一种用于肝癌干细胞的鉴定方法

摘要

本发明提供了一种用于肝癌干细胞的鉴定方法。本发明研究发现，在特定诱导条件下，LCSC会在胞内或胞外表达专有的保护性蛋白；基于这种有益的发现，本发明进一步考察了此类蛋白的特异性及其序列特征，从中筛选得到2种与肝癌细胞和常规肝脏细胞具有良好特异性的蛋白片段，实验验证表明，该蛋白仅在LCSC中稳定表达而普通肝癌细胞中并无存在，因而可作为鉴定LCSC的标志物。在此基础上，本发明以保证该蛋白片段的表达量和稳定性为目标优化了细胞诱导方法，以该方法统一对细胞检材进行诱导，不仅可保证标志物蛋白的稳定表达，而且表达量与LCSC细胞含量呈现出良好的线性关系；基于这一规律，可实现LCSC细胞含量的相对定量分析。

权利要求

1.一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取剔除了L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸以及甘氨酸的MEM培养基作为细胞培养基，在CO2培养箱中，将待测细胞团在所述细胞培养基中以28℃的温度避光培养16h；

2)配制同时含有以下成分的水溶液作为诱导剂：HuEPO 25μg/L，聚氧乙烯月桂醚80μg/L，聚乙烯吡咯烷酮40μg/L，壳聚糖200μg/L，氯化钠1mg/L，对羟基苯甲酸乙酯mg/L，BSA150μg/L，磷酸盐缓冲液1mg/L；取步骤1)所得产物，收集细胞团，接入所述诱导剂中，以35℃的温度在厌氧、避光条件下保持24h；

3)取步骤2)所得产物，以15kHz的频率超声破碎8min，收集产物以2000rpm的转速离心

5min，收集液相，向其中加入4倍体积的、浓度为95％的乙醇，混合均匀后向其中加入氯仿-甲醇溶液于室温下浸泡；收集沉淀物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液即为总蛋白溶液；

4)向步骤3)得到的总蛋白溶液中加入二硫苏糖醇孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于33℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物；通过生物质谱分析所述酶解产物中序列为NCIPDWPGAGPFAMGYAVLYGDPD的蛋白片段含量或序列为QNFYDKAALMGTPQKVYTQNDGLRAVVTN的蛋白片段含量。

2.根据权利要求1所述的一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于步骤1)所述的细胞培养基在使用前用碳酸氢钠或醋酸调整其pH为7.2，并用0.22μm孔径的除菌滤膜过滤后再使用。

3.根据权利要求1所述的一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于步骤1)中，在避光培养的过程中CO2培养箱内CO2浓度为8％。

4.根据权利要求1所述的一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于步骤2)中所述的厌氧条件是通过氮气保护实现的；步骤2)在厌氧、避光保持的过程中对盛装有细胞和诱导剂的容器持续震荡。

5.根据权利要求1所述的一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于步骤2)所述的诱导剂中还包括80μg/L的乙二胺四乙酸二钠和20μg/L的ZSTK474。

6.根据权利要求1所述的一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于所述氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:3；所述氯仿-甲醇溶液的加入量为浓度为

95％乙醇的加入量的0.2～0.6倍。

7.根据权利要求1所述的一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于步骤3)中所述蛋白提取溶液是含有以下成分的水溶液：12.5％Tris-HCl、2％SDS、5％β-巯基乙醇、20％丙三醇、0.05％溴酚蓝；其中所述Tris-HCl的pH值为6.8。

8.根据权利要求1所述的一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于步骤3)对沉淀物的干燥是在常温条件下进行真空干燥。

9.根据权利要求1所述的一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于步骤4)中胰蛋白酶的加入量为6000IU/g。

10.根据权利要求9所述的一种用于肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定方法，其特征在于在加入6000IU/g胰蛋白酶的同时，加入2500IU/g的木瓜蛋白酶，而后再进行孵育。

