高F值寡肽及其制备方法

摘要

本发明涉及一种高F值寡肽的制备方法，包括以下步骤：向酵母蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，在pH值为7.0～9.0条件下于45～55℃下进行酶解，得到酵母抽提液，其中，碱性蛋白酶的加入量为400～600U/g酵母蛋白；浓缩酵母抽提液，以去除酵母抽提液中分子量为500Da以下的分子，得到浓缩液；向浓缩液中加入α‑胰凝乳蛋白酶，在pH值为6.5～8.5条件下于35℃～45℃下酶解2～8h；灭酶后向酶解产物中加入羧肽酶A，在pH值为6.5～7.5条件下于35℃～45℃下酶解4～8h，灭酶后用活性炭吸附除杂，得到高F值寡肽。本发明方法简便、成本较低、原料来源充足、酶解过程可控，可制备出纯天然、易吸收的高F值生物活性寡肽。

权利要求

1.一种高F值寡肽，其特征在于，所述高F值寡肽的F值为30～40，所述高F值寡肽中分子量为180～1500Da的寡肽占总含量的66.42％，分子量小于180Da的占32.86％，所述高F值寡肽的制备方法包括以下步骤：(1)向酵母蛋白水溶液中加入碱性蛋白酶，所述酵母蛋白水溶液的浓度为160～250g/L，在pH值为7.0～9.0条件下于45～55℃下进行酶解，得到酵母抽提液，其中，所述碱性蛋白酶的加入量为400～600U/g酵母蛋白；

(2)浓缩所述酵母抽提液，以去除所述酵母抽提液中分子量为500Da以下的分子，得到浓缩液；浓缩前所述酵母抽提液的pH值控制为6.5～7.5，浓缩后液体体积与浓缩前液体体积之比为1:1.5～3；

(3)向所述浓缩液中加入α-胰凝乳蛋白酶，所述α-胰凝乳蛋白酶的加入量为4000～

6000U/g酵母蛋白，在pH值为6.5～8.5条件下于35℃～45℃下酶解2～8h；灭酶后向酶解产物中加入羧肽酶A，所述羧肽酶A的加入量为2～6U/mL酵母蛋白，在pH值为6.5～7.5条件下于35℃～45℃下酶解4～8h，灭酶后用活性炭吸附除杂，所述活性炭与酶解液固液比为1:10～20，吸附温度为30～40℃，在pH为2.0～3.0条件下吸附，得到所述高F值寡肽。

2.根据权利要求1所述的高F值寡肽，其特征在于：在步骤(2)中，采用纳滤法进行浓缩，以去除所述酵母抽提液中分子量为500Da以下的分子。

3.根据权利要求1所述的高F值寡肽，其特征在于：在步骤(2)之前，还包括灭酶、离心后取上清液的步骤。

说明书

高F值寡肽及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及酶制剂技术领域，尤其涉及一种高F值寡肽及其制备方法。

背景技术

[0002] 高F值寡肽是由2～9个氨基酸残基所组成的混合小肽混合物，F值是指混合物中支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，简称BCAA)和芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸，简称AAA)的摩尔比值，是为了纪念德国著名学者Fischer在上个世纪70年代提出的“伪神经传递质假说”而命名的。高F值寡肽的F值应大于20。寡肽，是由2～9个氨基酸组合而成的蛋白质前体，或是由蛋白质降解到2～9个氨基酸组成的蛋白质降解物，也可称小肽、短肽等。在实际生产中，高F值寡肽可以广泛应用在治疗肝脏疾病的药品、护肝食品、外科手术病人的蛋白营养食品、消化酶缺乏患者的肠道营养剂和高强度劳动者的食品营养强化剂等方面。高F寡肽混合物相较支链氨基酸配方更具有实际效用，其独特生理功能已受到人们的高度关注，具有良好的发展前景。

