大车前苷在制备抗心肌肥大药物中的用途

摘要

本发明属于大车前苷抗心肌肥大的新用途，具体涉及大车前苷在制备抗心肌肥大药物中的应用。本发明采用异丙肾上腺素诱导小鼠动物心肌肥大模型及H9c2心肌细胞肥大模型，同时给予不同浓度的大车前苷进行干预，通过超声评价小鼠心脏功能，称量小鼠心脏重量，左心室重量，评价小鼠心肌肥大程度；采用荧光染色观测H9c2心肌细胞面积，结果表明大车前苷对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大具有保护作用，对异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大具有抑制作用。有望开发为抗心肌肥大药物应用于临床。

权利要求

1.大车前苷在制备抗心肌肥大药物中的用途，其特征在于：所述大车前苷为如下化学结构：

所述心肌肥大为异丙肾上腺素诱导的心肌肥大或异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大。

说明书

大车前苷在制备抗心肌肥大药物中的用途

[0001] 技术领域：本发明属于大车前苷抗心肌肥大的新用途，具体涉及大车前苷在制备抗心肌肥大药物中的应用。背景技术：

[0002] 随着社会经济的发展，我国居民生活方式发生了深入变更，特别是人口老龄化和城市化进程的加速，心血管病危险因素流行趋势非常明显，心血管疾病的发病率不断增加。心肌肥大(Cardiac hypertrophy)是心脏代偿功能的一种，肥大的特点主要表现为心肌细胞的增大、蛋白质合成的增加、肌纤维的增厚和“胚胎期”基因的重新表达，持续的心肌肥厚最终会导致扩张型心肌病、心力衰竭和猝死，是引起心血管疾病发病率和死亡率升高的独立危险因素之一。因此，探明心肌肥大发病机制，寻求防治心肌肥大的药物，减缓心血管疾病的发生刻不容缓。

[0003] 车前草又名车轮菜，为车前科多年生草本植物。生长在山野、路旁、花圃、河边等湿地。根茎短缩肥厚，密生须状根。传统功效为生干生寒，燥湿止泻，凉血止血，清热止带，退热止痛，退肿消痔等。大车前苷主要在车前草科植物中被发现，且大车前苷及酚类化合物是车前草的主要成分。很多体内外试验研究发现大车前苷具有很多生物活性，据报道，大车前苷具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、抗水肿、抑制环磷腺苷磷酸酶、预防糖尿病并发症等作用。然而，大车前苷对心肌肥大是否具有抑制作用国内外还鲜见报道。

[0004] 迄今为止，从车前草中已分离和鉴定出超过60种化合物，按主要结构可分为苯乙醇苷、黄酮、环烯醚萜、三萜及甾醇类等。大车前苷为苯乙醇苷类，结构如图1所示。目前已经有关于大车前苷的分离提纯报道了，本发明首次发现大车前苷具有明显的抗心肌肥大作用。发明内容：

[0005] 发明目的：本发明提供了大车前苷在抗心肌肥大方面的作用，对心肌肥大的治疗具有一定的临床意义，旨在将大车前苷再研究开发为新的抗心肌肥大药物。

[0006] 技术方案：

[0007] 大车前苷在制备抗心肌肥大药物中的用途，其特征在于：所述大车前苷为如下化学结构：

[0008]

[0009] 所述的大车前苷在制备抗心肌肥大药物中的用途，其特征在于：所述心肌肥大为异丙肾上腺素诱导的心肌肥大或异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大。

[0010] 优点及效果：

[0011] 本发明采用动物实验和细胞实验联合研究证明大车前苷对心肌肥大的抑制作用，结果表明大车前苷对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大具有保护作用，对异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大具有抑制作用。本发明发掘了大车前苷抗心肌肥大的前景，开拓了一个新的药用领域。附图说明：

[0012] 图1为大车前苷化学结构；

[0013] 图2-图4为大车前苷对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大解剖学数据的影响。

[0014] 图2中，与空白对照组相比，****P<0.0001；与模型组相比，##P<0.01(n＝10,mean±SD)。

[0015] 图3中，与空白对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01(n＝10,mean±SD)。

[0016] 图4中，与空白对照组相比，***P<0.001；与模型组相比，##P<0.01(n＝10,mean±SD)。

[0017] 图5为大车前苷对H9c2心肌细胞表面积的影响。其中，(A)显微镜下各组细胞的荧光图像(40倍)。(B)各组数据定量分析。与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；与ISO造模组相比，#p<0.05，##p<0.01。具体实施方式：

[0018] 本发明建立了异丙肾上腺素诱导小鼠心肌肥大及H9c2心肌细胞肥大的模型，同时给予大车前苷进行干预。小鼠实验中检测解剖数据中心脏重与体重比值、左室重与体重比值及心脏重与胫骨长比值的变化，并采用实验用超声设备检测心脏功能的改变；细胞实验中测定H9c2心肌细胞表面积的改变。结果表明大车前苷具有显著地抗心肌肥大作用，因此可用于抗心肌肥大药物的研究与开发。