说明书

一种用于肝癌干细胞的鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及干细胞技术领域，进一步涉及肿瘤干细胞的分子生物学检测技术，具体涉及一种用于肝癌干细胞的鉴定方法。

背景技术

[0002] 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下它可以分化成成为多种功能细胞。干细胞由于其增殖和分化的特性在细胞替代和组织再生治疗方面中被寄予厚望，不仅可以用于神经退行性病变、糖尿病等由明确细胞类型病变所致的疾病治疗，还能够通过组织工程和器官再造技术用于组织修复和器官移植，及新药开发、基因治疗、免疫调控治疗等领域。癌干细胞又称为肿瘤干细胞，是指具有干细胞性质的癌细胞，也就是具有自我复制以及具有多细胞分化等能力。通常这类的细胞被认为有形成肿瘤，发展成癌症的潜力，特别是随着癌症转移后，产生新型癌症的来源。癌干细胞存在于癌细胞中，是癌症复发和转移的元凶。由于存在数量极少，因此很难被发现，抗癌药物也很难对其产生效果。

[0003] 现有技术研究认为，在慢性肝病介导下或肝细胞的再生过程中，正常肝干细胞的基因表达及遗传调控发生异常而导致肝癌干细胞(LCSC)产生；此外，肝细胞所处微环境的改变，导致正常肝脏细胞脱分化也是产生肝癌干细胞的因素之一。LCSC关系到肝癌起病、进展及治疗的预后。目前，如何有效分离出LCSC，并在此基础上实现对肝癌的靶向治疗将是临床上对于肝癌诊疗的重点。

[0004] 现有技术中，对LCSC的分离鉴定主要依靠其表面的特异性标志物，这些分子一部分是与正常干细胞细胞表面抗原相同，一部分是其特异的细胞表面抗原，这些标志物在其他正常细胞表面均不表达或低表达。目前已有ABCG2(ATP binding cassette superfamily G member 2)、甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、乙醛脱氢酶、CDl3、CDl33、CD24、CD34、CD44、CD47、CD90(Thy-1)、C-kit(CDll7)、细胞角蛋白7(cytokeratin，CK7)、CKl9、上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、DLKl(delta-like 1 homologue)、1B50-1、ICAM-1、OV6、SALL4等近20种分子表面标志物用于LCSC的分离鉴定。尽管在微观层面具有确切的理论依据，但由于LCSC含量极小，其标志物的表达量更低，因此很难从人体组织中直接测定，需要先分离目标细胞，进行富集培养后再执行检测。因此，这种方法只能用于目标细胞的分离鉴定，而难以用于临床诊断。此外，虽然目前能够鉴定分离LCSC的细胞表面标志物有很多，但单独表达几种分子不能成为鉴定LCSC的依据，在检测准确性方面还有待提升。

发明内容

[0005] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于肝癌干细胞的鉴定方法，以解决现有技术中以细胞表面标志物为依据的检测方法操作繁琐。

[0006] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于肝癌干细胞的快速检测试剂盒，以解决现有技术中以细胞表面标志物为依据的检测方法准确率较低。

[0007] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

[0008] 一种用于肝癌干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：

[0009] 1)取剔除了L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸以及甘氨酸的MEM培养基作为细胞培养基，在CO2培养箱中，将待测细胞团在所述细胞培养基中以28℃的温度避光培养16h；

[0010] 2)配制同时含有以下成分的水溶液作为诱导剂：HuEPO 25μg/L，聚氧乙烯月桂醚80μg/L，聚乙烯吡咯烷酮40μg/L，壳聚糖200μg/L，氯化钠1mg/L，对羟基苯甲酸乙酯mg/L，BSA150μg/L，磷酸盐缓冲液1mg/L；取步骤1)所得产物，收集细胞团，接入所述诱导剂中，以
35℃的温度在厌氧、避光条件下保持24h；