[0003] 酵母是对人类贡献最大的微生物工业产品。自从人类酿酒、制醋、制酱的历史之初就与酵母打交道，甚至可以追溯到几千年前的古巴比伦时代和中国的周朝以前。酵母的蛋白含量在45％～55％之间，与普通级酵母相比活性干酵母含水量在4％～6％颗粒小而发酵速度快。酵母蛋白中必须氨基酸含量丰富，支链氨基酸占18.96％，芳香族氨基酸占7.45％，其初始F值为3.41，超过了大豆蛋白大米蛋白等常见动植物蛋白粉，是一种很适合生产高F值寡肽的原料。

[0004] 目前，国内外市售的高F值产品都是由氨基酸复配而成，产品种类较为单一，还未有高F值寡肽产品出售。而现代营养学研究表明：寡肽与游离氨基酸相比，除了可以作为营养物质外，还具有渗透压低、耗能低等优点，更容易被机体吸收利用。

[0005] 高F值寡肽由于其制备要求严格因而制备过程复杂。目前，根据国内外研究现状，主要使用玉米蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白、酪蛋白等作为原料，所用水解酶多为肌动蛋白酶、链霉蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，所以开辟新的制备途径显得极为重要。在纯化过程中，提高F值的关键点是去除芳香族氨基酸。对于酶解工艺中释放出的游离态芳香族氨基酸，需要有效去除芳香族氨基酸进行脱芳高F值化。目前，脱芳的方法主要有离子交换法、膜分离法、凝胶色谱法、亲和层析法、活性炭色谱法。根据国内外研究报道，一般使用Sephadex G～15或Bio～Gel P～2凝胶层析进行分离纯化，但是因为上样量少且不易于工艺的放大，从而给大规模生产带来困难。

[0006] 活性干酵母运输容易利于保存，蛋白含量丰富，因此探索酵母细胞更丰富的应用潜能，开发一种方法简便、成本较低、容易吸收的酵母高F值寡肽具有一定的市场价值。

发明内容

[0007] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种高F值寡肽及其制备方法，本发明方法简便、成本较低、原料来源充足、酶解过程可控，制备出纯天然、易吸收的高F值生物活性寡肽。

[0008] 在一方面，本发明提供了一种高F值寡肽的制备方法，包括以下步骤：

[0009] (1)向酵母蛋白水溶液中加入碱性蛋白酶，在pH值为7.0～9.0条件下于45～55℃下进行酶解，得到酵母抽提液，其中，所述碱性蛋白酶的加入量为400～600U/g酵母蛋白；

[0010] (2)浓缩所述酵母抽提液，以去除所述酵母抽提液中分子量为500Da以下的分子，得到浓缩液；

[0011] (3)向所述浓缩液中加入α-胰凝乳蛋白酶，在pH值为6.5～8.5条件下于35℃～45℃下酶解2～8h；灭酶、离心取上清液后向酶解产物中加入羧肽酶A，在pH值为6.5～7.5条件下于35℃～45℃下酶解4～8h，灭酶、离心取上清液后用活性炭吸附除杂，得到所述高F值寡肽。

[0012] 抽提指的是从一种固体或一种液体混合物中将所要的物质根据其特性用溶剂提取分离出来的方法。

[0013] 进一步地，在步骤(1)中，所述酵母蛋白溶液的浓度为160～250g/L。

[0014] 进一步地，在步骤(1)中，酶解时间为8～12h。

[0015] 进一步地，在步骤(1)中，酵母蛋白溶液通过将活性干酵母加入水中，然后超声破碎后获得。超声破碎功率为300～450W，优选为400W，破碎时间为10～25min，优选为20min。

[0016] 进一步地，在步骤(2)中，采用纳滤法进行浓缩，以去除所述酵母抽提液中分子量为500Da以下的分子，如游离氨基酸和/或盐离子。

[0017] 进一步地，纳滤法在2～4MPa下进行。

[0018] 进一步地，在步骤(2)中，浓缩前所述酵母抽提液的pH值控制为6.5～7.5，浓缩后液体体积与浓缩前液体体积之比为1:1.5～3。

[0019] 进一步地，在步骤(2)之前，还包括灭酶、离心后取上清液的步骤。灭酶条件为沸水浴灭酶15min。离心转速优选为13000r/min，离心时间优选为15min。