[0019] 通过以下实验对本发明进行说明：

[0020] 实验1：大车前苷抗异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大。

[0021] 采用浓度为5mg/kg/d的异丙肾上腺素连续皮下注射9d的方法，建立小鼠心肌肥大模型。雄性BALB/c小鼠40只，随机分为4组，分别为：空白组，模型组，大车前苷低剂量组，大车前苷高剂量组。大车前苷低剂量组(10mg/kg)：尾静脉注射预给药3天后，同时皮下注射异丙肾上腺素5mg/kg/d，持续9天，共12天；高剂量大车前苷组(40mg/kg)：尾静脉注射预给药3天后，同时皮下注射异丙肾上腺素5mg/kg/d，持续9天，共12天；模型组：尾静脉注射与给药组等量的生理盐水3天后，同时皮下注射异丙肾上腺素5mg/kg/d，持续9天，共12天；空白组：尾静脉注射与给药组等量的生理盐水3天后，同时皮下注射与给药组等量的生理盐水，共12天。用脱毛膏对小鼠前胸心脏区域进行脱毛处理，然后用异氟烷麻醉，采用小动物超声机对小鼠进行心脏超声测定。最后，称取小鼠体重，用异氟烷麻醉小鼠后，分离小鼠心脏，左心室，胫骨，并用分析天平测定小鼠心脏及左心室重量，游标卡尺测定胫骨长度。

[0022] 小鼠解剖学数据显示：与空白组相比，模型组的左室重与体重比值及心脏重与胫骨长比值增加，有显著统计学差异。与模型组相比，大车前苷低剂量组对心脏重与体重比值、左室重与体重比值及心脏重与胫骨长比值无影响，而大车前苷高剂量组能较好的改善这些指标，且均具有显著统计学差异，结果见图2-图4。小鼠超声数据显示：与空白组相比，模型组小鼠左心室前壁厚度，后壁厚度，均明显增加，射血分数、缩短分数降低，并具统计学差异。与模型组相比，大车前苷改善了异丙肾上腺素对小鼠超声数据的影响，并呈现浓度依赖性，结果见表1。

[0023] 实验2：大车前苷抗异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大。

[0024] 采用免疫荧光试验测定大车前苷对异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞表面积的影响。

[0025] (1)仪器与试剂：高糖DMEM培养基(美国CORNING公司)胎牛血清(以色列Biological Industries公司)异丙肾上腺素(美国Sigma公司)胰蛋白酶(北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司)β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠二抗(美国Abcam公司)CO2培养箱(日本SANYO公司)净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)生物显微镜(日本奥林巴斯光学工业株式会社)低/高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

[0026] (2)细胞培养：用含10％胎牛血清的高糖DMEM进行培养H9c2心肌细胞。当心肌细胞融合到90％左右时，弃培养液，用PBS浸洗两次，而后弃PBS，加入0.25％胰酶消化细胞，放显微镜下观察，当细胞回缩变圆时，迅速加入含血清的DMEM培养液终止消化，用移液枪吹落心肌细胞，而后将细胞悬液转移至4mL离心管中，1000rpm条件下离心5分钟。弃上层培养液，并用新培养液重悬细胞，按需要接种于细胞培养瓶中，将细胞放入37℃、5％CO2培养箱培养。倒置显微镜下观察，H9c2心肌细胞呈长梭形，取长势良好的细胞用于实验。

[0027] (3)大车前苷对心肌细胞表面积的影响：取对数生长期的H9c2心肌细胞，将盖玻片放置到6孔培养板中，以1×103/mL密度接种于6孔培养板中，每孔加入2mL细胞悬液，放置37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养24h。实验分组：对照组、异丙肾上腺素组(10μmol/L)、异丙肾上腺素+大车前苷低剂量组(20μmol/L)、异丙肾上腺素+大车前苷中剂量组(40μmol/L)、异丙肾上腺素+大车前苷高剂量组(80μmol/L)，大车前苷与异丙肾上腺素同时给予，心肌细胞继续培养24h，每个浓度设3个复孔，实验重复3次；移液枪弃各孔培养液，每孔用1mL的PBS浸洗3次，每次3min；每孔加入1mL的4％多聚甲醛固定15min，吸弃4％多聚甲醛后每孔加入1mLPBS浸洗，重复3遍，每次3min；每孔加入1mL的0.5％Tritonx-100(PBS配制)，室温通透20min；吸弃0.5％的Tritonx-100后每孔加入1mL PBS浸洗3次，每次3min；每孔滴加200μL山羊血清，室温封闭30min；每孔滴加1mL稀释后的β-actin(1:200)，将6孔板放入湿盒中，4℃孵育过夜；PBS浸洗3次，每次3min；每孔滴加1mL稀释后的荧光二抗(稀释比例为1:200)，室温孵育1h。PBS浸洗3次，每次3min；每孔滴加200μL的DAPI进行复染细胞核，将6孔板放入湿盒中，室温避光孵育10min；PBS浸洗4次，每次5min；将适量甘油滴加到载玻片上，将盖玻片倒扣到载玻片的甘油上，随后用透明指甲油封固；显微镜下观察，每孔随机取5个视野拍照，用Image-ProPlus6.0软件测量细胞面积。

[0028] 结果如下：与正常对照组相比，异丙肾上腺素模型组的H9c2心肌细胞表面积明显增加，差异有显著统计学意义，大车前苷低、中、高三个浓度均能够减少ISO诱导的H9c2细胞表面积的增加，具有统计学意义，如图5所示。

[0029] 上述结果表明：大车前苷对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大及H9c2心肌细胞肥大均具有抑制作用。

[0030] 表1大车前苷对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大心脏超声数据的影响[0031]

[0032] 注：LVAW:Left ventricular anterior wall thickness；LVID:Left ventricular internal diameter；LVPW:Leftventricular posterior wall thickness；LV  Vol:Left  ventricular  volume；EF:Ejection  fraction；FS:
Fractionalshortening.s:systolic；d:diastolic.与空白对照组相比，*P<0.05，**P<
0.01，***P<0.001；与模型组相比#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001.(n＝6,mean±SD)。