肽及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及肽及其制备方法和用途。肽包含以SEQ ID No.1所示的序列或以SEQ ID No.1所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸的序列，所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。本发明还提供了编码肽的核苷酸序列、含有核苷酸序列的载体和包含载体的宿主。本发明的肽与MSH‑α的氨基酸序列相似，而且可以通过生物发酵的方法大规模制备，可用于美白化妆品产业。

权利要求

1.由以SEQ ID No. 1所示的序列组成的肽。

2.编码根据权利要求1所述的肽的核苷酸序列。

3.根据权利要求2的核苷酸序列，其由以SEQ ID No. 3所示的序列组成。

4.包含根据权利要求2或3所述的核苷酸序列的载体。

5.包含根据权利要求4所述的载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其是大肠杆菌宿主细胞。

7.制备根据权利要求1所述的肽的方法，其包括：(1) 用包含多核苷酸序列的载体转化宿主细胞，其中所述多核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含权利要求1所述的肽；

(2) 在适当的条件下培养所述宿主细胞；并且(3) 收集并纯化表达的多肽；

(4)切割多肽以获得根据权利要求1所述的肽，其中所述多肽包含多个以SEQ ID No. 1所示的序列的重复单元；

其中多个重复单元是2、3、或4个重复单元。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述切割用羟胺裂解法进行。

10.权利要求7的方法，其中所述重复单元是连续的或者间隔一个或多个氨基酸残基。

11.美白用组合物，其包含根据权利要求1所述的肽。

12.权利要求1所述的肽用于美白的用途。

说明书

肽及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及肽及其制备方法和用途。背景技术：

[0002] 皮肤美白是许多亚洲女性的执着追求，更有“一白遮百丑”的传统说法。从科学的角度而言，皮肤的颜色主要是由于皮肤中的色素含量决定的，最主要就是黑色素的含量。皮肤中黑色素的含量可以很大程度上决定皮肤颜色的深浅。黑色素是一种蛋白质，存在于每个人皮肤、毛发、视网膜、软脑膜等组织中。黑色素的颗粒不全都是纯黑色的，也有黄棕色、红棕色、棕褐色、深棕色等等。他们共同起作用，决定了人类皮肤和毛发的不同颜色。

[0003] 黑色素是由黑色素母细胞分泌而产生的。黑色素母细胞属于腺细胞，有很强的分泌能力，主要分布于人的表皮基层细胞间。黑色素都是由酪氨酸催化反应得来的。黑色素母细胞含有特殊的酪氨酸酶，先将酪氨酸氧化形成多糖，然后经过多步代谢过程，最后生成黑色素。黑色素生成的越多，皮肤就越黑。只要让黑色素母细胞少生成黑色素，才能让人体皮肤变白。通常有两种思路来减少黑色素的生成，一种思路是降低黑色素母细胞内的酪氨酸酶的生物学活性，第二种思路是通过控制外源刺激信号来抑制黑色素母细胞的活性。本发明的美白用短肽就是采取了第二种思路。

[0004] 人体内各种细胞的活性普遍都受到了细胞因子的调节，黑色素母细胞也不例外。MSH全称为黑色素细胞刺激素(melanocyte-stimulating hormone)，或者促黑激素，是人体中非常重要的激素，由垂体产生。MSH的功能很强大，既可以刺激在头发和皮肤中的黑色素母细胞中合成黑色素，又可以在大脑中影响食欲和性刺激。黑色素母细胞表面表达一种黑素皮质素受体，叫做MSH-R，属于GPCR家族成员。它就是MSH信号分子的受体。MSH激素从垂体分泌之后，结合到黑色素母细胞上的MSH-R受体上，开启信号通路，激活下游的黑色素的生成。只要能够干扰到MSH和MSH-R的相互作用，就可以阻断这个信号通路的激活，就可以抑制皮肤黑色素的生成。

[0005] 目前人类还没有解析得到MSH蛋白结合MSH-R受体的晶体结构，因此还不知道二者结合的具体方式。但是，人们仍然可以通过设计MSH的序列类似物，来达到阻止MSH结合MSH-R的目的。MSH-α的氨基酸序列为SYSMEHFRWGKPV，人们设计了许多类似多肽来模仿这个信号分子的生物学功能，通过结合MSH-R受体来阻止人体自身的MSH信号分子发挥激活作用。比如Nonapeptide-1，或者叫做melanostatine-5，就是MSH-α的类似物，已被证实具有美白的功能。它的氨基酸序列就和MSH-α的氨基酸序列极为相似。但是，melanostatine-5的序列里面含有2个D型的氨基酸，不易通过生物发酵的方法进行制备，因此，其制备方法还都是局限于化学合成，其高额的成本限制了这类产品的广泛使用。