[0011] 3)取步骤2)所得产物，以15kHz的频率超声破碎8min，收集产物以2000rpm的转速离心5min，收集液相，向其中加入4倍体积的、浓度为95％的乙醇，混合均匀后向其中加入氯仿-甲醇溶液于室温下浸泡；收集沉淀物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液即为总蛋白溶液；

[0012] 4)向步骤3)得到的总蛋白溶液中加入二硫苏糖醇孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于33℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物；通过生物质谱分析所述酶解产物中序列为NCIPDWPGAGPFAMGYAVLYGDPD的蛋白片段含量或序列为QNFYDKAALMGTPQKVYTQNDGLRAVVTN的蛋白片段含量。

[0013] 作为优选，步骤1)所述的细胞培养基在使用前用碳酸氢钠或醋酸调整其pH为7.2，并用0.22μm孔径的除菌滤膜过滤后再使用。

[0014] 作为优选，步骤1)中，在避光培养的过程中CO2培养箱内CO2浓度为8％。

[0015] 作为优选，步骤2)中所述的厌氧条件是通过氮气保护实现的；步骤2)在厌氧、避光保持的过程中对盛装有细胞和诱导剂的容器持续震荡。

[0016] 作为优选，步骤2)所述的诱导剂中还包括80μg/L的乙二胺四乙酸二钠和20μg/L的ZSTK474。

[0017] 作为优选，所述氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:3；所述氯仿-甲醇溶液的加入量为浓度为95％乙醇的加入量的0.2～0.6倍。

[0018] 作为优选，步骤3)中所述蛋白提取液是含有以下成分的水溶液：12.5％Tris-HCl、2％SDS、5％β-巯基乙醇、20％丙三醇、0.05％溴酚蓝；其中所述Tris-HCl的pH值为6.8。

[0019] 作为优选，步骤3)对沉淀物的干燥是在常温条件下进行真空干燥。

[0020] 作为优选，步骤4)中胰蛋白酶的加入量为6000IU/g。

[0021] 作为优选，在加入6000IU/g胰蛋白酶的同时，加入2500IU/g的木瓜蛋白酶，而后再进行孵育。

[0022] 本发明所提供的方法用于鉴定待测细胞培养物中是否含有肝癌干细胞，并在相对水平上给出不同检材中所含肝癌干细胞的含量关系。本发明所提供的方法明确限定为对肝癌干细胞的非诊断目的的鉴定或检测方法，所述非诊断目的包括但不限于对肝癌干细胞的药物实验目的或对肝癌干细胞的分离纯化目的。在以上技术方案中，所述待测细胞团是将待测的细胞培养物去除液体培养基成分后的产物。

[0023] 本发明提供了一种用于肝癌干细胞的鉴定方法，该技术方案首先围绕肝癌干细胞的代谢特性进行了针对性研究，发现其与普通肝癌细胞在蛋白表达方面具有显著差异，尤其在特定诱导条件下，LCSC会在胞内或胞外表达专有的保护性蛋白。基于这种有益的发现，本发明进一步考察了此类蛋白的特异性及其序列特征，从中筛选得到2种与肝癌细胞和常规肝脏细胞具有良好特异性的蛋白片段，实验验证表明，该蛋白仅在LCSC中稳定表达而普通肝癌细胞中并无存在，因而可作为鉴定LCSC的标志物。

[0024] 在此基础上，本发明以保证该蛋白片段的表达量和稳定性为目标优化了细胞诱导方法，以该方法统一对细胞检材进行诱导，不仅可保证标志物蛋白的稳定表达，而且表达量与LCSC细胞含量呈现出良好的线性关系；基于这一规律，可实现LCSC细胞含量的相对定量分析。应用本发明，可从普通肝癌细胞中有效检出LCSC，并实现初步定量，相较于利用细胞表面分子标记检测的方法，本发明准确性高、操作便捷，具有良好的应用前景。