[0020] 进一步地，在步骤(3)中，α-胰凝乳蛋白酶的加入量为4000～6000U/g酵母蛋白。

[0021] 进一步地，在步骤(3)中，羧肽酶A的加入量为2～6U/mL酵母蛋白。

[0022] 进一步地，在步骤(3)中，活性炭与酶解液固液比为1:10～20。通过活性炭吸附，以去除大部分的芳香族氨基酸，保留支链氨基酸。

[0023] 进一步地，在步骤(3)中，吸附温度为30～40℃，在pH为2.0～3.0条件下吸附。

[0024] 进一步地，在步骤(3)中，吸附时间为2～5h。

[0025] 进一步地，在步骤(3)中，活性炭在使用前，预先经过稀盐酸清洗去除灰分，以改变活性炭表面基团性质。

[0026] 进一步地，在步骤(3)中，吸附后的水解液通过冷冻干燥后获得高F值寡肽粉末。

[0027] 活性干酵母是一种活细胞，单纯的以α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A抽提效率较低且耗时较长，因而首先使用无特异性的碱性蛋白酶抽提酵母蛋白使之分解成小片段的多肽，后经α-胰凝乳蛋白酶(主要酶切位点芳香族氨基酸羧基端)和羧肽酶A(主要切割羧基端第一个氨基酸残基为芳香族的氨基酸)定向酶解，可以将大部分芳香族氨基酸游离出来。从而经过活性炭吸附即可获得高F值混合寡肽液。

[0028] 在另一方面，本发明还要求保护一种采用上述方法所制备的高F值寡肽，其F值为30～40。

[0029] 进一步地，本发明的源于酵母蛋白的高F值寡肽，由多肽分子混合而成，其分子量主要集中于1500Da以下，占总含量的99.82％。其中，分子量为180～1500Da的寡肽占总含量的66.42％，此分子量范围的寡肽主要由3～6个氨基酸残基组成，符合高F值寡肽的分子量要求；分子量小于180Da的占32.86％，此分子量范围的分子包括二肽和/或游离态氨基酸。

[0030] 进一步地，本发明的源于酵母蛋白的高F值寡肽，在寡肽和游离氨基酸的混合物中，游离氨基酸含量占14.67％；在游离态氨基酸中，芳香族氨基酸含量占3.6％，支链氨基酸含量占55.1％。酵母蛋白酶解液中的氨基酸不仅种类多，而且必须氨基酸占总氨基酸的35.48％，非必需氨基酸占64.52％，在众多的氨基酸中，支链氨基酸缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)的总含量(质量分数)为21.73％，而芳香族氨基酸色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)总含量(质量分数)为0.75％。

[0031] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

[0032] 本发明以活性干酵母作为蛋白原料，利用其蛋白含量高初始F值高且来源广泛价格低廉、环境友好等特点，利用酶工程技术和现代分离纯化技术，原料来源充足、酶解过程可控，经一步分离即可生产出一种纯天然、易吸收的高F值生物活性寡肽混合物，为酵母蛋白资源的合理运用和开发提供了依据，为进一步提高其附加值提供重要的运用途径。

[0033] 本发明选用特异性蛋白酶替换酶切位点广泛的蛋白酶进行定向水解，提高原料的F值及实用价值，提供了一种特定内外切蛋白酶协同定向水解及一步纯化显著提高酵母抽提液F值的方法，为解决目前高F值寡肽产品缺乏的问题提供了新思路。

[0034] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

[0035] 图1为本发明多酶协同酶解酵母蛋白的工艺流程示意图；

[0036] 图2为不同酶水解活性干酵母蛋白的蛋白得率及水解度DH测试结果；

[0037] 图3为纳滤条件下，不同浓缩倍数对总游离氨基酸去除率及蛋白回收率的影响测试结果；

[0038] 图4为单因素下，不同温度、时间、pH、加酶量条件下，α-胰凝乳蛋白酶酶解酵母抽提液的芳香族氨基酸Phe(以低苯丙氨酸Phe为例代表芳香族氨基酸)的游离率测试结果；