[0006] 因此，本领域中需要能够通过生物体方便合成的美白肽。

发明内容

[0007] 本发明部分基于发明人的以下发现：称为M11的肽的全部11个氨基酸都是L型的天然氨基酸，既与MSH-α的氨基酸序列更为相似，又可以通过生物发酵的方法大规模制备，真正能使这类短肽类的皮肤营养产品不断走近百姓的日常生活，使得普通人拥有安全、稳定、实用的高品质美白化妆品。发明人还发现了通过在宿主细胞，例如大肠杆菌中以M11肽的重复形式表达，能够有效防止M11肽在宿主细胞中的降解。

[0008] 本发明提供了肽，其包含以SEQ ID No.1所示的序列或以SEQ ID No.1所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸的序列，所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。

[0009] 本发明还提供了编码肽的核苷酸序列。

[0010] 在一个实施方案中，核苷酸序列可以包含以SEQ ID No.3所示的序列。

[0011] 本发明还提供了包含核苷酸序列的载体。

[0012] 本发明还提供了包含载体的宿主细胞。优选地，宿主细胞可以是大肠杆菌宿主细胞。

[0013] 本发明还提供了制备肽的方法，其包括：

[0014] (1)用包含多核苷酸序列的载体转化宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，其中所述多核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含M11肽；

[0015] (2)在适当的条件下培养所述宿主细胞；并且

[0016] (3)收集并纯化表达的多肽；

[0017] (4)任选地切割多肽以获得本发明的M11肽，其中所述切割优选用羟胺裂解法进行。

[0018] 在一个实施方案中，多核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含1个以SEQ ID No.1所示的序列或以SEQ ID No.1所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加了一个或数个氨基酸的序列或多个以SEQ ID No.1所示的序列或以SEQ ID No.1所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加了一个或数个氨基酸的序列的重复单元。在一个实施方案中，多核苷酸序列编码2、3、或4个以SEQ ID No.1所示的序列的重复单元。重复单元可以是连续的或者可以间隔一个或多个氨基酸残基。

[0019] 本发明提供了美白用组合物，其包含根据肽。

[0020] 本发明提供了肽用于抑制黑色素母细胞的活性或黑色素生成的用途。

[0021] 本发明提供了肽用于美白的用途。

[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：

[0023] 1、本发明所公开的肽不含有任何非天然氨基酸，与人体天然蛋白MSH-α更相似，为长期筛选优化的序列，而且水溶性好，稳定性强。

[0024] 2、本发明所公开的新型美白短肽的制备方法，采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，生产成本非常低，而且通过多肽基因的串联表达可以进一步提高产量。相对传统多肽的化学合成工艺，具有显著的成本优势。

[0025] 3、本发明所公开的新型美白短肽的制备方法，产物纯度高，利用质谱方法检测分子量正确，无明显杂质成分。

[0026] 本发明公开的新型美白短肽M11水溶性好，稳定性强，纯度高，生产工艺简单，成本低廉，能够让美白皮肤产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

[0027] 图1为本发明表达载体的质粒图谱示意图，具体选择的表达载体为pET-32a，选择的串联重复数为2，即pET-32a-M11-2表达载体。

[0028] 图2为本发明表达出融合蛋白的羟胺裂解效果，具体选择的表达载体为pET-32a-M11-2。酶切后多肽浓度约为1mg/ml。

[0029] 图3为本发明纯化出的M11多肽的质谱检测结果。M11多肽的理论分子量为1378.61Da。用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOF AXIMA-CFR Plus(KRATOS Analytical，Shimadzu corporation，Japan)在线性模式下进行分析，显示多肽分子量正确，无明显杂质，没有降解。

[0030] 图4显示了涂抹美白短肽M11或纯净水后黑色素含量的对比情况。纵坐标为MX 18皮肤色素仪测得的黑色素含量。

具体实施方式

[0031] 在下文更详细描述了本发明。

[0032] 本发明的肽包含基本单元M11，由11个L型氨基酸所组成。氨基酸序列为：Gly-Met-Pro-Phe-Arg-Trp-Phe-Lys-Pro-Val-Asn，或简写为GMPFRWFKPVN，在本文中也以SEQ ID No.1表示。M11的理论分子量为1378.61Da。

