一种柑橘属果实前苦味表型相关的分子标记及其应用转让专利
申请号 : CN201810811804.8
文献号 : CN108950045B
文献日 : 2021-03-30
发明人 : 陈嘉景 , 徐娟 , 田静 , 袁子彧 , 李古
申请人 : 华中农业大学
摘要 :
本发明涉及一种柑橘属果实前苦味表型相关的分子标记及其应用。其中，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的分子标记与柑橘属果实的前苦味表型紧密相关，能够有效用于柑橘属各种质果实前苦味表型的鉴定以及柑橘属弱苦味优良种质的筛选，且成本低、操作方便、准确可靠。
权利要求 :
1.一种柑橘属果实前苦味表型相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种用于检测权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
3.一种用于检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物对。
4.一种如权利要求1所述的分子标记的应用，其特征在于，用于柑橘属各种质果实前苦味表型的鉴定，具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的柑橘属植物，其果实为前苦味表型，缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的柑橘属植物，其果实为无前苦味表型。
5.一种如权利要求2所述的引物对的应用，其特征在于，用于柑橘属各种质果实前苦味表型的鉴定，利用所述引物对对待测柑橘属植物基因组DNA进行PCR扩增并检测扩增片段的长度，当能扩增出461bp的扩增片段时，所述待测柑橘属植物具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，其果实为前苦味表型，当不能扩增出核酸片段时，所述待测柑橘属植物缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，其果实为无前苦味表型。
6.一种如权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于，用于柑橘属各种质果实前苦味表型的鉴定，利用所述试剂盒检测柑橘属植物是否具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的柑橘属植物，其果实为前苦味表型，缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的柑橘属植物，其果实为无前苦味表型。
说明书 :
一种柑橘属果实前苦味表型相关的分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子标记及其应用。具体地，本发明涉及柑橘属果实前苦味表型相关的分子标记、用于检测该分子标记的引物对和试剂盒、前述分子标记、引物对、试剂盒的应
用。
用。
背景技术
[0002] 苦味是柑橘属果实的一种重要的品质性状，严重影响着消费者对不同柑橘果品的接受程度。柑橘苦味由两种不同的代谢物质引起：一种是由柠檬苦素和诺米林素等为主的
柠檬苦素类似物引起，因柠檬苦素在果实受伤害后含量的增加常常导致柑橘类果实的后苦
味，另一种则是由类黄酮中的黄烷酮糖苷类引起，与后苦味相对应，诱发柑橘果实的前苦
味。
柠檬苦素类似物引起，因柠檬苦素在果实受伤害后含量的增加常常导致柑橘类果实的后苦
味，另一种则是由类黄酮中的黄烷酮糖苷类引起，与后苦味相对应，诱发柑橘果实的前苦
味。
[0003] 黄烷酮糖苷类是柑橘果实中含量最丰富的类黄酮，且主要分为两大类。一类是无苦味的芸香糖苷类，一类是具有显著苦味的新橘皮糖苷类，前者在柑橘中以柚皮芸香苷和
橙皮苷含量居高，后者以柚皮苷和新橙皮苷占绝对优势。
橙皮苷含量居高，后者以柚皮苷和新橙皮苷占绝对优势。
[0004] 研究表明，各种质柑橘果实中黄烷酮糖苷类两大类物质的组成具有明显的种质特性。例如，在柚和莽山野柑等种质中，仅积累苦味的新橘皮糖苷类，在橘、甜橙、枸橼等种质
中，仅积累无苦味的芸香糖苷类，在部分柑橘杂种如葡萄柚、酸橙等种质中，则同时代谢形
成两大类物质；而在金柑和山金柑中，两大类物质均无法积累。
中，仅积累无苦味的芸香糖苷类，在部分柑橘杂种如葡萄柚、酸橙等种质中，则同时代谢形
成两大类物质；而在金柑和山金柑中，两大类物质均无法积累。
[0005] 由于分属于类黄酮类物质的代谢分支，柑橘中黄烷酮糖苷的生物合成亦源自苯丙烷代谢。在柑橘中，经查尔酮合成酶和查尔酮异构酶催化而来的柚皮素及其它黄烷酮糖苷
配基类，在类黄酮‑7‑O‑葡萄糖苷转移酶的催化作用下形成黄烷酮‑7‑O‑葡萄糖苷，之后经
过1,2‑鼠李糖苷转移酶(1,2RhaT)的催化作用，在柚等种质中形成具有苦味的新橘皮糖苷
类；黄烷酮‑7‑O‑葡萄糖苷或经过1,6‑鼠李糖苷转移酶的催化作用，在橘、甜橙等种质中形
成无苦味的芸香糖苷类。因此，经前人研究及代谢通路分析，部分柑橘种质如甜橙中新橘皮
糖苷类的代谢中断极有可能是1,2RhaT蛋白的功能缺失所致。
配基类，在类黄酮‑7‑O‑葡萄糖苷转移酶的催化作用下形成黄烷酮‑7‑O‑葡萄糖苷，之后经
过1,2‑鼠李糖苷转移酶(1,2RhaT)的催化作用，在柚等种质中形成具有苦味的新橘皮糖苷
