一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其应用

摘要

本发明公开了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其应用。该脂肪酶突变体为脂肪酶TTL增加二硫键得到的脂肪酶突变体；其中，脂肪酶TTL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建二硫键得到了热稳定性提高的脂肪酶突变体TTL‑108/162，突变体TTL‑108/162在75℃和80℃热处理30分钟后的酶活保留率为65％和48％，即本发明的获得的脂肪酶突变体TTL‑108/162具有良好的热稳定性，可广泛应用于工业领域中。

权利要求

1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于：所述脂肪酶突变体为脂肪酶TTL增加二硫键得到的脂肪酶突变体；其中，脂肪酶TTL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的脂肪酶突变体为脂肪酶突变体TTL-108/162，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌株。

6.权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体在工业领域中的应用。

说明书

一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其应用。

背景技术

[0002] 脂肪酶是在油水界面上催化甘油酯分解或合成的一类酶的总称，其可以催化天然底物油脂水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。同时又可以催化酸解、转酯、酯合成和酯交换等反应。由于脂肪酶独特的酶学特性使其在饲料、造纸等领域具有广泛的应用潜力。

[0003] 许多工业领域对脂肪酶的热稳定性有一定的要求，希望脂肪酶能够在高温条件下保持良好的稳定性，如饲料和造纸等工业领域许多工艺环节涉及到高温环境，热稳定性差的脂肪酶在上述工艺中易失活变性，限制了脂肪酶在这些工业领域的应用，因此开发热稳定性良好的的脂肪酶具有重要意义。在前期的实验中，本课题组获得了脂肪酶TTL，该酶对中长链甘油酯底物具有很好的水解活性，并且作用底物广泛，但是TTL在高温环境下不稳定，容易变性失活(TTL在75℃和80℃热处理30分钟后的酶活保留率仅为25％和16％)，不利于其产业化应用。因此，构建热稳定性良好的脂肪酶突变体，可以为脂肪酶TTL的产业化应用奠定基础。

发明内容

[0004] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种热稳定性提高的脂肪酶突变体。

[0005] 本发明的另一目的在于提供所述热稳定性提高的脂肪酶突变体的编码基因。

[0006] 本发明的又一目的在于提供所述热稳定性提高的脂肪酶突变体的应用。

[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，该脂肪酶突变体为脂肪酶TTL增加二硫键得到的脂肪酶突变体；其中，脂肪酶TTL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 所述的脂肪酶突变体为脂肪酶突变体TTL-108/162，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0009] 所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0010] 所述的脂肪酶突变体TTL-108/162包含的突变位点I108C和A162C，即氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的脂肪酶TTL中的108位Ile(I)突变为Cys(C)、162位Ala(A)突变为Cys(C)。

[0011] 含有所述编码基因(突变体TTL-108/162基因)的重组载体

[0012] 含有所述编码基因(突变体TTL-108/162基因)的重组菌株。

[0013] 所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体在工业领域中的应用，包括饲料和造纸等工业领域。

[0014] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过构建二硫键得到了热稳定性提高的脂肪酶突变体TTL-108/162，与脂肪酶TTL相比，突变体TTL-108/162包含的突变位点为I108C和A162C。突变体TTL-108/162在75℃和80℃热处理30分钟后的酶活保留率为65％和48％，而野生型TTL在75℃和80℃热处理30分钟后的酶活保留率仅为25％和16％。相对于脂肪酶TTL，突变体TTL-108/162在75℃和80℃热处理30分钟后的热稳定性提高了
160％和200％。因此，本发明的获得的脂肪酶突变体TTL-108/162具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。

附图说明

[0015] 图1原始脂肪酶TTL和突变体TTL-108/162的最适反应温度测定结果图。

[0016] 图2原始脂肪酶TTL和突变体TTL-108/162的最适反应pH测定结果图。

具体实施方式

[0017] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明中涉及到的实验材料和试剂：

[0018] 1、菌株与载体

[0019] 大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、表达载体pPICZαA均从商业途径购买获得。

