一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法

摘要

本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，通过PCR及测序并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明可以实现在干细胞药物制备过程中，实时监测连续传代的细胞的成骨分化状态。

权利要求

1.一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化能力的细胞模型的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述骨分化相关基因为SPP1或COL1A1；所述骨分化相关基因的敲入位点为所述骨分化相关基因的最末一个有义密码子和终止密码子之间；

S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所述骨分化相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向敲入后形成编码由骨分化相关基因、2A肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白的融合基因；

所述sgRNA如SEQ ID NO. 1所示，所述左同源臂序列如SEQ ID NO. 2所示，所述右同源臂序列如SEQ ID NO. 3所示；或者，所述sgRNA如SEQ ID NO. 4所示，所述左同源臂序列如SEQ ID NO. 5所示，所述右同源臂序列如SEQ ID NO. 6所示；

S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；

S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；

S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述sgRNA带有化学修饰基团；所述化学修饰基团为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S3中，所述间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每106个所述间充质干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP复合物的用量为

10-50 μmol，所述间充质干细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×107个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-

250V/cm，单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次数为

2-10次。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为104-106。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、宫血间充质干细胞及牙髓间充质干细胞，所述AAV病毒的血清型为AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV9病毒。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述自剪切2A肽为T2A肽、F2A肽和P2A肽中的至少一种；所述荧光蛋白报告基因为EGFP、ECFP、EYFP、GFP、RFP、mCherry、tdTomato和Venus中的至少一种。

说明书

一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法

技术领域

[0001] 本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种制备可实时检测间充质干 细胞骨分化的细胞模型的方法。

背景技术

[0002] 间充质干细胞(MSCs)作为一种新型基因治疗的靶细胞有着广泛床应 用前景，其优势如下：(1)来源广泛，可从自体或异体获得，属于同种移 植，不涉及伦理问题；(2)易于培养，具有增殖能力，体内外均保持多向 分化潜能；(3)具有归巢组织损伤部位、分泌大量细胞因子的能力。但目 前的研究发现，供体的个体差异、取材年龄的不同所造成的分化潜能的差异 制约了间充质干细胞作为细胞移植药物的临床应用。如何在体外传代扩增及 分化过程中及时监测MSCs的分化状态也成为干细胞工业质控中的难点和瓶 颈。

[0003] CRISPR基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切， 形成DNA双链缺口(Double-strand breaks,DSBs)，通过细胞内非同源末端 链接(Non-homologous end joining,NHEJ)实现对原位基因的敲除，通过同 源重组(Homology directed repair,HDR)在外源基因模板存在的情况下，实 现点突变的引入与修复及大片段基因(如报告基因)的插入。如专利文献 CN105985985A中所述，利用CRISPR/Cas9系统构建慢病毒，对脐带来源的 MSCs中的免疫抗原B2M、炎症因子TNF-α进行敲除，从而实现降低异体 间充质干细胞免疫源性的目的。但在哺乳动物细胞中，NHEJ修复基因占主 导模式，实现基因敲除比实现基因敲入容易很多。且基因敲入的片段越大， 整合几率越低，技术实现更为困难。目前尚未见有在MSCs中进行大片段基 因敲入的报道。

发明内容

[0004] 本公开的目的是实现对间充质干细胞骨分化的实时检测，提供可实时检 测间充质干细胞骨分化的细胞模型以进行药物筛选。

[0005] 为了实现上述目的，本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞骨 分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因 的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述骨分化相 关基因包括SPP1、COL1A1、BMP-2、Runx2、SLP1、IBSP及BGLAP中的 至少一种；所述骨分化相关基因的敲入位点为所述骨分化相关基因的最末一 个有义密码子和终止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包 装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所 述骨分化相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源 臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报 告基因，以使得定向敲入后形成编码由骨分化相关基因、2A肽和荧光蛋白 串联而成的融合蛋白的融合基因；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP 复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后 1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以 进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物 极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向 敲入的单克隆细胞株。