[0039] 图5为不同时间、pH、料液比、温度条件下，活性炭吸附酶解液后吸光度220/280的比值测试结果；

[0040] 图6为酵母抽提液、α-胰凝乳蛋白酶以及羧肽酶A反应后的游离氨基酸含量和活性炭吸附后水解寡肽总氨基酸含量测试结果；

[0041] 图7为酵母抽提液和双酶定向酶解后得到的寡肽冻干粉的分子量分布图。

具体实施方式

[0042] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0043] 本发明以下实施例中，所采用的测试方法包括以下几种：

[0044] 酶活力测定：参照GB/T 23527-2009进行。

[0045] 水解度(DH)：游离氨基氮含量与总蛋白氮含量的比值。其中，游离氨基氮含量采用甲醛滴定法测定，总蛋白氮含量采用凯氏定氮法测定。

[0046] 甲醛滴定法：参照GB 5009.235-2016进行。

[0047] 多肽分布测定：取溶液在12000r/min的转速下离心10min，取上清液，采用HPLC法测定多肽分子量分布。

[0048] 氨基酸含量测定：

[0049] (1)游离氨基酸：取离心后的上清液，加入等体积的10％的TCA(三氯乙酸)溶液，静置3h，在15000rpm的转速下离心30min，然后取2mL上清液经0.22μm的有机相膜再次过滤，然后取400μL上清液于液相样品瓶，采用HPLC法测定游离氨基酸含量。

[0050] (2)水解氨基酸：取水解管，量取1mL样品(液体)，加入1mL浓盐酸，再加入6mL6mol/L的HCl，然后充氮气3min，结束后拧紧水解管，放于120℃的烘箱中水解22h。22h后，将水解管中样品全部转移至容量瓶中，加4.8mL10mol/L的NaOH进行中和，然后用蒸馏水定容到25mL，置于振荡器中混匀后经双层滤纸过滤，取1mL滤液于1.5mL离心管中，在15000rpm的转速下离心30min，然后取400μL上清液于液相样品瓶，采用HPLC法测定溶液中的总氨基酸含量；固体测试方法同液体，不同点在于，固体取100.00mg左右，加入8mL6mol/L的HCl。

[0051] F值：支链氨基酸与芳香族氨基酸的摩尔数之比。计算公式如下：

[0052] n表示摩尔数。

[0053] 实施例1 酵母蛋白水溶液的制备

[0054] 向活性干酵母中添加蒸馏水配成具有多组一定固形物含量的酵母蛋白溶液，浓度可选择160～210g/L，将溶液进行超声破碎。超声功率为300W、350W、400W或450W，超声时间为20min，时间间隔为2s/2s。

[0055] 以破碎后上清液中的可溶性蛋白质为指标，随着超声功率的加强，酵母破碎程度先增大后趋于平缓，当功率达到400W之后蛋白得率变化程度趋于稳定，因此考虑能耗问题，选择400W的超声功率进行超声破碎。

[0056] 然后选择超声功率为400W，按照上述方法配置多组酵母蛋白溶液，在400W下分别超声10min、15min、20min和25min。

[0057] 以破碎后上清液中的可溶性蛋白质为指标，随着超声时间的增加，酵母破碎程度先增大后趋于平缓，当时间达到20min之后蛋白得率开始变化不大，考虑能耗，可在超声功率为400W，超声时间为20min的最优条件下对酵母蛋白溶液进行破碎。

[0058] 实施例2 酵母抽提液的制备

[0059] 按实施例1相同的步骤配置酵母蛋白溶液，将酵母蛋白溶液在400W下超声20min，然后分别用中性蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶与胰蛋白酶酶解，分别设定在较适合的温度与pH，反应时间为10h，加酶量都为500U·g-1。