附图说明

[0025] 图1是本发明实施例1中，检测实验组S1中序列为SEQ ID NO.1的蛋白片段含量的LC-MS结果图。

[0026] 图2是本发明实施例1中，检测实验组S1中序列为SEQ ID NO.2的蛋白片段含量的LC-MS结果图。

[0027] 图3是本发明实施例1中，检测实验组S2中序列为SEQ ID NO.1的蛋白片段含量的LC-MS结果图。

[0028] 图4是本发明实施例1中，检测实验组S2中序列为SEQ ID NO.2的蛋白片段含量的LC-MS结果图。

[0029] 图5是本发明实施例1中，同时检测实验组S3中序列为SEQ ID NO.1的蛋白片段含量、序列为SEQ ID NO.2的蛋白片段含量的LC-MS结果图。

[0030] 图6是本发明实施例1中，LCSC细胞相对含量与序列为SEQ ID NO.1蛋白片段含量之间的标准曲线图。

[0031] 图7是本发明实施例1中，LCSC细胞相对含量与序列为SEQ ID NO.2蛋白片段含量之间的标准曲线图。

具体实施方式

[0032] 以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

[0033] 实施例1

[0034] 一、材料与方法

[0035] 1.1、LCSC细胞系的构建

[0036] 取人肝癌细胞系HepG2细胞，用添加10％胎牛血清、1％双抗的DMEM培养基于5％CO2培养箱中37℃培养。将培养至指数期的HepG2细胞用胰酶消化后，再用含20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、10ng/mL肝生长因子、b27、1％甲基纤维素和1％双抗的DMEM/F12培养基重悬，将细胞悬液以2000细胞/mL种入低黏附的12孔板，于5％CO2培养箱中37℃培养。10～15天形成直径200μM左右微囊球。获得富集的肿瘤干细胞模型。

[0037] 用流式细胞分选仪对细胞进行流式细胞分选。肝癌细胞首先用抗CD133单克隆抗体进行标记，然后经PBS洗涤并重悬于含2％胎牛血清的PBS中等待分选。分别将前20％表达CD133最强的细胞框选为CD133+的肝癌干细胞，将后20％表达CD133最弱的细胞框选为CD133-的非肝癌干细胞。用CD133细胞分选试剂盒对细胞进行磁珠分选。分选出的细胞纯度用流式细胞仪鉴定。

[0038] 1.2、实验分组

[0039] 取以上第1.1节所制备的LCSC细胞作为实验组S1；取HepG2细胞作为实验组S2；取以上第1.1节所制备的LCSC细胞与HepG2细胞按细胞数等比例混合，作为实验组S3；取以上第1.1节所制备的LCSC细胞以及HepG2细胞混合，得到其中含有LCSC细胞浓度分别为5％、10％、30％、50％、70％、90％、100％的细胞混合物，作为实验组群Q1。

[0040] 1.3、细胞钝化处理

[0041] 对上述实验组S1、S2、S3以及实验组群Q1的每个样品，分别执行以下第1.3～1.5节的实验步骤：配制MEM培养基，在配制过程中剔除L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸以及甘氨酸，在CO2培养箱中，分别将上述实验组在所述细胞培养基中以28℃的温度避光培养16h。

[0042] 1.4、细胞诱导

[0043] 配制同时含有以下成分的水溶液作为诱导剂：HuEPO 25μg/L，聚氧乙烯月桂醚80μg/L，聚乙烯吡咯烷酮40μg/L，壳聚糖200μg/L，氯化钠1mg/L，对羟基苯甲酸乙酯mg/L，BSA150μg/L，磷酸盐缓冲液1mg/L；取第1.3节所得产物，收集细胞团，接入所述诱导剂中，以35℃的温度在厌氧、避光条件下保持24h。1.5、蛋白提取与序列分析