[0006] 通过上述技术方案，本发明建立了一种可在间充质干细胞高效敲入长片 段报告基因的方法，在不影响骨分化相关基因表达的情况下，原位插入报告 基因，由此可以构造多种与间充质干细胞骨分化相关的细胞模型，并且进而 可以实现在干细胞药物制备过程中，实时监测连续传代的细胞成骨分化状 态，并可在动物模型中检测制备的间充质干细胞药物移植至体内不同组织， 处于疾病或骨分化的组织微环境中，组织特异性的细胞因子及有害代谢产物 是否会影响间充质干细胞在体内的骨分化而影响细胞体内存活时间与功能， 便于对间充质干细胞体内作用时间与有效性进行深入研究，促进其临床转化 及工业化生产制备中的质量监测。

[0007] 本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

[0008] 以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

[0009] 本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的 方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA 和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述骨分化相关基因包括SPP1、 COL1A1、BMP-2、Runx2、SLP1、IBSP及BGLAP中的至少一种；所述骨分 化相关基因的敲入位点为所述骨分化相关基因的最末一个有义密码子和终 止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中， 形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所述骨分化相关基因的 敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源 臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向 敲入后形成编码由骨分化相关基因、2A肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白 的融合基因；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并 进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述 电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转 染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克 隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

[0010] 本发明通过RNP复合物以电转的方式将sgRNA和Cas9蛋白转入细胞 中，并在电转后的合适的时间内选择AAV病毒将插入有荧光蛋白报告基因 的同源重组载体转染入细胞中，最终使得sgRNA、Cas9蛋白和插入有模板 DNA的载体共同通过CRISPR基因编辑来使得大片段的外源基因得以定向 敲入靶点位置。

[0011] 其中，所述骨分化基因是以NCBI数据库中的Gene Symbol来定义的， 具体信息如表1所示，其对应的代表性sgRNA序列和左右同源臂序列也列 于表1中。优选地，所述sgRNA如SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16或19 所示；相应地，所述左同源臂序列如SEQ ID NO.2、5、8、11、14、17或 20所示；相应地，所述右同源臂序列如SEQ ID NO.3、6、9、12、15、18 或21所示.[0012] 表1

[0013]

[0014] 其中，可选地，所述sgRNA带有化学修饰基团；所述化学修饰基团优 选为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对骨分化相关基因的敲入 位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。其中，可以使用在 线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)依据骨分化相关基因的敲入位点 设计sgRNA的序列并加以合成。其中，sgRNA序列的5’端和3’端末尾的可 以分别添加有甲基(-O-Me)化学修饰基团或磷硫酰(-phosphorothioate)化 学修饰基团。

[0015] 其中，可选地，将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋 白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。

[0016] 其中，可选地，步骤S3中，所述间充质干细胞的悬液与所述RNP复合 物混合时，相对于每106个所述间充质干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP 复合物的用量为1-50μmol；所述间充质干细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5) ×107个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。

[0017] 其中，可选地，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-250V/cm， 单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次 数为2-10次。

[0018] 其中，可选地，步骤S4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后 的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到 转染后的培养物。

[0019] 其中，可选地，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使 得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为104-106。MOI值是感染时病毒与细 胞数量的比值。

[0020] 其中，优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干 细胞、脐带间充质干细胞、宫血间充质干细胞及牙髓间充质干细胞。所述 AAV病毒的血清型为AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV9病毒，优选所述AAV 病毒的血清型为AAV9病毒，在该优选情况下，能够进一步增加大片段基因 敲入干细胞的效率。

[0021] 其中，所述自剪切2A肽用于将骨分化相关基因的蛋白和荧光蛋白切割 开，其可以为T2A肽、F2A肽和P2A肽中的至少一种；所述荧光蛋白报告 基因的选择可以较宽，例如可以为EGFP、ECFP、EYFP、GFP、RFP、mCherry、 tdTomato和Venus中的至少一种。

[0022] 其中，可选地，所述荧光蛋白报告基因的序列如SEQ ID NO.24所示； 所述载体的骨架序列如SEQ ID NO.25所示。所述载体的骨架序列是指未插 入模板DNA的载体的序列。