[0033] 可以通过将多肽基因串联表达来明显提高多肽表达效率。串联的个数可以从整数n中优化选择，表示为M11-n，其中n为1以上的整数，例如2、3、4、5或6。在本文中，1个重复的基因表示为M11-1，氨基酸序列为GMPFRWFKPVN(SEQ ID No.1)；2个重复的基因表示为M11-2，氨基酸序列为GMPFRWFKPVNGMPFRWFKPVN(SEQ ID No.2)；3个重复的基因表示为M11-3，氨基酸序列为GMPFRWFKPVNGMPFRWFKPVNGMPFRWFKPVN(SEQ ID No.4)；4重复的基因表示为M11-4；氨基酸序列为GMPFRWFKPVNGMPFRWFKPVNGMPFRWFKPVNGMPFRWFKPVN(SEQ ID No.5)；
以此类推。因此，本发明的肽也可以表示为[GMPFRWFKPVN]n，其中n为1以上的整数。

[0034] 可以通过多种生产工艺进行制备本发明的肽。可以通过传统的化学合成的工艺进行制备，还可以通过发酵的工艺进行重组表达制备，例如利用大肠杆菌发酵。

[0035] 本发明的肽可以由核苷酸序列编码，例如由SEQ ID No.3(ggcatgccgtttcgctggttcaaaccggtgaac)的核苷酸序列编码。应当理解，由于密码子简并性，本领域技术人员容易在保留初始氨基酸序列的前提下改变核苷酸序列。可以通过常规技术将核苷酸序列克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到宿主细胞中。转化方法包括但不限于电穿孔、CaCl2转化等等。在本发明中，表达载体可以是pET26，pET32，pGEX-6p等常用载体。

[0036] 本发明的肽可以由不同生物体表达，所述生物体包括但不限于动物细胞、植物细胞、微生物细胞，诸如原核生物和真核生物。优选地，在本发明中使用微生物细胞发酵产生本发明的肽。微生物细胞可以是肠杆菌科细胞，例如大肠杆菌细胞，例如BL21。应当理解，本领域技术人员可以选择适当的细胞来表达本发明的肽。

[0037] 可以通过常规方法制备并生成本发明的肽。例如，可以在培养基中在适当的条件下培养转化有本发明的多核苷酸的宿主细胞，如大肠杆菌；然后通过常规的分离和纯化技术分离本发明的肽。分离和纯化技术包括但不限于透析、硫酸铵沉淀、高效液相层析。

[0038] 本发明的肽包含以SEQ ID No.1所示的序列或以SEQ ID No.1所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸的序列，所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。“数个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个。

[0039] 氨基酸添加指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1的序列的内部添加或者在氨基酸序列的C端或N端添加氨基酸，只要所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。

[0040] 氨基酸取代指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。

[0041] 氨基酸插入指在氨基酸序列例如SEQ ID NO:1的序列的任何位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。

[0042] 氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。

[0043] 本领域技术人员已知，本发明所述的肽可以在氨基酸序列之间的一个或多个位置进行翻译后修饰。翻译后修饰的例子可以包括磷酸化作用、乙酰化作用和脱酰氨基作用。

[0044] 本发明还提供SEQ ID NO:1所示的肽的类似物，只要类似物显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。这些类似物与天然的肽差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。

[0045] 在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比，有3个，更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。

[0046]最初的残基 代表件的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val：Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu：Phe：Ile Leu
Phe(F) Leu；Val：Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr：Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

[0047] 本发明的肽的美白活性或抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性可以参考《崔浣莲，曹蕊，尹家振等.美白类化妆品的功效评价[J].香料香精化妆品，2012，4(2)：37-40》(其通过引用并入本文)进行。由 MX 18皮肤色素仪(由德国Courage+Khazaka公司(CK)公司生产)测出黑色素含量。简言之，受试者连续使用测试品，每天早晚各使用1次，洁面后敷用。在实验期间停用其它美白化妆品。同时询问志愿者使用受试样品后自我感觉及有无过敏现象等，记录自身前后对比。测定环境：测试环境温度(约22℃，湿度约50％，并且进行实时动态监测。使用 MX 18皮肤色素仪根据制造商的用法说明测定皮
肤黑红色素含量，连续测试3次，取平均值。