[0044] 取以上第1.4节所得产物，以15kHz的频率超声破碎8min，收集产物以2000rpm的转速离心5min，收集液相，向其中加入4倍体积的、浓度为95％的乙醇，混合均匀后向其中加入氯仿-甲醇溶液于室温下浸泡；收集沉淀物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液即为总蛋白溶液；

[0045] 向得到的总蛋白溶液中加入二硫苏糖醇孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于33℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物；通过生物质谱分析所述酶解产物中序列为NCIPDWPGAGPFAMGYAVLYGDPD(SEQ ID NO.1)的蛋白片段含量或序列为QNFYDKAALMGTPQKVYTQNDGLRAVVTN(SEQ ID NO.2)的蛋白片段含量。

[0046] 其中，对S1组分别检测SEQ ID NO.1的蛋白片段含量以及SEQ ID NO.2的蛋白片段含量，实验结果如图1、图2所示。对S2组分别检测SEQ ID NO.1的蛋白片段含量以及SEQ ID NO.2的蛋白片段含量，实验结果如图3、图4所示。对S3组同时检测SEQ ID NO.1的蛋白片段含量以及SEQ ID NO.2的蛋白片段含量，实验结果如图5所示。对Q1组群的若干样品，先检测其中SEQ ID NO.1的蛋白片段含量，并将该蛋白片段含量与LCSC细胞在样品中含量的对应关系绘制成图，实验结果如图6所示；而后对Q1组群的若干样品，检测其中SEQ ID NO.2的蛋白片段含量，并将该蛋白片段含量与LCSC细胞在样品中含量的对应关系绘制成图，实验结果如图7所示。

[0047] 二、实验结果

[0048] 1、蛋白片段特异性实验结果

[0049] 如图1～2所示，在以LCSC细胞为检测对象的实验组S1中，可确切获得SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的峰；与此相对应的，图3和图4中，在上述蛋白片段处均未出峰，这与实验组S2为普通肝癌细胞HepG2的事实相对应，由此可以证明，本方法及所确定的标志性蛋白片段具有良好的特异性。此外，图5示出了对实验组S3的检测结果，尽管S3组由LCSC细胞和HepG2细胞混合而成，但并未影响SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2蛋白片段的检出，由此可证明HepG2的存在对肝癌干细胞的鉴定结果未产生影响，因此，本发明方法可用于从常规肝癌细胞中鉴定肝癌干细胞的存在。

[0050] 2、相对定量分析实验结果

[0051] 如图6、图7所示，对于已知LCSC细胞含量的一组实验对象，其SEQ ID NO.1蛋白片段(或SEQ ID NO.2蛋白片段)含量与LCSC细胞含量呈一次线性关系。基于这种规律，可用于计算不同生物检材中肝癌干细胞的相对含量关系，这种定量方法至少在10～90％的范围内具有较高的准确性。以上实验结果的原始数据如以下表1所示。

[0052] 表1特异性蛋白片段含量与LCSC细胞含量间对应关系

[0053]

[0054] 实施例2

[0055] 一种用于肝癌干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：

[0056] 1)取剔除了L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸以及甘氨酸的MEM培养基作为细胞培养基，在CO2培养箱中，将待测细胞团在所述细胞培养基中以28℃的温度避光培养16h；

[0057] 2)配制同时含有以下成分的水溶液作为诱导剂：HuEPO 25μg/L，聚氧乙烯月桂醚80μg/L，聚乙烯吡咯烷酮40μg/L，壳聚糖200μg/L，氯化钠1mg/L，对羟基苯甲酸乙酯mg/L，BSA150μg/L，磷酸盐缓冲液1mg/L；取步骤1)所得产物，收集细胞团，接入所述诱导剂中，以
35℃的温度在厌氧、避光条件下保持24h；