[0023] 以下通过实施例进一步详细说明本发明：

[0024] 实施例1

[0025] 构建在脂肪间充质干细胞(ADSC细胞)骨桥蛋白基因(SPP1)中插入 EGFP报告基因的细胞模型。采用SPP1基因原位基因启动子，在终止密码 子前插入T2A-EGFP。

[0026] 1、sgRNA设计以及合成

[0027] (1)通过在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)针对SPP1基因 8号外显子靠近终止密码子(TAA)上游100bp以内的序列上设计靶向识别 的sgRNA，优选结果如下：SPP1sgRNA:5’- gguuguagaccccaaaaguaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaa cuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3’(SEQ ID NO.1)。其中1-20位的 序列为识别基序，其余的序列为tracrRNA。

[0028] (2)该sgRNA由Integrated Dna Technologies.USA公司合成并在该 sgRNA序列的5’端和3’端末尾的三个碱基的二号位和三号位上分别添加 O-Me、phosphorothioate的修饰。

[0029] 2、体外法检测sgRNA的活性

[0030] (1)基因组扩增识别靶序列片段(1144bp)，引物由生工生物工程(上 海)股份有限公司合成。

[0031] SPP1-FW:5’-gtaacatgctagtattatttcagc-3’(SEQ ID NO.22)，

[0032] SPP1-REV:5’-aacaaaacatcacaccgtacc-3’(SEQ ID NO.23)。

[0033] (2)将PCR扩增产物200ng，sgRNA 100ng，SpCas9 200ng(购于 Sigma-Aldrich，货号：TGEN-CP-500UG)，10×缓冲液2μL配置成20μL 反应体系。反应体系在37度保温一小时，在70度保温一小时。

[0034] (3)使用TAE配置1％的BioWest琼脂糖胶，在90V的电压下电泳 30min，使用凝胶成像仪观察结果。

[0035] 3、AAV包装系统选择及质粒构建

[0036] (1)待编辑细胞为人脂肪间充质干细胞(ADSC细胞)，根据AAV组 织亲和性对照表，优选血清型为AAV-9的包装系统。

[0037] (2)AAV-9的总包装容量为4.7Kb。在AAV包装系统的装载载体上所 插入的片段应包含左同源臂(500bp左右)，插入片段以及右同源臂(500bp 左右)。

[0038] 左同源臂序列为SEQ ID NO.2，其中第433-435位碱基为经过突变的 PAM位点。

[0039] 右同源臂序列为SEQ ID NO.3。

[0040] 插入片段为T2A和EGFP，共777bp，序列如SEQ ID NO.24所示。 使用无缝克隆(高保真DNA组装试剂盒，购于NEB(北京) 有限公司，货号：E2621S)的方法将Cassette插入到pAAV载体上，载体序 列为SEQ ID NO.25。为了避免SpCas9/sgRNA RNP复合物对重组位点的 二次切割从而影响基因编辑的效率，通过PrimerStar高保真DNA聚合酶(购 于宝生物工程(大连)有限公司，货号：R044A)利用PCR刻环的方法在P AM位点引入了点突变(TGG突变为TCG)，从而避免了SpCas9/sgRNA RNP复合物对识别位点的切割。点突变引物由生工生物工程(上海)股份有限 公司合成。

[0041] SPP1-PAM-mut-FW:5’-gtagaccccaaaagtaaagaagaagataaacacct-3’(SEQ I D NO.26)。

[0042] SPP1-PAM-mut-REV:5’-aggtgtttatcttctttacttttggggtctac-3’(SEQ ID NO. 27)。

[0043] 4、AAV病毒包装及纯化

[0044] (1)在病毒包装前一天将HEK293T细胞按照每皿5×106的数量种植 到直径10cm的含有10mL完全培养基(DMEM+10％FBS+1％P/S双抗) (DMEM培养基，购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：C11995500BT； FBS，购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：sv30087.02；P/S双抗，购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：SV30010)的CORNING培养皿中，共 种植30皿。在37度、5％CO2的细胞培养箱中培养24小时。