[0048] 本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码本发明的肽的核酸序列。核酸可以是DNA或cDNA。核酸分子可以主要由编码本发明所述肽的核酸序列组成，或可以仅由编码本发明所述的肽组成。此类核酸分子可以用本领域已知的方法合成。由于遗传密码的简并性，本领域技术人员应理解，不同核酸序列的核酸分子可以编码相同的氨基酸序列。

[0049] 本发明还提供了载体，所述载体中包括本发明所述的核酸序列。合适的载体是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，例如增强子元件。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体，在该载体中，所述多肽的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。

[0050] 本领域普通技术人员应理解，在本发明中，术语“载体”包括DNA分子，例如，质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括，但不限于：λ-噬菌体、EMBL噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。

[0051] 肽的生产方法

[0052] 本发明的肽的生产方法可以包括如下步骤：

[0053] (1)基因工程菌，例如大肠杆菌基因工程菌的构建；

[0054] (2)基因工程菌的发酵培养和诱导表达；

[0055] (3)多肽的纯化与酶切；

[0056] (4)任选地切割多肽以获得本发明的肽。

[0057] 以大肠杆菌基因工程菌为例，在步骤(1)中的构建步骤如下：优化选择肽M11-n的DNA片段，利用PCR的方法将片段进行密码子优化和拼接重组，得到完整的重组DNA序列；将重组DNA序列转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。

[0058] 在步骤(2)中所述大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和诱导表达步骤如下：

[0059] (1)从LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于10ml的LB培养基中，220rpm，37℃培养12h-16h；

[0060] (2)将菌液按照1:100的比例接种到LB培养基中放大培养，220rmp，37℃培养3小时，待菌液的OD600约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，16℃继续培养20小时，离心收集菌体。

[0061] 在步骤(3)中，肽的纯化步骤如下：

[0062] (1)用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；

[0063] (2)利用亲和柱从上清液中纯化得到重组M11-n的融合蛋白；

[0064] (3)用羟胺裂解法裂解融合蛋白，释放出游离的M11肽；

[0065] (4)通过透析、反相柱等方法纯化溶液中的M11肽。

[0066] 本发明的肽可以用作美白肽。例如可以用0.22μm滤膜进行过滤除菌后，用纯化水稀释为40μg/mL的溶液，供人使用。进行人体试用后，实际应用效果好，美白效果显著，安全无副作用，可长期使用。

[0067] 实施例

[0068] 提供以下实施例以进一步例示本发明，但是本领域技术人员应当理解这些实施例不意图限制本发明的范围，其仅由所附权利要求书限定。

[0069] 实施例1：pET-32a-M11-2基因表达载体的构建及表达

[0070] (1)大肠杆菌基因工程菌的构建

[0071] 1.1.可以由于通过将M11多肽基因串联表达明显提高多肽表达效率，此实施例选择n＝2，也就是2重复的M11-2，其氨基酸序列为GMPFRWFKPVNGMPFRWFKPVN(SEQ ID No.2)。

[0072] 1.2.根据M11-2的氨基酸序列，优化选择其大肠杆菌偏好的密码子基因，也就是ggcatgccgtttcgctggttcaaaccggtgaacggcatgccgtttcgctggtttaaaccggtgaac(SEQ ID No.6)，为了后续多肽酶切的需求，这个基因的5’端加入AAT(羟胺酶切位点)，3’端加入TAA(终止密码子)，完整的基因为aatggcatgccgtttcgctggttcaaaccggtgaacggcatgccgtttcgctggtttaaaccggtgaactaa(SEQ ID No.7)(GENEWIZ公司合成)。

[0073] 1.3委托GENEWIZ公司将基因M11-2通过BamH I(NEB公司货号：R0136L)和Xho I(NEB公司，货号：R0146L)的酶切位点插入PET32a表达载体(GENEWIZ公司)，构建得到pET-32a-M11-2表达载体。

[0074] 1.4将重组表达载体pET-32a-M11-2转化入大肠杆菌表达菌株BL21(Merck公司)，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。具体过程为：1：取1μl的该质粒于100μl的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min。2：将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min。3：向该混合物中加入600μl无抗性的LB培养基，37℃，220rpm条件下培养1h。4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素抗性的LAB平板上(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/ml氨苄抗生素)。5：将平板倒置培养于37℃温箱中，培养约20h待长出清晰可见的菌落。

[0075] (2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和诱导表达

[0076] 2.1.从LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌M11-2单菌落，置于10ml的LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)中，220rpm，37℃培养12h-16h。