[0058] 3)取步骤2)所得产物，以15kHz的频率超声破碎8min，收集产物以2000rpm的转速离心5min，收集液相，向其中加入4倍体积的、浓度为95％的乙醇，混合均匀后向其中加入氯仿-甲醇溶液于室温下浸泡；收集沉淀物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液即为总蛋白溶液；

[0059] 4)向步骤3)得到的总蛋白溶液中加入二硫苏糖醇孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于33℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物；通过生物质谱分析所述酶解产物中序列为NCIPDWPGAGPFAMGYAVLYGDPD的蛋白片段含量或序列为QNFYDKAALMGTPQKVYTQNDGLRAVVTN的蛋白片段含量。步骤1)中，在避光培养的过程中CO2培养箱内CO2浓度为8％。步骤2)所述的诱导剂中还包括80μg/L的乙二胺四乙酸二钠和20μg/L的ZSTK474。所述氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:3；所述氯仿-甲醇溶液的加入量为浓度为95％乙醇的加入量的0.2～0.6倍。步骤3)中所述蛋白提取液是含有以下成分的水溶液：12.5％Tris-HCl、2％SDS、5％β-巯基乙醇、20％丙三醇、0.05％溴酚蓝；其中所述Tris-HCl的pH值为6.8。步骤4)中胰蛋白酶的加入量为6000IU/g。

[0060] 实施例3

[0061] 一种用于肝癌干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：

[0062] 1)取剔除了L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸以及甘氨酸的MEM培养基作为细胞培养基，在CO2培养箱中，将待测细胞团在所述细胞培养基中以28℃的温度避光培养16h；

[0063] 2)配制同时含有以下成分的水溶液作为诱导剂：HuEPO 25μg/L，聚氧乙烯月桂醚80μg/L，聚乙烯吡咯烷酮40μg/L，壳聚糖200μg/L，氯化钠1mg/L，对羟基苯甲酸乙酯mg/L，BSA150μg/L，磷酸盐缓冲液1mg/L；取步骤1)所得产物，收集细胞团，接入所述诱导剂中，以
35℃的温度在厌氧、避光条件下保持24h；

[0064] 3)取步骤2)所得产物，以15kHz的频率超声破碎8min，收集产物以2000rpm的转速离心5min，收集液相，向其中加入4倍体积的、浓度为95％的乙醇，混合均匀后向其中加入氯仿-甲醇溶液于室温下浸泡；收集沉淀物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液即为总蛋白溶液；

[0065] 4)向步骤3)得到的总蛋白溶液中加入二硫苏糖醇孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于33℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物；通过生物质谱分析所述酶解产物中序列为NCIPDWPGAGPFAMGYAVLYGDPD的蛋白片段含量或序列为QNFYDKAALMGTPQKVYTQNDGLRAVVTN的蛋白片段含量。步骤1)所述的细胞培养基在使用前用碳酸氢钠或醋酸调整其pH为7.2，并用0.22μm孔径的除菌滤膜过滤后再使用。步骤1)中，在避光培养的过程中CO2培养箱内CO2浓度为8％。步骤2)中所述的厌氧条件是通过氮气保护实现的；步骤2)在厌氧、避光保持的过程中对盛装有细胞和诱导剂的容器持续震荡。步骤2)所述的诱导剂中还包括80μg/L的乙二胺四乙酸二钠和20μg/L的ZSTK474。所述氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:3；所述氯仿-甲醇溶液的加入量为浓度为95％乙醇的加入量的0.2～0.6倍。步骤3)中所述蛋白提取液是含有以下成分的水溶液：12.5％Tris-HCl、2％SDS、5％β-巯基乙醇、20％丙三醇、0.05％溴酚蓝；其中所述Tris-HCl的pH值为6.8。步骤3)对沉淀物的干燥是在常温条件下进行真空干燥。步骤4)中胰蛋白酶的加入量为6000IU/g。
在加入6000IU/g胰蛋白酶的同时，加入2500IU/g的木瓜蛋白酶，而后再进行孵育。

[0066] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。