豚鼠免疫制备的蒜氨酸抗体

摘要

本申请公开了生物制剂技术领域中的豚鼠免疫制备的蒜氨酸抗体，原料包括蒜氨酸抗原和弗氏完全佐剂，将蒜氨酸抗原和弗氏完全佐剂等量混合得到佐剂抗原，取蒜氨酸抗原注射到豚鼠体内，免疫应答后获得蒜氨酸抗体。本发明解决了蒜氨酸的免疫原性，并免疫豚鼠获得了蒜氨酸抗体，蒜氨酸抗体可用于蒜氨酸浓度检测、体内分布以及药理作用机制研究，对蒜氨酸基础与临床研究都具有重要的应用价值。

权利要求

1.豚鼠免疫制备的蒜氨酸抗体，其特征在于，包括蒜氨酸抗原和佐剂抗原的制备：将

10ml的鸡蛋清加入到2ml质量浓度为100mg/ml蒜氨酸溶液搅拌充分混匀，呈现肉眼可见乳白色蒜氨酸与鸡蛋清结合物沉淀，形成蒜氨酸抗原；称取羊毛脂5g，取石蜡油20ml，高压灭菌备用，为弗氏不全佐剂，取弗氏不全佐剂10ml，在无菌条件下逐滴加入60mg卡介苗，边加边碾磨，为弗氏完全佐剂；然后逐滴加入等量的蒜氨酸抗原，同样边加边碾磨，形成稳定的悬浊液，得到佐剂抗原；免疫应答时，取上述蒜氨酸抗原和佐剂抗原备用，选择体重为300~

500g的豚鼠，每7天间隔注射一次，第一次皮内注射0.5ml的佐剂抗原，第二次皮下注射1ml的蒜氨酸抗原，第三次向心脏注射1ml的蒜氨酸抗原，第四次向心脏注射2ml蒜氨酸抗原，末次注射7天后心脏采血后血清分离后获得蒜氨酸抗体。

说明书

豚鼠免疫制备的蒜氨酸抗体

技术领域

[0001] 本发明属于生物制剂技术领域，尤其涉及一种豚鼠免疫制备的蒜氨酸抗体。

背景技术

[0002] 蒜氨酸为大蒜水溶性的氨基酸类化合物，化学性质稳定，近年来体外实验研究发现，蒜氨酸具有抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节及防治心血管病作用，至今未见临床研究报道。

[0003] 低分子化合物一般都不具免疫原性，当其与高分子化合物结合后，能激活机体免疫细胞，产生相应抗体。蒜氨酸为低分子氨基酸类化合物，本身没有免疫原性，但是蒜氨酸具有氨基、羧基和硫醚基，能与蛋白质分子结合，其结合物是否具有免疫原性，刺激机体产生抗体，至今未见相关报道。研究制备蒜氨酸抗体，首先要使蒜氨酸形成完全抗原，这对于避免蒜氨酸在临床使用过程中导致机体产生蒜氨酸抗体同样具有重要意义，也是制备蒜氨酸抗体根本的必备条件。其次是动物选择，豚鼠是实验室常用实验动物，具有注射途径不受限、动物来源、经济适用等优势，在后续的研究中，实验试剂容易获得，如抗豚鼠IgG抗体，但豚鼠一种是急性超敏反应的模型动物，在免疫动物过程中容易动物死亡，因此怎么获得完全抗原同样重要。

[0004] 现有技术缺乏对豚鼠的蒜氨酸抗体和抗原的研究。

发明内容

[0005] 本发明意在提供一种豚鼠免疫制备的蒜氨酸抗体，以解决现有技术没有针对蒜氨酸相关的免疫抗原和抗体研究的问题。

[0006] 本发明的技术方案为豚鼠免疫制备的蒜氨酸抗体，该蒜氨酸抗体是将蛋白作为载体与蒜氨酸结合形成蒜氨酸抗原刺激豚鼠机体免疫应答后获得的提取物。且其豚鼠并没有因超敏反应的发生而大量死亡。上述蛋白可为动物蛋白也可以为植物蛋白。