[0060] 酶解条件具体如下：

[0061] 中性蛋白酶：40～50℃，pH＝6.0～7.0。

[0062] 胃蛋白酶：35～45℃，pH＝1.5～2.5。

[0063] 碱性蛋白酶：45～55℃，pH＝7.0～9.0。

[0064] 胰蛋白酶：35～45℃，pH＝7.5～8.5。

[0065] 结果如图2所示，由图2可知，碱性蛋白酶酶解酵母蛋白的水解度最高，中性蛋白酶次之，胃蛋白酶的水解效果最低。同时，蛋白质回收率与水解度呈正相关。之后比较四种酶水解后经活性炭吸附后的220/280nm波长下的吸光度比值，发现各种酶酶解后的产物芳香族氨基酸去除率相差不大。综上，本发明选用的碱性蛋白酶为最佳的活性干酵母抽提用酶。

[0066] 实施例3 酵母抽提液的纳滤浓缩

[0067] 在实施例2的基础上(碱性蛋白酶作为活性干酵母抽提用酶)，得到酵母抽提液，然后经沸水浴灭酶15min，13000r/min离心15min后取上清液。然后取上清液进行纳滤浓缩操作，纳滤条件是采用截留分子量为500Da的PES卷式膜，操作压力为2～4MPa，酵母抽提液初始pH为6.5～7.5，浓缩倍数(截流液体积与原液体积的比值1/1.5～1/3)为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0倍(浓缩3.0倍指的是截留液与原液体积比为1/3，其他浓缩倍数与此处含义类似)。

[0068] 结果如图3所示，随着浓缩倍数的增加，盐离子去除率和游离氨基酸去除率增加，但是过高的浓缩倍数使得部分多肽也流失了，导致蛋白质回收率下降，因此2.5倍的浓缩倍数为最佳纳滤浓缩倍数。

[0069] 实施例4 二步定向酶解

[0070] 在实施例3的基础上(浓缩倍数为2.5倍)，向纳滤后的酵母抽提液中加入α-胰凝乳-1 -1 -1 -1 -1蛋白酶，用量为2000～8000U·g (5000U·g 、5500U·g 、6000U·g 、6500U·g 、
7000U·g-1、)，酶解时间为1～8h(1h、2h、4h、6h、8h)，酶解pH为6.5～9.0(pH＝7.0、7.5、8.0、
8.5、9.0)，酶解温度为34～46℃(34℃、37℃、40℃、43℃、46℃)。后加入羧肽酶A，用量为
2U·mL-1，酶解时间为4h，酶解pH为7.5，酶解温度为40℃，以芳香族氨基酸游离率指标考察酶解效果。

[0071] 结果如图4所示，图4a-d分别为α-胰凝乳蛋白酶在不同pH、不同温度、不同加酶量、不同酶解时间条件下，芳香族氨基酸的游离率测试结果，此外，正交试验获得更为理想的作用条件,并分析了单因素对酶解实验的作用强弱，结果如表1所示。结果表明α-胰凝乳蛋白酶最适作用条件是添加量5500U·g-1，酶解时间为4h，酶解pH为8，酶解温度为40℃，且单因素对酶解实验的作用强弱影响顺序依次为：时间>pH>温度>酶添加量。

[0072] 表1 α-胰凝乳蛋白酶酶解正交实验及结果

[0073]

[0074] 实施例5 二步定向酶解

[0075] 在实施例4的基础上(α-胰凝乳蛋白酶添加量5500U·g-1，酶解时间为4h，酶解pH为8，酶解温度为40℃)，α-胰凝乳蛋白酶作用完成后沸水浴灭酶15min，冷却后在13000r/min离心15min。然后向酶解液中加入羧肽酶A，用量为2～6U·mL-1，酶解时间为2～6h，酶解pH为
7.0～8.0，酶解温度为35～45℃，以芳香族氨基酸游离率指标考察酶解效果。

[0076] 结果如表2所示，羧肽酶A最适作用条件是添加量4U·mL-1，酶解时间为4h，酶解pH为7.5，酶解温度40℃，且单因素对酶解实验的作用强弱影响顺序依次为：酶添加量>温度>pH>时间。