[0045] (2)病毒包装当天检查HEK293T细胞汇合度是否达到80％。每皿按照 以下步骤单独配置转染体系：将10μg的pAAV-Cassette，10μg的pHelper， 10μg的pAAV9混合后使用无血清的DMEM调整体积到910μL后经漩涡振 荡器混匀，加入90μL的PEI(购于Polysciences Asia Pacific,Inc.，货号： 23966-2)后再次使用漩涡振荡器混匀，静置15分钟。将CORNING培养皿 中的完全培养基替换成9mL无血清培养基，再将之前经过静置的DNA-PEI 复合物均匀滴加到培养皿中，轻柔晃匀后置于37度、5％CO2的细胞培养箱 中培养6小时。转染6h后将CORNING培养皿中的无血清培养基替换成完 全培养基，于37度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养。

[0046] (3)在转染60小时之后，分别收获上清和细胞。

[0047] 将收集得到的上清经4000rpm 4度离心10分钟后弃去杂质。将去除杂 质的上清加入Amicon Ultra-15超离柱中(购于默克化工技术(上海)有限 公司，货号：UFC 905096)，经过若干次4000rpm、4度离心30分钟将体积 浓缩至10到15mL。将用细胞刮刀刮下的HEK293T细胞用适量培养基吹匀 并转移至50mL离心管中，经1500rpm、4度离心10min后弃上清，所有沉 淀总共加3mL细胞裂解缓冲液(150mM NaCl,20mM tris pH8.0)使其重悬。 将重悬细胞在-80℃酒精浴和37℃水浴中反复冻融三次。将浓缩的上清和冻 融的细胞悬液混匀，添加1M MgCl2至终浓度为1mM。添加Benzonase(购 于默克化工技术(上海)有限公司，货号：
70746-1kU)至终浓度为25U/mL， 混匀后37℃反应40min。取出50mL离心管，4℃，4000rpm离心20min， 取上清。

[0048] (4)采用碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒(购于Sigma-Aldrich，货 号：D1556-250mL)。配置碘克沙醇梯度17％：5mL 10×PBS,0.05mL 1M MgCl2,0.125mL 1M KCl,10mL 
5M NaCl,12.5mL Optiprep，加水补足到50mL。25％：5mL 10×PBS,0.05mL 1M MgCl2,
0.125mL 1M KCl,20mL Optiprep,0.1mL 0.5％phenol red，加水补足到50mL。40％：5mL 10×PBS, 0.05mL 1M MgCl2,0.125mL 1M KCl,33.3mL Optiprep，加水补足到50mL。 60％：
0.05mL 1M MgCl2,0.125mL 1M KCl,50mL Optiprep,0.025mL 0.5％ phenol red。向超速离心管中由下至上依次缓慢加入3.5mL 60％、3.5mL 40％、 4mL 25％、4mL 17％的碘克沙醇。将浓缩的上清和细胞裂解液缓慢加在离心 管最上层，用细胞裂解缓冲液补满离心管。
使用贝克曼L-80XP落地超速离 心机、70Ti定角转子，加速6，减速9，60000rpm 4度离心2小时。用平头 注射器吸取40％浓度层碘克沙醇，转移至Amicon Ultra-15超离柱中，加入 
10mL PBS 4000rpm 4℃离心20分钟，重复3次。将病毒离心浓缩至1mL。

[0049] (5)利用qPCR对AAV9进行滴度检测。根据EGFP序列设计引物， 使qPCR产物的长度约200bp。qPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公 司合成。

[0050] AAVGFPF:5’-tcagcttcaggcaccaccac-3’(SEQ ID NO.28)。

[0051] AAVGFPR:5’-tgaacttgtggccgtttacgtcg-3’(SEQ ID NO.29)。

[0052] 制备7个AAV9重组质粒标准品，以1：10的比例进行梯度稀释。从 10ng/μL以下的浓度开始稀释，分别为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、 0.001ng/μL、0.0001ng/μL和0.00001ng/μL。

[0053] 根据以下公式计算稀释的DNA拷贝数：

[0054]

[0055] 使用DNase对病毒样本进行预处理(购于宝生物工程(大连)有限公司， 货号：2270A)。使用2×SYBR PCR mix(购于东洋纺(上海)生物科技有 限公司，货号：QPS-201)配置qPCR反应体系。使用Roche  480II 实时荧光定量PCR系统进行定量PCR。
根据Ct值，绘制标准曲线，并计算 AAV9的滴度。