[0007] 优选的，所述蛋白包括牛血清白蛋白或卵清蛋白。牛血清白蛋白或卵清蛋白为本发明常用的蛋白载体，主要依据是价廉且易得。

[0008] 优选的，卵清蛋白为鸡蛋清蛋白。本发明中优先选用鸡蛋清蛋白。

[0009] 具体的，原料包括蒜氨酸抗原和弗氏完全佐剂，将蒜氨酸抗原和弗氏完全佐剂等量混合得到佐剂抗原，取蒜氨酸抗原注射到豚鼠体内，免疫应答后获得蒜氨酸抗体。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的借以增强免疫原性的佐剂，它又可分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。弗氏不完全佐剂系油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂相混合而成，当其与抗原混合即成为油包水乳剂，用于免疫注射，在不完全佐剂中加入灭活的分枝杆菌(如卡介苗菌)则成为弗氏完全佐剂。

[0010] 更具体的，取蒜氨酸抗原和佐剂抗原备用，选择体重为300～500g的豚鼠，每7天间隔注射一次，第一次皮内注射0.5ml的佐剂抗原，第二次皮下注射1ml的蒜氨酸抗原，第三次向心脏注射1ml的蒜氨酸抗原，第四次向心脏注射2ml蒜氨酸抗原，末次注射7天后心脏采血后血清分离后获得蒜氨酸抗体。

[0011] 在对抗体进行检测的时候，用“O”型人血液细胞作为载体，结合蒜氨酸后形成致敏红细胞和致敏淋巴细胞，检测和鉴定蒜氨酸抗体。

[0012] 本发明的工作原理及有益效果：

[0013] 1、本发明首先解决了蒜氨酸的免疫原性，并免疫豚鼠获得了蒜氨酸抗体，为蒜氨酸的基础与临床研究提供了物质基础和技术保障。

[0014] 2、蒜氨酸抗体可用于蒜氨酸浓度检测、体内分布以及药理作用机制研究，对蒜氨酸基础与临床研究都具有重要的应用价值。

[0015] 3、本发明优先选用鸡蛋清蛋白作为载体与蒜氨酸结合形成乳白色复合物沉淀，使蒜氨酸具有免疫原性，成为完全抗原。

[0016] 4、用此抗原结合弗氏完全佐剂对豚鼠进行免疫制备豚鼠抗蒜氨酸抗体。

[0017] 5、豚鼠是急性超敏反应的模型动物，在蒜氨酸抗体的免疫过程中，采用脱敏注射法，一次剂量在一定时间分少量多次完成免疫注射，避免了豚鼠超敏反应的发生，首次将脱敏注射应用于动物免疫制备抗体。

附图说明

[0018] 图1为致敏红细胞免疫荧光试验检测蒜氨酸抗体的显示图；

[0019] 图2为致敏淋巴细胞免疫荧光试验检测蒜氨酸抗体的显示图。

具体实施方式

[0020] 下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

[0021] 抗原的制备

[0022] 蒜氨酸抗原的制备：将10ml的鸡蛋清加入到2ml质量浓度为100mg/ml蒜氨酸溶液搅拌充分混匀，呈现肉眼可见乳白色蒜氨酸与鸡蛋清结合物沉淀，形成蒜氨酸抗原。

[0023] 佐剂抗原的制备：称取羊毛脂5g，取石蜡油20ml，高压灭菌备用，为弗氏不全佐剂，取弗氏不全佐剂10ml，在无菌条件下逐滴加入60mg卡介苗，边加边碾磨，为弗氏完全佐剂；然后逐滴加入等量的蒜氨酸抗原，同样边加边碾磨，形成稳定的悬浊液，得到佐剂抗原。