类；黄烷酮‑7‑O‑葡萄糖苷或经过1,6‑鼠李糖苷转移酶的催化作用，在橘、甜橙等种质中形
成无苦味的芸香糖苷类。因此，经前人研究及代谢通路分析，部分柑橘种质如甜橙中新橘皮
糖苷类的代谢中断极有可能是1,2RhaT蛋白的功能缺失所致。
[0006] 因此，着手开发合理的1,2‑鼠李糖苷转移酶分子标记，对柑橘选育中弱苦味优良种质的初步筛选具有重要的科学意义和经济价值。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题是根据1,2RhaT基因的已知序列，获得与柑橘属果实前苦味性状相关的分子标记。
[0008] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0009] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种柑橘属果实前苦味表型相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ ID NO:1核苷酸序列如下
(461bp)：
(461bp)：
[0010] ATCCAAGAACCTACCTTCAAGGAAGATGATACAAAGATCATGGACTGGCTGAGCCAAAAGGAGCCTCGTTCAGTCGTGTATGCATCCTTTGGCAGTGAGTACTTTCCTTCCAAGGATGAAATACATGAGATAGCTAGTGGGTTA
TTGCTCAGCGAGGTTAATTTTATATGGGCTTTCAGATTACATCCTGATGAAAAAATGACTATCGAGGAGGCACTGC
CTCAGGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGATAGTACAAGGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAAT
TTTAAGGCATGGAAGCATCGGCGGATTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGCTCGGTGGTTGAGGGGATGGTTTTCGGG
GTACCAATCATAGGTGTGCCAATGGCATATGAGCAGCCAAGCAATGCCAAGGTGGTGGTTGACAATGGTATGGGCA
TGGTCGTTCCAAG。
TTGCTCAGCGAGGTTAATTTTATATGGGCTTTCAGATTACATCCTGATGAAAAAATGACTATCGAGGAGGCACTGC
CTCAGGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGATAGTACAAGGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAAT
TTTAAGGCATGGAAGCATCGGCGGATTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGCTCGGTGGTTGAGGGGATGGTTTTCGGG
GTACCAATCATAGGTGTGCCAATGGCATATGAGCAGCCAAGCAATGCCAAGGTGGTGGTTGACAATGGTATGGGCA
TGGTCGTTCCAAG。
[0011] 根据本发明的实施例，具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的柑橘属植物个体，其果实表现为具有前苦味特征；缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的柑橘属植物个体，其果实表
现为无前苦味特征。
现为无前苦味特征。
[0012] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的分子标记的引物对，所述引物对分别具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。具体地，本发明
的引物对的序列如下所示：
的引物对的序列如下所示：
[0013] 5’‑ATCCAAGAACCTACCTTCAAG‑3’(SEQ ID NO:2)
[0014] 5’‑CTTGGAACGACCATGCCCATACCAT‑3’(SEQ ID NO:3)
[0015] 利用所述引物对对待测柑橘属植物基因组DNA进行PCR扩增并检测扩增片段的长度：当能扩增出461bp的扩增片段时，所述待测柑橘属植物具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序
列，其果实表现为具有前苦味特征；当不能扩增出此核酸片段时，所述待测柑橘属植物缺失
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，其果实表现为无前苦味特征，该引物对具有特异性，无法扩
增出其他长度的片段。
列，其果实表现为具有前苦味特征；当不能扩增出此核酸片段时，所述待测柑橘属植物缺失
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，其果实表现为无前苦味特征，该引物对具有特异性，无法扩
增出其他长度的片段。
[0016] 根据本发明的实施例，利用凝胶电泳优选琼脂糖凝胶电泳，检测是否存在扩增片段以及扩增片段的长度。
