗体(1:500,Abcam,Cambridge,MA),4℃条件反应过夜,随后在室温下,
与Alexa 568山羊抗兔IgG(1:1000,Invitrogen,Carlsbad,CA)和Alexa 488
山羊抗小鼠IgG(1:1000,Invitrogen,Carlsbad,CA)温育1小时。接下来,将细胞封固于含有
DAPI的Vectashield封固溶液(Vector Laboratories,Burlingame,CA)中,并通过共焦激光
显微镜(LSM510,Carl Zeiss Co.Ltd,Jena,Germany)进行检查。
500;Abcam)抗体、抗磷酸化AKT(1:5000;Abcam)抗体或抗磷酸化PI3K(1:500;Abcam)抗体进
行免疫印迹,干燥后暴露至X射线胶片(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)。剥离
上述印迹并与抗β‑肌动蛋白(1:2,000;Abcam)温育以确认各实验中所装载的样品量相同。
液在55℃洗涤。如下述检测探针:使用单克隆抗地高辛碱性磷酸酶抗体(1:800)(Roche,
Indianapolis,IN USA)温育60分钟,随后在30℃条件下,使用硝基蓝四唑和5‑溴‑4‑氯‑3'‑
多聚磷酸盐底物(Roche)温育2小时。最终,使用Nuclear Fast RedTM复染色切片,使用
培养基(VWR,Radnor,PA)封固,并通过共聚焦显微镜检查。
异有统计学意义(P<0.05),参见图2。
中上皮细胞获得间充质、成纤维细胞样特征,并且细胞间粘附下降,运动增强。
度逐渐增强,从分子水平上证明从白斑向口腔癌转化的过程中伴有EMT事件的发生。这些实
验样品的分子水平上的发现和这样实验样品来源的患者的临床和病理诊断相吻合。
0.01),E‑钙粘蛋白表达水平逐渐降低,相反波形蛋白表达量明显升高(P<0.001),见图3。
表达水平明显降低,相反波形蛋白表达水平逐渐增加,其染色强度随着正常黏膜转移至癌
症的发展而逐渐增强,组间差异有统计学意义(P<0.01)。
下调,波形蛋白上调,伴随EMT发生。这些实验样品的分子水平上的发现和这样实验样品来
源的患者的临床和病理诊断相吻合。
分上皮细胞核和包浆中出现轻微棕紫色反应,miR‑185表达呈现轻微阳性,或者miR‑185表
达几乎消失,见图4。
常对照显著下降。
纯化口腔唾液外泌体。
心管中,4℃保存。
000×g离心得到外泌体集合团,并用PBS洗涤一次,再以100,000×g,4℃离心1小时,然后即
时用于实验或‑80℃保存备用。
室温下干燥后,将此铜网置于透射电镜的样品室内,观察外泌体形态并拍摄电镜照片。
中的蛋白质通过湿转法转移至硝酸纤维素膜上,室温下用含5%脱脂牛奶的封闭液封闭处
理1h,经1XTBST缓冲液洗脱后,加入CD81、CD63以及Flottilin 1单克隆抗体于4℃条件下反
应过夜,再次洗脱后,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,于室温下平缓摇动1h。经
1XTBST缓冲液洗膜3次后,用化学发光底物(ECL,Thermo Fisher Scientific.)进行检测。
的说明书通过微小RNA矩阵分析获得的转录物并通过qRT‑PCR进行验证。将qRT‑PCR标准化
至U6snRNA引物。
完整的双层脂质膜结构,其内有低电子致密物,其直径大小约在100纳米左右,参见图5A。
见图6A。来自口腔黏膜白斑(单纯增生)、白斑伴有异常增生、口腔癌患者唾液外泌体的
miR185(核苷酸序列:5’uggagagaaaggcaguuccuga 3’)相对正常人显著下降,参见图6B。此
发现表明外泌体携带miR‑185疾病信息,存在于唾液中,从而检测唾液外泌体携带的miR‑
185可以用来区分正常和患有口腔疾病患者,所述患有口腔疾病患者例如患有口腔黏膜白
斑(单纯增生)、白斑伴有异常增生、口腔癌患者。
速视频拍摄和颗粒追踪软件的NanoSight LM10系统(NanoSight,Wiltshire,United
Kingdom)测量布朗运动的速率进而分析外泌体制备物的大小分布并对其定量。在400μl的1
×PBS/5mM EDTA溶液中稀释经纯化的外泌体,之后将样品注射入NanoSight样品室,确定外
泌体的平均值±SD大小分布。
没有显著性差异;而疾病发展至白斑伴有异常增生阶段,唾液中携带的外泌体含量显著升
高,和正常人相比呈现显著差异;而一旦发生恶变,转化为口腔癌后,唾液中携带外泌体含
量反而下降,其下降程度和正常人相比差异显著,具有统计学意义。唾液中携带外泌体含量
随着白斑(单纯增生)向异常增生、癌变的发展总体呈现一个先升高后下降的动态变化过
程,参见图7。唾液外泌体的含量随白斑的单纯增生向异常增生和癌变的变化而变化,无疑
可用来指示疾病的病理发展和变化,辅助口腔黏膜白斑(单纯增生)、白斑伴有异常增生和
口腔癌的诊断。
外泌体的含量也可以预测口腔癌发生的风险,如果外泌体含量持续升高预示着口腔癌变的
风险逐渐增大(图8A),如果外泌体的含量从升高转为下降(图8B),提示白斑病变已发生癌
变的可能性。
斑伴有异常增生的患者和口腔癌患者中唾液外泌体携带的miR‑185比正常人显著下降,有
统计学意义。这一发现可用来将正常人与患有白斑、异常增生或口腔癌的患者分开。例如,
在体检或口腔疾病筛查过程中,在无法判断受试者黏膜为正常或患有白斑时,可以检测受
试者唾液外泌体中miR‑185水平,如果受试者唾液外泌体中miR‑185水平比正常人显著下
降,提示受试者患有白斑,从而对白斑疑似患者有辅助诊断意义。
泌体含量。如果唾液外泌体含量相对于正常人无显著差异,提示患者患有白斑(单纯增生);
如果唾液外泌体含量相对于正常人显著升高,表明白斑伴有异常增生,而相对于正常人显
著降低,提示白斑发生癌变。
22.
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