[0024] 动物免疫

[0025] 豚鼠要求体重300～500g，免疫注射按表1进行，注意心脏注射要求，一次剂量分三至四次注射，十小时内完成注射，为少量多次脱敏注射。

[0026] 表1为豚鼠免疫注射程序

[0027]注射次数 间隔日期(天) 途径 抗原性质 接种剂量(ml)
第一次 7 皮内 佐剂抗原 0.5
第二次 7 皮下 蒜氨酸抗原 1
第三次 7 心脏 蒜氨酸抗原 0.5
第四次 7 心脏 蒜氨酸抗原 1

[0028] 采血：末次注射7天后采血，进行抗体检测，末次注射7天后使用一次性采血针和采血管进行心脏采血，将装有血液的采血管放入37℃30分钟后，以2500转/分钟离心20分钟，无菌条件将血清吸入无菌试管中备用，进行抗体检测。

[0029] 蒜氨酸抗体检测

[0030] 血液细胞分离：“O”型人抗凝血用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，2000r/min离心20min，淋巴细胞和红细胞分别用生理盐水洗涤三次。

[0031] 致敏红细胞制备:PH9.6，0.1M巴比妥-盐酸缓冲液20ml与100mg/ml蒜氨酸溶液1ml，加入压积红细胞1ml，室温放置1小时，2000r/min离心10min沉淀红细胞，生理盐水洗涤三次，沉淀红细胞用生理盐水配制成2％的红细胞悬液备用。同时用2％红细胞悬液涂片，冷风吹干，冷丙酮固定，-20℃冰箱保存备用。

[0032] 致敏淋巴细胞抗原片制备:上述分离的淋巴细胞，沉淀用去掉上清液时保留0.2ml液体分散细胞；加入1mlPH9.6，0.1M巴比妥-盐酸缓冲液和100mg/ml蒜氨酸溶液0.2ml，室温放置1小时，2000r/min离心10min沉淀红细胞，生理盐水洗涤三次，沉淀用去掉上清液时保留0.2ml液体分散细胞，制备细胞片，冷风吹干，冷丙酮固定，-20℃冰箱保存备用。

[0033] 玻片凝集试验：滴加10％致敏红细胞一滴于载玻片上，加入免疫血清一滴，用牙签碾磨混匀，摇动玻片观察红细胞凝集情况，每2分钟观察一次，十分钟内出现凝集为阳性。并用未经蒜氨酸免疫的豚鼠血清和生理盐水取代免疫血清，作为阴性对照和盐水对照进行同样试验。

[0034] 试管凝集试验：取10支试管，排于试管架上，除第一管外每管加入生理盐水0.5ml,血清按第一管原血清、1:2、1:4、1:8……，倍比稀释至第九管，第十管为盐水对照，每管加入2％致敏红细胞0.5ml，37℃环境下放置45分钟后观察结果。

[0035] 免疫荧光试验：从冰箱中取出致敏淋巴细胞和致敏红细胞抗原片，室温放置5分钟，滴加免疫血清覆盖于标本上，置湿盒中放37℃环境中4小时；取出用PH7.4，0.01M PBS冲洗干净，滴加羊抗兔荧光抗体覆盖标本，湿盒中放37℃环境中4小时，用取出用PH7.4，0.01MPBS即磷酸盐缓冲盐水冲洗干净，冷风吹干，荧光显微镜下观察结果。

[0036] 结果：

[0037] 玻片凝集试验结果显示，豚鼠免疫血清可见明显可见的红细胞凝集，正常豚鼠血清和生理盐水均未见致敏红细胞凝集。

[0038] 试管凝集试验检测抗体效价为1:128。比值越小，可用抗体越多。

[0039] 荧光显微镜下：致敏红细胞制备的抗原片可见结合荧光抗体，产生自发荧光的红细胞，如图1。致敏淋巴细胞制备抗原片，淋巴细胞结合荧光抗体，产生自发荧光，如图2，发光代表上述细胞中含有蒜氨酸抗体。

[0040] 对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利。