[0056] 5、RNP复合物组装及待编辑细胞的预处理

[0057] (1)将SpCas9(终浓度300ug/ml)和SPP1sgRNA(终浓度175ug/ml) 按照1:3的摩尔比进行混合在室温孵育10min，从而形成SpCas9/sgRNA RNP 复合物。

[0058] (2)观察脂肪间充质干细胞汇合率达到80％后移除含10％FBS的 DMEM/F12培养基(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：11320082)，用 PBS漂洗一次。加入0.05％胰酶(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号： 25200-072)使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去胰酶。 即刻加入新鲜的DMEM/F12完全培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿底，使 皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液。使用 血球计数板对细胞密度进行计数。使用Opti-MEM(14.5mM的ATP、23.6mM 的氯化镁)(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：11058021)调整细胞 密度到5×107/mL。

[0059] (3)将10μL经过室温孵育的SpCas9/sgRNA SNP复合物(以sgRNA 的量计，所述RNP复合物的含量为7.5μmol)和10μL经过计数并使用 Opti-MEM重悬的脂肪间充质干细胞悬液(其中细胞数量为5×105个)相混 合，将20μL混合液转移到16孔电转板条中。使用Lonza 4D核转染系统选 择CB150模式(电场强度为150V/cm，单次脉冲时间为10ms，相邻两次脉 冲之间的时间间隔为20s，总脉冲次数为5次)进行电转。电转完成后立刻 将细胞转移到含DMEM/F12完全培养基的24孔板中于37度、5％CO2的细 胞培养箱中继续培养。

[0060] (4)电转完第5到20分钟内开始按照1×105的MOI值轻柔地滴加 AAV9，并于电转完20分钟内滴加完毕。

[0061] (5)电转完24小时后将旧培养基移除，更换为DMEM/F12完全培养 基。

[0062] 6、单克隆细胞株的培养：

[0063] (1)电转完第48小时使用PBS漂洗一次培养皿。加入胰酶使之完全覆 盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去胰酶。即刻加入新鲜的 DMEM/F12完全培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿/瓶底，使皿底贴附的干 细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，保证细胞间没有粘连，制成干细胞悬液。 使用血球计数板对细胞密度进行计数。按每个10cm培养皿15000个细胞的 比例把细胞种植到含DMEM/F12完全培养基的10cm CORNING培养皿中于 37度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养。

[0064] (2)每24小时进行观察并移除旧的培养基，更换为新的DMEM/F12 完全培养基。72小时后可以在镜下观察到克隆的形成。

[0065] (3)电转后12到14天在十倍的物镜下可以看到克隆的大小已经相当 于一个硬币。不能让克隆继续变大或者相交。在96孔板上的每个孔中加入 120μL DMEM/F12完全培养基，标记板O。在超净台中通过显微镜进行观察， 将P200移液器调节至45μL使用带有滤芯的枪头刮碎克隆，用移液器收集细 胞并转移到96孔板的小孔中。

[0066] (4)克隆挑取之后每24小时后将旧的培养基移除，更换为新的 DMEM/F12完全培养基，四天后细胞汇合率达到80％。

[0067] (5)在两块96孔板上的每个孔中加入133μL DMEM/F12完全培养基， 分别标记为板A、板B。将板O的每孔使用150μL的PBS漂洗。每孔中加 入35μL的胰酶，消化5到10分钟后每孔中添加165μL的DMEM/F12完全 培养基。从孔中分别移取66μL的细胞悬液转移到板A和板B的对应小孔中。 板A用于基因组提取，板B备用。在板O的每个孔中直接添加165μL的细 胞冻存液后至于深低温冰箱存储。

[0068] 实施例2

[0069] 构建在脂肪间充质干细胞(ADSC细胞)I型胶原蛋白基因(COL1A1) 中插入EGFP报告基因的细胞模型。采用COL1A1基因原位基因启动子，在 终止密码子前插入2A-EGFP。

