通过抑制COST1基因的表达提高植物抗旱性的方法

摘要

本发明公开了一种通过抑制COST1基因的表达提高植物抗旱性的方法，所述COST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，COST1基因编码的蛋白序列如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。COST1基因的同源基因包括番茄SlCOST1基因、水稻OsCOST1基因、杨树PtCOST1和PtCOST2基因以及其他物种中与COST1任何核苷酸或蛋白区域片段同源度在40％以上的其他基因，对于培育出更多抗旱的转基因植物打下基础，该方法可以应用于植物遗传改良。

权利要求

1.一种通过抑制COST1基因的表达提高植物抗旱性的方法，其特征在于，所述COST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的通过抑制COST1基因的表达来提高植物抗旱性的方法，其特征在于，所述方法在获得转基因植物中的应用。

3.通过抑制COST1基因的同源基因的表达提高植物抗旱性的方法，其特征在于，所述COST1基因的同源基因为SlCOST1，所述SlCOST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述植物为番茄。

4.通过抑制COST1基因的同源基因的表达提高植物抗旱性的方法，其特征在于，所述COST1基因的同源基因为OsCOST1，所述OsCOST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述植物为水稻。

5.通过抑制COST1基因的同源基因的表达提高植物抗旱性的方法，其特征在于，所述COST1基因的同源基因为PtCOST1和PtCOST2，所述PtCOST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：

7所示，所述PtCOST2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述植物为杨树。

说明书

通过抑制COST1基因的表达提高植物抗旱性的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种通过敲除COST1基因或抑制COST1基因的表达提高植物抗旱性的方法。

背景技术

[0002] 在当今全球变暖、淡水资源极端短缺的大环境下，如何保证粮食稳产并养活全球75亿人口是个极大挑战。培育更加高产、抗旱的植物新品种刻不容缓。

[0003] 近年来，在二代测序的推动下，大量植物的基因组序列被公布。如何深度挖掘这些已有的基因组序列的功能，寻找新的有自主知识产权的功能基因成为新的挑战。如何将这些基因用于培育更加强大的新作物品种迫在眉睫。传统的遗传育种由于需要经过杂交、自交等多个世代，耗时且漫长，同时有遗传背景不清等问题。利用目前已经成熟的生物技术手段，包括目前非常成熟的RNAi干扰技术，可以迅速、精准地控制某些基因的表达来显著缩短育种时间，使之从而成为培育新品种的一个快速有效的手段。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种通过敲除COST1基因或抑制COST1基因的表达来提高植物抗旱性的方法。

[0005] 具体地，本发明利用基因敲除和小RNA干扰技术，通过转基因实现敲除或者下调一个拟南芥DUF641家族COST1(基因ID：AT2G45260)及其类似基因在植物体内的表达量来诱导细胞自噬等逆境反应，从而提高抗旱性(气孔快速关闭，失水率降低)。

[0006] 进一步的，通过小RNA干扰技术降低该基因在水稻、番茄和杨树等类似单、双子叶植物中的同源基因的表达，相应的转基因植物表现出抗旱的表型，因此利用该转基因技术获得的转基因植物均落入本发明的保护范围之内。

[0007] 所述COST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；COST1基因编码的蛋白序列如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

[0008] 番茄中COST1基因的同源基因为SlCOST1基因，所述SlCOST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SlCOST1基因编码的蛋白序列如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

[0009] 水稻中COST1基因的同源基因为OsCOST1基因，所述OsCOST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，OsCOST1基因编码的蛋白序列如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。

[0010] 杨树中COST1基因的同源基因为PtCOST1基因和PtCOST2基因，所述PtCOST1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述PtCOST2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。PtCOST1基因编码的蛋白序列如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列，PtCOST2基因编码的蛋白序列如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。

[0011] 并且，本发明所保护的COST1基因的同源基因不仅仅限于上述所列，还包括其他物种中与COST1任何核苷酸或蛋白区域片段同源度在40％以上的基因。

[0012] 本发明具有如下优点：

[0013] 本发明通过基因敲除和小RNA干扰技术，敲除拟南芥中的COST1基因，提高了植物抗旱性。COST1基因以及其他物种中与COST1任何核苷酸或蛋白区域片段同源度在40％以上的其他基因发现，对于培育出更多抗旱的转基因植物打下基础，该方法可以应用于植物遗传改良。

附图说明

[0014] 图1是拟南芥COST1与其它三个高度同源蛋白COST2、COST3和COST4的蛋白序列比对；

[0015] 图中，黑色线条下方指示COST蛋白的保守的DUF641/COST结构域。序列比对借助CLUSTALW软件(http://www.clustal.org/clustal2/)；