[0020] 2、酶与试剂盒

[0021] Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司；质粒提取，胶纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Zeocin购自Invitrogen公司。

[0022] 3、培养基

[0023] 大肠杆菌培养基为LB(1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)NaCl，pH7.0)。LBZ为LB培养基加25μg/mL Zeocin(博莱霉素)。

[0024] 酵母培养基为YPD(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100mg/L zeocin)。

[0025] 酵母诱导培养基BMGY(1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、1.34％(w/v)YNB、0.00004％(w/v)Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY培养基(除以0.5％(v/v)甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。

[0026] 注：YNB为酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)；Biotin为生物素。

[0027] 实施例1、脂肪酶TTL表达载体构建

[0028] 分析NCBI网站报道的脂肪酶TTL基因(Genebank：JF414585.1)，发现TTL脂肪酶基因全长1083bp，包含4个外显子和3个内含子。通过比对发现其开放阅读框全长为876bp，编码291个氨基酸，其中蛋白N端前17个氨基酸为信号肽。根据查找到的TTL基因序列，通过全基因合成技术合成TTL基因ttl。根据合成基因ttl的序列设计一对引物(引物序列分别为fw：5 '-agtcgaattcTCTCC  AGTCAGACGTGAGGTT-3 '和rev：5 '-ttctctagaTTACAAACAAGTACCAATCAA-3')用于扩增不含信号肽的成熟肽基因tll-1，将扩增得到的tll-1克隆到载体pPICZαA上，得到重组载体pPICZαA-ttl-1。

[0029] 实施例2、构建二硫键突变体

[0030] 首先通过同源建模软件Modeller获得TTL的蛋白三维结构，再通过分子动力学软件Gromacs进行TTL的分子动力学模拟，根据分子动力学模拟的结果找到TTL蛋白的柔性区域。在蛋白柔性区域增加二硫键。通过在线二硫键设计网站(http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php)设计了5对二硫键，分别是E61C/N31C、E61C/T69C、I108C/A162C、G166C/G195C和G230C/V233C。

[0031] 二硫键突变体的构建大致如下(以突变体E61C/N31C为例，其他以此类推)：以构建好的pPICZαA-ttl-1为模板，先用上下游引物E61C-fw和E61C-rev进行PCR扩增，琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物，用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定突变体E61C。按照相同的方法以E61C突变体质粒为模板，用引物N31C-fw和E31C-rev进行PCR扩增，纯化，转化大肠杆菌Top10，提取质粒，测序，最终获得突变体E61C/N31C。将测序正确的突变体，用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。

[0032] 表1二硫键突变体引物

[0033]

[0034] 实施例3、二硫键突变体重组酵母工程菌种的筛选

[0035] 将实施例2中的酵母重组转化子用牙签逐个挑至每孔含有2mL BMGY培养基的24孔板中，30℃，220rpm培养36h左右，再分别加入0.75％(v/v)的甲醇进行诱导培养。30℃，220rpm培养24小时后，离心取上清进行酶活测定。脂肪酶活性的测定采用酸碱滴定法，所用的仪器为pH-stat酸碱滴定仪(瑞士万通中国有限公司)。酶活测定具体步骤如下：首先将
5％(v/v)的橄榄油加入100mL水，同时加入2％(w/v)的阿拉伯胶作为稳定剂，高速均质5分钟后获得橄榄油底物；取15mL橄榄油底物加入反应杯中，待反应温度和pH达到设定值并且稳定一段时间，加入10μL稀释好的酶液；反应达到平衡后计算酶活。酶活的定义为在一定的反应条件下，每分钟与底物反应生成1μmol脂肪酸所需的酶量定义为1个酶活力单位，用U表示。每个二硫键突变体筛选一个酶活最高的重组工程菌种进行摇瓶培养。

[0036] 摇瓶培养在500mL三角瓶中进行，首先将相应的重组工程菌种接入含有5mL BMGY培养基的50mL离心管中，30℃，220rpm培养24小时左右，将培养好的重组酵母工程菌种按1％(v/v)的接种量接入含有100mL BMMY培养基的500mL三角瓶中。摇瓶培养条件为30℃，
220rpm，每隔24小时加入0.75％(v/v)的甲醇进行诱导，同时取样进行脂肪酶活性的测定，原始TTL及二硫键突变体重组菌摇瓶培养72小时酶活如表2所示。