[0077] 表2羧肽酶A酶解正交实验及结果

[0078]

[0079] 实施例6 活性炭吸附

[0080] 在实施例5的基础上，α-胰凝乳蛋白酶添加量5500U·g-1，酶解时间为4h，酶解pH为8，酶解温度为40℃；羧肽酶A添加量4U·mL-1，酶解时间为4h，酶解pH为7.5，酶解温度40℃。
将两步酶解后的产物煮沸灭酶15min，冷却后13000r/min离心15min，加入稀盐酸处理后的活性炭，通过1mol·L-1的NaOH和1mol·L-1HCL将酶解后的产物的pH调节为1.0、1.5、2.0、
2.5、3.0、3.5，按1:10的料液比加入粉末活性炭，在35℃摇床上吸附2h吸附完成后，置于4℃、转速为10000rpm/min离心15min。测定吸附后的上清液在220nm和280nm下的吸光度，通过吸光度220/280来比较活性炭的吸附效果。

[0081] 结果如图5b所示，在pH 2.5的时候吸光度220/280的值最大，当pH较低时，超过了氨基酸的等电点，氨基酸易沉降，分子间的作用力减弱，不易被活性炭吸附。当pH较高时活性炭表面的基团改性不充分，无法有效结合芳香族氨基酸。所以pH2.5为活性炭吸附的最佳pH。

[0082] 在上述最佳pH吸附条件下，调整不同的吸附时间(1h、3h、4h、5h)，不同的料液比(1:5、1:15、1:20、1:25)，不同的温度(25℃、30℃、40℃、45℃)，在以上条件下分别进行活性炭吸附处理，结果如图5a、5c、5d所示。从图中可看出，随着吸附时间的增加，220/280的值逐渐增大，2h后趋于稳定，随着料液比的增加，220/280的值活性炭的值逐渐降低，在30-40℃之间，220/280的值较高，此范围温度为最佳吸附温度。实施例7多肽分布测定及氨基酸组成分析

[0083] 按实施6相同的步骤进行操作，经活性炭吸附后的酶解液冷冻干燥，获得寡肽冻干粉。

[0084] 采用HPLC法对经活性炭吸附脱芳后的冻干粉进行氨基酸组成分析，同时对初始酵母抽提液进行同样测试，结果如图6所示。根据F值的公式计算，得出冻干粉的F值为35.47，此F值与原料的起始F值相比，提高了10.4倍；在寡肽和游离氨基酸的混合物中，游离氨基酸含量占14.67％；在游离态氨基酸中，芳香族氨基酸含量占3.6％，支链氨基酸含量占55.1％。这些数据说明：脱芳处理后的冻干粉的F值符合高F值寡肽的要求，且游离态的芳香族氨基酸基本被吸附脱掉，达到预期的实验目的。

[0085] 采用HPLC法对经活性炭吸附脱芳后的冻干粉进行多肽分子量分布分析，同时对初始酵母抽提液以及未加入羧肽酶A进行酶解的产物进行同样测试，结果如图7所示。图7表明，冻干粉的分子量主要集中于1500Da以下，占总含量的99.82％。其中，分子量为180～1500Da的寡肽占总含量的66.42％，此分子量范围的寡肽主要由3～6个氨基酸残基组成，符合高F值寡肽的分子量要求；分子量小于180Da的占32.86％，结合氨基酸含量分析可知：此分子量范围的可能是二肽或游离态氨基酸，且二肽为主要部分，约占24％，其余8％的游离态氨基酸中，芳香族氨基酸含量甚少，支链氨基酸和其他氨基酸为主要成分。

[0086] 本发明选用α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A定向水解酵母抽提液及一步纯化(活性炭吸附)，F值提高了10.4倍，F值从原料的3.41到了35.47，满足高F值寡肽的F值和分子量的要求，且多次验证实验具有稳定的重复性，达到预期效果：在选用新的制备高F值寡肽的原料的同时，也提供了一种高效且稳定制备高F值寡肽的方法，帮助解决目前高F值寡肽产品极度缺乏的问题。

[0087] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。