[0016] 图2是COST1突变体的的鉴定。

[0017] 图中，(a)图形显示COST1的基因结构。灰色方块为非编码区，黑色方块为编码区，三角区显示T-DNA插入位置，F和R表示用于PCR鉴定的引物的位置。(b)为基因组PCR显示T-DN插入COST1突变体纯合，WT(Wild-type)表示野生型。LBal为T-DNA插入特异引物，ACT2(ID：AT3G18780)基因用于作为内标。(c)为定量PCR显示COST1突变体中的COST1基因转录被完全敲除。

[0018] 图3是COST1基因家族的进化分析及拟南芥基因敲除突变体对发育的影响；图中，(a)，COST1蛋白结构示意图，下方数字表示氨基酸位置。AT2G45260为COST1基因的ID号码；保守的COST/DUF641结构域位于COST1蛋白的氮端(N)的第31个氨基酸到第159个氨基酸；碳端(C)相对分化比较大。(b)，COST1家族蛋白进化分析。下划线后面的名称为各个物种中对应基因的ID。圆圈表示四个拟南芥的COST蛋白，对应的基因ID的右侧为FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million)值，其中拟南芥四个COST基因用圆圈表示。
(c)，对四个拟南芥COST基因的qPCR检测结果；(d)，COST1突变体对拟南芥生长发育的影响。

[0019] 图4是揭示COST1能够被其自身基因组DNA片段互补。

[0020] 图中，(a)，利用COST1基因的基因组序列互补cost1突变体，并对WT，cost1以及两个独立株系gCOST1#1和gCOST#5进行抗旱性检测。

[0021] (b)，定量PCR检测突变体和两个互补株系中COST1基因的转录表达。

[0022] (c)，对WT野生型和cost1突变体以及两个独立互补株系gCOST1#1和gCOST#5的失水率检测。

[0023] 图5用来说明抑制COST1基因表达提高植物抗旱性；

[0024] (a)，对WT，cost1以及两个COST1基因的RNAi转基因株系RNAi#1和RNAi#3进行抗旱性测试。

[0025] (b)，对(a)中的WT，cost1以及两个RNAi转基因株系RNAi#1和RNAi#3中COST1基因的转录进行定量PCR检测。

[0026] (c)，对WT，cost1以及两个RNAi转基因株系RNAi#1和RNAi#3的失水速率检测。

[0027] (d)，对干旱处理前后的WT和cost1中的逆境相应基因进行定量PCR检测。

[0028] 图6针对番茄中COST1同源基因SlCOST1(ID：Solyc01g091120)的三个RNAi独立转基因抑制表达株系与非转基因对照株系抗旱性比较。

[0029] 图7针对水稻中COST1同源基因OsCOST1(ID：Os10g23220)的两个RNAi独立转基因抑制表达株系与非转基因对照株系的抗旱性比较。

[0030] 图8同时抑制杨树中的COST1的两个同源基因PtCOST1(Potri.014G067600)和PtCOST2(Potri.002G145900)的表达，得到的三个RNAi独立转基因抑制表达株系与非转基因对照株系抗旱性比较。

具体实施方式

[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0032] 本发明涉及的科学术语如下：

[0033] *“目的基因”，系指模式植物拟南芥COST1及其一系列同源基因。

[0034] *“类似基因”，系指任何同“目的基因”编码序列中的任何区域同源性在40％以上的DNA片段(基因片段)，或任何DNA片段(基因片段)，其编码的氨基酸序列同“目的基因”编码的氨基酸序列中任何区域有40％以上的同源率。“类似基因”可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成或用PCR在体外扩增的。

[0035] *“基因片段”，系指长度在300个碱基对(bp)以上的同“目的基因”或“类似基因”DNA序列中的任何域区同源率在40％以上的任何DNA片段，或任何编码100个氨基酸以上的DNA片段，其编码的氨基酸序列同“目的基因”或“类似基因”编码的氨基酸序列中的任何区域同源性在40％以上。该基因片段可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。

[0036] *“受体植物”系指水稻、番茄和杨树等单、双子叶植物。

[0037] *“转基因”，系指通过任何方法导入植物个体一段外源的双链脱氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以是游离在染色体外，也可以整合到受体植物染色体的基因组上；可以通过生殖过程传递到后代，也可以不传递到后代。外源基因可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。

[0038] 实施例1

[0039] 一、COST1基因的筛选和获得

[0040] 通过反向遗传学手段，利用转录组、基因组和蛋白组学等多种生物信息学手段筛选得到一个全新的拟南芥DUF641家族基因COST1(Constitutively Stressed 1)，经过测序得到其核苷酸序列如序列SEQ ID NO.1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示；蛋白序列比对显示，除了COST1，拟南芥中还有其它三个蛋白COST2、COST3和COST4与COST1高度同源(图1)。