[0037] 表2原始脂肪酶TTL和突变体重组菌摇瓶培养酶活

[0038]菌种/重组菌种 酶活(U/ml)
TTL 120
E61C/N31C 115
E61C/T69C 108
I108C/A162C 70
G166C/G195C 123
G230C/V233C 100

[0039] 实施例4、原始脂肪酶TTL及二硫键突变体的热稳定性分析

[0040] 二硫键突变体的热稳定性测定如下：将稀释好的脂肪酶酶液加入PCR反应管，再将装有酶液的PCR反应管放入PCR仪，分别在75℃和80℃条件下热处理30分钟，参照脂肪酶活性测定方法，测定剩余脂肪酶的酶活，以没有做热处理的脂肪酶，作为对照，进行剩余酶活计算。剩余酶活率以热处理样品酶活除以对照样品酶活，再乘以100％表示。

[0041] 原始脂肪酶TTL(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)及二硫键突变体在75℃和80℃条件下的热稳定性如表3所示。由表3可知这5对二硫键突变体中，只有I108C/A162C(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)能有效提升TTL的热稳定性，该突变体在75℃和80℃条件下热处理30分钟后剩余酶活分别为65％和48％，而原始TTL在75℃和80℃水浴30分钟后的酶活保留率仅为25％和16％。其他4对二硫键对TTL的热稳定性没有太多影响。其中：

[0042] SEQ ID NO.1(原始脂肪酶TTL)：

[0043] AGTCCTGTCCGACGAGAGGTCTCGCAGGATCTGTTTGACCAGTTCAACCTCTTTGCGCAGTACTCGGCGGCCGCATACTGCGCGAAGAACAACGATGCCCCGGCAGGTGCGAACGTAACGTGCAGGGGAAGTATTTGCCCCGAGGTAGAGAAGGCGGATGCAACGTTTCTCTACTCGTTTGAAGATTCTGGAGTTGGCGATGTCACCGGGTTCCTTGCTCTCGACAACACGAACA GACTGATCGTCCTCTCTTTCCGCGGCTCTCGTTCCCTGGAAAACTGGATCGGGAATATCAACTTGGACTTGAAAGGAATTGACGACATCTGCTCTGGCTGCAAGGGACATGACGGCTTCACTTCCTCCTGGAGGTCCGTTGCCAATACCTTGACTCAGCAAGTGCAGAATGCTGTGAGGGAGCATCCCGACTACCGCGTCGTCTTCACTGGGCACAGCTTGGGTGGGGCATTGGCAACTGTGGCCGGGGCATCTCTGCGTGGAAATGGGTACGATATAGATGTGTTCTCATATGGCGCTCCCCGCGTCGGAAACAGGGCTTTTGCGGAATTCCTGACCGCACAGACCGGCGGCACCTTGTACCGCATCACCCACACCAATGATATTGTCCCCAGACTCCCGCCACGCGAATTGGGTTACAGCCATTCTAGCCCAGAGTATTGGATCACGTCTGGAACCCTCGTCCCAGTGACCAAGAACGATATCGTCAAGGTGGAGGGCATCGATTCCACCGATGGAAACAACCAGCCAAATACCCCGGACATTGCTGCGCACCTATGGTACTTCGGCCTCATCGGGACATGTCTTTAG。

[0044] SEQ ID NO.2(原始脂肪酶TTL)：

[0045] SPVRREVSQDLFDQFNLFAQYSAAAYCAKNNDAPAGANVTCRGSICPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNRLIVLSFRGSRSLENWIGNINLDLKGIDDICSGCKGHDGFTSSWRSVANTLTQQVQNAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGASLRGNGYDIDVFSYGAPRVGNRAFAVFLTAQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPRELGYSHSSPEYWITSGTLVPVTKNDIVKVEGIDSTDGNNQPNTPDIAAHLWYFGLIGTCL。