[0070] 通过在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)在COL1A1基因51 号外显子靠近终止密码子(TAA)上游100bp以内的序列上设计靶向识别的 sgRNA。

[0071] COL1A1sgRNA：5’-uggggcaccaacguccaaggguuuuagagcuagaaauagcaag uuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3’。(S EQ ID NO.4)。

[0072] 其中1-20位的序列为识别基序，其余的序列为tracrRNA。

[0073] 该sgRNA由Integrated DNA Technologies.USA公司合成并在序列的 5’端和3’端末尾的三个碱基的二号位和三号位上分别添加-2-O-Me、-3-ph osphorothioate的修饰。

[0074] 2、体外法检测sgRNA的活性

[0075] (1)从基因组扩增识别靶序列片段(1084bp)，引物由生工生物工程(上 海)股份有限公司合成。

[0076] COL1A1-FW:5’-ccctgcagttcgagtatgg-3’，(SEQ ID NO.30)，

[0077] COL1A1-REV:5’-gcagtctgagaaccccagg-3’，(SEQ ID NO.31)。

[0078] (2)将PCR扩增产物200ng，sgRNA 100ng，SpCas9 200ng(购于 Sigma-Aldrich，货号：TGEN-CP-500UG)，10×缓冲液2μl配置成20μl反 应体系。反应体系在37度保温一小时，在70度保温一小时。

[0079] (3)使用TAE配置1％的BioWest琼脂糖胶，在90V的电压下电泳 30min，使用凝胶成像仪观察结果。

[0080] 3、AAV包装系统选择及质粒构建

[0081] (1)待编辑细胞为脂肪间充质(ADSC)干细胞株，根据AAV组织亲 和性对照表，优选血清型为AAV9的包装系统。

[0082] (2)AAV9的总包装容量为4.7Kb。在AAV包装系统的装载载体上所 插入的片段应包含左同源臂(500bp左右)，插入片段以及右同源臂(500b p左右)。左同源臂序列为SEQ ID NO.5，其中第436-438位碱基为经过 突变的PAM位点，右同源臂序列为SEQ ID NO.6。插入片段为T2A和E GFP，共777bp，序列如SEQ ID NO.24所示。使用无缝克隆( 高保真DNA组装试剂盒，购于NEB(北京)有限公司,货号：E2621S) 的方法将Cassette插入到pAAV载体上，载体序列为SEQ ID NO.25。为了 避免SpCas9/sgRNA RNP复合物对重组位点的二次切割从而影响基因编辑 的效率，通过PrimerStar高保真DNA聚合酶(购于宝生物工程(大连)有 限公司，货号：R044A)利用PCR刻环的方法在PAM位点引入了点突变(T GG突变为TCG)，从而避免了SpCas9/sgRNA RNP复合物对识别位点的切 割。点突变引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0083] COL1A1-PAM-mut-FW:5’-cccatcatcgatgtggcacccttggacgttggtgc-3’(SEQ ID NO.32)。

[0084] COL1A1-PAM-mut-REV:5’-gcaccaacgtccaagggtgccacatcgatgatggg-3’ (SEQ ID NO.33)。

[0085] 4、AAV病毒包装及纯化

[0086] 同实施例1

[0087] 5、RNP复合物组装及待编辑细胞的预处理

[0088] 同实施例1

[0089] 6、Lonza 4D系统电转及AAV感染

[0090] 同实施例1

[0091] 7、单克隆细胞株的培养

[0092] 同实施例1

[0093] 对比例1

[0094] 按照实施例1的方法进行，不同的是电转完第35min开始按照1×105的MOI轻柔地滴加AAV9，并于电转完50分钟内滴加完毕。

[0095] 测试实施例1

[0096] 1、荧光检测等位基因插入效率检测

[0097] 检测样品：实施例1、2以及对比例1经过电转和AAV感染后第四天经 过胰酶消化后加入新鲜的DMEM/F12完全培养基使其重悬制成的干细胞悬 液。

[0098] 检测方法：因为在目标基因座上插入的T2A-EGFP序列表达绿色荧光蛋 白，使用流式细胞仪检测并统计能发出绿色荧光的细胞数量以及细胞总量。 将能发出绿色荧光的细胞数量除以细胞总量可以得到总的编辑效率。