[0041] 二、COST1基因的同源分析及COST1功能验证

[0042] 从ABRC(Arabidopsis Biological Research Center，www.arabidopsis.org)拟南芥突变体库订购得到COST1的T-DNA插入植株SALK_064001。该突变体的T-DNA的插入位置为第一个也是唯一一个外显子的内部且为纯合体(图2a，b)。拟南芥的的种植和突变体鉴定方法参照括号中的文献所述方法(Bao et al.，2014)。

[0043] 经过实时定量PCR鉴定显示纯合的COST1突变体该基因的表达被完全敲除(图2c)。

[0044] 对其蛋白结构分析显示，DUF641/COST结构域位于该蛋白的N(氮)端且高度保守(图3a)。

[0045] 遗传进化分析显示COST1等UDF641家族蛋白属于植物特有的蛋白且广泛分布于包括苔藓及其它更加高等的植物中(图3b)，图中显示的物种包括Arabidopsis thaliana，Arabidopsis lyrata，Capsella rubella，Brassica rapa，Populus trichocarpa，Solanum lycopersicum，Medicago truncatula，Aquilegia coerulea，Brachypodium distachyon，Oryza Sativa，Zea mays，Amborella trichopoda，Picea abies和Physcomitrella patens。

[0046] 通过对四个拟南芥COST基因的qPCR检测结果，显示只有COST1有表达，与COST1基因高度同源的其它三个基因COST2、COST3、COST4在转录水平都几乎没有表达(图3c)。同时，通过COST1突变体对发育影响研究表明COST1基因完全敲除的COST1突变体植株变小，矮化及叶色加深等(图3d)。

[0047] 为了进步一证明该突变体的抗旱表型是由COST1基因敲除造成的，我们将COST1基因的基因组片段gCOST1克隆并转化到COST1突变体背景下。具体操作为设计引物扩增gCOST1全长编码序列，获得一个长约2502bp的DNA片段，然后将其连入EcoRV酶切的克隆载体pBlueScript II KS(pKS；Stratagene)中，酶切鉴定，将测序正确的质粒利用EcoRI和SalI进行酶切，酶切片段经回收后连入pcambia1300载体中。构建载体所用引物gCOST1F和gCOST1R(见表1)：

[0048] gCOST1F：CGCCGGAGAAAGTGTAAGAAAC

[0049] gCOST1R：TCATTCATGCTCTGTTTTCCTCTC

[0050] 结果显示，两个独立的转基因株系gCOST1#1和gCOST#5都能把COST1突变体的表型恢复到野生型(WT)的水平(图4a)。定量PCR也显示，两个互补株系中COST1的表达量和野生型对照非常接近(图4b)。四周大小的植株，剪下大约10片莲座叶，每隔30分钟测一次重量，叶片失水率的结果也表明COST1低失水率的表型能够被期自身基因组片段互补(图4c)。因此，我们得出结论，造成COST1突变体的抗旱表型确实是由COST1基因敲除引起的。

[0051] 为了进一步确认COST1突变体表现出的极度抗旱和低叶片失水率低的表型(图4c)。我们通过构建植物RNAi干扰载体，载体构建具体做法为，设计引物从COST1的全长cDNA扩增获得一个长332bp的DNA片段，然后将其连入SmaI酶切的克隆载体pBlueScript II KS(pKS；Stratagene)中，酶切鉴定，将测序正确的质粒利用酶切并回收后连入pcambia1301-RNAi载体中。构建载体所用引物为(见表1)：

[0052] RNAi-COST1F：CGCCGGAGAAAGTGTAAGAAAC

[0053] RNAi-COST1R：TCATTCATGCTCTGTTTTCCTCTC

[0054] 利用根癌农杆菌介导将RNAi载体转入拟南芥中，获得的两个独立的转基因RNAi株系。

[0055] 对四周大小的WT，COST1以及两个RNAi株系控水两周，突变体和RNAi株系明显抗旱(图5a)。

[0056] qPCR定量检测两个RNAi株系中COST1基因的表达量。结果表明在RNAi#1和RNAi#3两个转基因株系中COST1基因表达量分别有约50％和70％的降低(图5b)。

[0057] 剪取四周大小植株的莲座叶约十片，于天平上每隔半个小时测定重量。结果显示COST1突变体和两个COST1基因的RNAi植株失水率降低(图5c)。

[0058] 对十天大小的WT幼苗进行脱水6个小时处理，通过qPCR检测所显示内标基因的表达。对COST1突变体及其对应的野生型材料进行处理(干旱)和不处理，结果显示，与WT对比，在没有处理的COST1突变体中，经qPCR检测，大量逆境相关基因的表达量已经明显上调，这表明COST1是一个组成型逆境响应突变体。与干旱处理的WT对比，干旱处理的COST1突变体背景下，逆境响应基因的表达量上调的更多，也就是qPCR验证部分有代表性的逆境响应基因在COST1中更加明显的上调(图5d)。检测的逆境相应基因包括RD29A，ABI2，ABI5，PP2C，RD22，COR154，KIN1，COR414-TM1和LTP3。