[0077] 2.2.将菌液按照1:100的比例接种到LB培养基中放大培养，220rmp，37℃培养3小时，待菌液的OD600约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，16℃继续培养20小时，离心收集菌体。

[0078] (3)重组多肽的纯化与酶切

[0079] 3.1用Tris缓冲液(25mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5)重悬细菌(5g干菌/100ml)，超声破碎(超声4s，停8s，功率为100W，超声10min后停10min，并重复1～2次，直至菌液清亮不黏稠)，离心(4℃，14500g离心30分钟)收集上清液，此时表达的蛋白是HIS6-Trx-M11-2的融合蛋白。

[0080] 3.2利用镍离子亲和柱(Qiagen公司，货号：30210。事先用25mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5溶液平衡)从上清液中快速分离纯化得到HIS6-Trx-M11-2的融合蛋白。通过20mM咪唑的Tris缓冲液(20mM咪唑，25mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5)清洗杂蛋白约10～20个柱体积，用250mM咪唑的Tris缓冲液(250mM咪唑，25mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5)清洗目的蛋白，大约洗脱5个柱体积可以将目的蛋白完全洗脱下来。

[0081] 3.3用羟胺裂解法裂解融合蛋白，释放出游离的M11短肽。简言之，将HIS6-Trx-M11-2的融合蛋白溶液与羟胺裂解液(4M羟胺，PH9.0)按照1:1的体积比例混合，调节到PH 9.0，在45度水浴环境下封闭震荡反应，约4～6h可以反应完全。羟胺溶液可以在弱碱性环境下特异性的切割开蛋白内部的Asn-Gly位点，恰好可以将HIS6-Trx-M11-2的融合蛋白中的M11多肽释放出来。通过SDS-PAGE电泳检测酶切反应进展情况。具体过程为：取蛋白液40μl，加入10μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH:6.8)，10％SDS,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。

[0082] 3.4释放出的多肽M11可以通过透析等方法进行进一步的纯化，然后进行质谱检测或者冻干备用。具体过程为：将多肽M11转移到1kDa截留分子量的透析带中，放置到100倍透析液体积的蒸馏水溶液中，在4度环境中透析24h，持续搅拌，可以每隔4h换一次蒸馏水。然后收集透析袋中的溶液，离心之后取上清，即为纯化后的M11多肽。

[0083] 3.5M11多肽的理论分子量为1378.61Da，无法通过常规的SDS-PAGE进行检测，需要利用质谱方法进行鉴定。如图3所述，根据质谱方法鉴定，本发明的M11的多肽的实际分子量为1378Da，与理论分子量一致。

[0084] 实施例2：美白短肽M11的人体试用

[0085] 将美白短肽M11用0.22μm滤膜过滤除菌，用纯净水稀释成40μg/mL，存放冰箱待用。

[0086] 40名志愿者(男性20名，女性20名，年龄为23-45岁)随机分为A、B两组，各20名(男性10名，女性10名)，A组志愿者左侧面部试用7ml 40μg/mL的美白短肽M11，B组志愿者左侧面部试用7ml纯净水，右侧面部作为空白对照组。在实验期间停用其他美白化妆品，连续使用7天后测量黑色素含量。

[0087] 方法参考：《崔浣莲，曹蕊，尹家振等.美白类化妆品的功效评价[J].香料香精化妆品，2012，4(2):37-40》(其通过引用并入本文)，由 MX 18皮肤色素仪(由德国Courage+Khazaka公司(CK)公司生产)测出黑色素含量。简言之，受试者连续使用测试品，每天早晚各使用1次，洁面后敷用。在实验期间停用其它美白化妆品。同时询问志愿者使用受试样品后自我感觉及有无过敏现象等，记录自身前后对比。测定环境：测试环境温度(约22℃，湿度约50％，并且进行实时动态监测。使用 MX 18皮肤色素仪根据制造商的用法说明测定皮肤黑红色素含量，连续测试3次，取平均值。图4中的数值为20名受试者的平均值。

[0088] 图4显示了涂抹美白短肽M11或纯净水后黑色素含量的对比情况，证明了涂抹美白短肽M11后黑色素含量明显比涂抹纯净水和空白对照组的低。

[0089] 此外，A组志愿者可明显观察到左侧面部较右侧面部白皙；B组志愿者左右两侧面部无明显变化，志愿者均表示感觉良好且无过敏现象。可以得出结论M11美白效果显著，无副作用。