[0046] SEQ ID NO.3(脂肪酶突变体TTL-108/162)：

[0047] AGTCCTGTCCGACGAGAGGTCTCGCAGGATCTGTTTGACCAGTTCAACCTCTTTGCGCAGTACTCGGCGGCCGCATACTGCGCGAAGAACAACGATGCCCCGGCAGGTGCGAACGTAACGTGCAGGGGAAGTATTTGCCCCGAGGTAGAGAAGGCGGATGCAACGTTTCTCTACTCGTTTGAAGATTCTGGAGTTGGCGATGTCACCGGGTTCCTTGCTCTCGACAACACGAACAGACTGATCGTCCTCTCTTTCCGCGGCTCTCGTTCCCTGGAAAACTGGATCGGGAATATCAACTTGGACTTGAAAGGAATTGACGACTGCTGCTCTGGCTGCAAGGGACATGACGGCTTCACTTCCTCCTGGAGGTCCGTTGCCAATACCTTGACTCAGCAAGTGCAGAATGCTGTGAGGGAGCATCCCGACTACCGCGTCGTCTTCACTGGGCACAGCTTGGGTGGGGCATTGGCAACTGTGGCCGGGTGCTCTCTGCGTGGAAATGGGTACGATATAGATGTGTTCTCATATGGCGCTCCCCGCGTCGGAAACAGGGCTTTTGCGGAATTCCTGACCGCACAGACCGGCGGCACCTTGTACCGCATCACCCACACCAATGATATTGTCCCCAGACTCCCGCCACGCGAATTGGGTTACAGCCATTCTAGCCCAGAGTATTGGATCACGTCTGGAACCCTCGTCCCAGTGACCAAGAACGATATCGTCAAGGTGGAGGGCATCGATTCCACCGATGGAAACAACCAGCCAAATACCCCGGACATTGCTGCGCACCTATGGTACTTCGGCCTCATCGGGACATGTCTTTAG。

[0048] SEQ ID NO.4(脂肪酶突变体TTL-108/162)：

[0049] SPVRREVSQDLFDQFNLFAQYSAAAYCAKNNDAPAGANVTCRGSICPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNRLIVLSFRGSRSLENWIGNINLDLKGIDDCCSGCKGHDGFTSSWRSVANTLTQQVQNAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGCSLRGNGYDIDVFSYGAPRVGNRAFAVFLTAQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPRELGYSHSSPEYWITSGTLVPVTKNDIVKVEGIDSTDGNNQPNTPDIAAHLWYFGLIGTCL。

[0050] 表2原始脂肪酶TDL和单点突变体热稳定性分析

[0051] 编号 75℃剩余酶活(％) 80℃剩余酶活(％)原始脂肪酶TTL 25 16
E61C/N31C 23 14
E61C/T69C 26 16
I108C/A162C 65 48
G166C/G195C 27 15
G230C/V233C 23 15

[0052] 实施例5、脂肪酶TTL和突变体TTL-108/162的最适反应温度

[0053] 在pH 9.5条件下测定脂肪酶TTL和突变体TTL-108/162在30～80℃不同温度下的酶活(方法实施例3)，以测定酶活最高温度下的酶活为100％，计算其他温度下的相对酶活。

[0054] 实验结果：脂肪酶TTL和突变体TTL-108/162的最适反应温度如图1所示，由图1可知，原始脂肪酶TTL的最适反应温度为60℃，而突变体TTL-108/162的最适反应温度为65℃。

[0055] 实施例6、脂肪酶TTL和突变体TTL-108/162的最适反应pH

[0056] 在60℃条件下测定脂肪酶TTL和突变体TTL-108/162在pH7～11下的酶活(方法实施例3)，以测定酶活最高pH下的酶活为100％，计算其他pH下的相对酶活。

[0057] 实验结果：脂肪酶TTL和突变体TTL-108/162的最适反应pH如图2所示，由图2可知，TTL和突变体TTL-108/162的最适反应pH均为9.5，在pH8～10范围内相对酶活均大于60％。

[0058] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。