[0059] 三、抑制COST1基因的同源基因表达在其他物种抗旱性进行鉴定

[0060] 为了更加广泛的验证COST1基因在其他物种应用的价值。我们通过蛋白同源序列比对，找到拟南芥COST1基因在其他物种中的同源基因(图4b)。选择进一步研究的植物为单子叶模式植物水稻，双子叶植物番茄和树类植物杨树。通过构建遗传转化的pCAMBIA系列载体(构建载体所用引物见附录9)，利用RNAi干扰技术来抑制对相应的同源基因的表达量；并进一步对这些转基因植物作抗旱性检测。

[0061] 首先，我们利用番茄SlCOST1(ID：Solyc01g091120，SEQ ID NO：3)基因特异引物RNAi-SlCOST1F和RNAi-SlCOST1R扩增得到一个316bp的DNA片段。通过构建遗传转化载体并转化番茄愈伤组织得到三个独立的番茄RNAi株系L1、L19和L2。对3周大小的野生型(WT)和三个独立转基因株系L19、L1和L2控水处理2周后拍摄具有代表性的照片并展示。对三个独立RNAi转基因株系的干旱实验显示，番茄COST1同源基因下调后的转基因植物的抗旱性明显提高(图6)。番茄的遗传转化方法参照括号中的文献所述方法(Zhang et al.，2001)。

[0062] 其次，我们利用水稻中COST1同源基因OsCOST1(ID：Os10g23220，SEQ ID NO：5)基因特异引物RNAi-OsCOST1F和RNAi-OsCOST1R扩增得到一个391bp的DNA片段。通过构建遗传转化的pCAMBIA系列载体(构建载体所用引物序列见表1)并转化水稻愈伤组织得到三个独立的水稻RNAi株系。对4周大小的野生型(WT)和两个独立转基因株系RNAi-OsCOST1-2和RNAi-OsCOST1-11用20％的PEG处理2周后拍摄具有代表性的照片并展示。对水稻的两个独立RNAi转基因株系的干旱实验显示，水稻COST1同源基因下调后的植物的抗旱性明显提高(图7)。水稻的遗传转化参照括号中的文献所述方法(Toki et al.，2006)。

[0063] 再次，我们利用杨树中COST1同源基因PtCOST1(Potri.014G067600，SEQ ID NO：7)和PtCOST2(Potri.002G145900，SEQ ID NO：8)基因特异引物RNAi-PtCOST1F和RNAi-PtCOST1R，RNAi-PtCOST2F和RNAi-PtCOST2R分别扩增得到一个128bp和299bp的DNA片段。通过构建遗传转化的pCAMBIA系列载体(构建载体所用引物见表1)并转化杨树愈伤组织得到三个独立的杨树RNAi株系。对六周大小的野生型(WT)和三个独立RNAi独立转基因株系RNAi-PtCOST1，2-1、RNAi-PtCOST1，2-5和RNAi-PtCOST1，2-9干旱处理三周后拍摄具有代表性的一张照片。对杨树的三个RNAi转基因株系的干旱检测显示，同时敲除杨树中的COST1的两个同源基因PtCOST1和PtCOST2后得到的三个RNAi独立转基因株系更加抗旱(图8)。杨树的遗传转化参照括号中的文献所述方法(Wang et al.，2011)。

[0064] 表1实验中用到的引物

[0065]

[0066]

[0067] 注：*小写字母表示加入到引物中的限制性酶切位点以及保护碱基。

[0068] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，其使用范围也不限于本专利中所述的三个作物，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

[0069] 本发明所引用的文献具体如下：

[0070] BaoY，Wang CT，Jiang CM，Pan J，Zhang GB，Liu H，Zhang HX(2014)The tumor necrosis factor receptor-associated factor(TRAF)-like family protein SEVEN IN ABSENTIA 2(SINA2)promotes drought tolerance in an ABA-dependent manner in Arabidopsis.New Phytol.202(1)：174-87.

[0071] Toki S，Hara N，Ono K，Onodera H，Tagiri A，Oka S，Tanaka H(2006).Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.Plant J.47(6)：969-976.

[0072] Wang  HH，Wang  CT，LiuH，Tang RJ，Zhang  HX(2011)An  efficient Agrobacterium-mediated transformation and regeneration system for leaf explants of two elite aspen hybrid clones Populus alba×P.Berolinensis and Populus Davidiana×P.Bolleana.Plant Cell Rep.30：2037-2044.

[0073] Zhang HX，Blumwald E(2001)Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit.Nat Biotechnol.19：765-768.