[0099] 实验结果：实施例1编辑效率为79.4％，实施例2编辑效率为75.3％， 对比例1编辑效率为9.5％。

[0100] 2、PCR检测等位基因插入效率

[0101] 检测样品：96孔板培养的单克隆细胞株(A板和B板)

[0102] 检测方法：在同源臂外设计引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限 公司合成。

[0103] 实施例1、对比例1使用SPP1-FW、SPP1-REV。实施例2使用 COL1A1-FW、COL1A1-REV。

[0104] 将96孔板中的克隆所获得的基因组进行PCR扩增。将PCR产物进行电 泳并分析。实施例1、对比例1只有1144bp左右条带的为非编辑细胞，只有 1921bp的为双等位基因编辑细胞，既有1144bp左右条带也有1921bp的为单 等位基因编辑细胞。分别标注并统计这三类编辑类型的比例。实施例2中只 有1084bp左右条带的为非编辑细胞，只有1861bp的为双等位基因编辑细胞， 既有1084bp左右条带也有1861bp的为单等位基因编辑细胞。

[0105] 实验结果：实施例1编辑效率：等位基因双编辑62.3％、等位基因单编 辑18.1％，对比例1编辑效率：等位基因双编辑0.5％、等位基因单编辑0.8％； 实施例2编辑效率：等位基因双编辑68.5％、等位基因单编辑15.5％；可见 电转与病毒转染的时间间隔对基因敲入的效率影响较大，在优选在电转结束 后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液 以进行8-24小时的转染的情况下，基因敲入的效率最高。

[0106] 3、所构建细胞模型在体外诱导下所致的细胞骨分化检测

[0107] 将实施例1得到的进行了EGFP敲入的脂肪间充质干细胞铺种于6孔板， 第2天更换-7为成骨诱导液(10mmol/Lβ-甘油磷酸(购于Sigma-Aldrich， 货号：G9422)、1×10 mol/L地塞米松(购于Sigma-Aldrich，货号：D4902)、 50μg/mL抗坏血酸(购于Sigma-Aldrich，货号：
PHR1008)，每孔总体 积为2mL。每3天更换1次成骨诱导液。在诱导第0天、9天、12天、15 天、
18天、27天依次收集处理后的细胞。将收集的细胞固定后进行免疫细 胞化学染色(一抗为Anti-Osteopontin，购于艾博抗(上海)贸易有限公司, 货号：ab69498，对应的荧光二抗为Goat anti-Mouse IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor Plus 555，购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：A-21424)。将染色后的细胞分别使用激光共聚焦显 微镜观察绿色荧光通道和红色荧光通道，最后将图层merge(重合)后进行 比较。结果如表2所示。

[0108] 表2体外诱导下细胞骨分化状态检测

[0109]

[0110] 上述表2结果显示，实施例1中所建立的模型可在不致细胞死亡的情况 下，实时检测诱导下的细胞骨分化。SPP1基因的表达是骨细胞分化成熟的 标志之一。常规用免疫化学的方法检测SPP1基因的表达，实施例1中构建 的EGFP敲入的脂肪间充质干细胞在成骨分化过程中实时绿色荧光检测的结 果和细胞免疫化学检测的结果一致。

[0111] 实施例2操作同实施例1，相应的只需要替换一抗为：Anti-Collagen I， 购于艾博抗(上海)贸易有限公司，货号：ab90395。结果如表3所示。

[0112] 表3体外诱导下细胞骨分化状态检测

[0113]

[0114] 上述表3结果显示，实施例2中所建立的模型可在不致细胞死亡的情况 下，实时检测诱导下的细胞骨分化。COL1A1基因的表达是骨细胞分化成熟 的标志之一，常规用免疫化学的方法检测COL1A1基因的表达，实施例1中 构建的EGFP敲入的脂肪间充质干细胞在成骨分化过程中实时绿色荧光检测 的结果和细胞免疫化学检测的结果一致。

[0115] 以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

[0116] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0117] 此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。