[0017] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述分子标记的试剂盒，该试剂盒包含前述用于检测本发明的分子标记的引物对。
[0018] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的分子标记在柑橘属各种质果实前苦味表型的鉴定或柑橘属弱苦味优良种质的筛选中的应用。
[0019] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的引物对在柑橘属各种质果实前苦味表型的鉴定或柑橘属弱苦味优良种质筛选中的应用。
[0020] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的试剂盒在柑橘属各种质果实前苦味表型的鉴定或柑橘属弱苦味优良种质筛选中的应用。
[0021] 需要说明的是，本发明的与柑橘属果实前苦味相关的分子标记及其应用具有如下优点：
[0022] (1)本发明提供的柑橘属果实前苦味表型相关的分子标记不受果树生长阶段的限制，可用于柑橘属种质的早期选育与筛选，进而能够实现短时间、低成本、高准确性地选育
筛选出弱苦味优良种质；
筛选出弱苦味优良种质；
[0023] (2)检测柑橘属果实前苦味表型相关的分子标记的方法，准确可靠，操作方便。
附图说明
[0024] 图1为本发明分子标记与各柑橘属果实中柚皮苷和新橙皮苷代谢共分离结果。其中，每个栽培种的分子标记通过凝脂糖琼胶电泳检测；果实中柚皮苷和新橙皮苷通过HPLC
和LC‑MS进行检测，上方虚线框中位于25.974分钟的色谱峰代表柚皮苷积累，下方虚线框中
位于28.901分钟的色谱峰代表新橙皮苷积累。
和LC‑MS进行检测，上方虚线框中位于25.974分钟的色谱峰代表柚皮苷积累，下方虚线框中
位于28.901分钟的色谱峰代表新橙皮苷积累。
具体实施方式
[0025] 以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0026] 实施例1：分子标记开发
[0027] 柑橘果实的前苦味来源于新橘皮糖苷类的积累，经过代谢通路分析，部分柑橘种质果实中新橘皮糖苷类的代谢中断极有可能是1,2RhaT蛋白的功能缺失所致，柚Cm1,2RhaT
基因(GenBank accession:AY048882)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：
基因(GenBank accession:AY048882)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：
[0028] ATGGATACCAAGCATCAAGATAAGCCAAGCATTCTCATGTTACCATGGCTAGCTCATGGGCACATAGCTCCACACCTTGAACTTGCCAAGAAGCTTTCACAGAAAAACTTCCACATATATTTCTGCTCTACTCCCAACAATCTA
CAATCCTTCGGCAGAAATGTTGAAAAAAACTTCTCATCTTCAATACAACTCATAGAACTGCAACTTCCCAATACAT
TCCCTGAACTTCCTTCACAAAATCAGACCACAAAAAACCTTCCTCCCCATCTTATTTATACTCTCGTGGGAGCATT
TGAAGATGCAAAACCTGCTTTTTGCAACATCTTGGAGACGCTTAAACCAACCCTTGTTATGTATGATTTGTTCCAA
CCATGGGCAGCAGAGGCAGCTTACCAGTATGACATAGCTGCTATTTTGTTCTTACCCTTATCTGCAGTAGCCTGCT
CTTTCTTGCTGCACAATATCGTAAATCCCAGCCTGAAATACCCTTTCTTTGAATCTGATTACCAAGATAGAGAAAG
CAAGAACATCAATTACTTCCTGCATCTTACTGCCAATGGCACCTTAAACAAAGACAGGTTCTTAAAAGCTTTCGAA
CTATCTTGCAAATTTGTGTTCATCAAAACATCAAGAGAGATTGAATCCAAGTACTTGGATTATTTTCCTTCTTTAA
TGGGAAATGAAATAATTCCAGTAGGGCCTCTAATCCAAGAACCTACCTTCAAGGAAGATGATACAAAGATCATGGA
CTGGCTGAGCCAAAAGGAGCCTCGTTCAGTCGTGTATGCATCCTTTGGCAGTGAGTACTTTCCTTCCAAGGATGAA
ATACATGAGATAGCTAGTGGGTTATTGCTCAGCGAGGTTAATTTTATATGGGCTTTCAGATTACATCCTGATGAAA
AAATGACTATCGAGGAGGCACTGCCTCAGGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGATAGTACA
AGGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAATTTTAAGGCATGGAAGCATCGGCGGATTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGCTCG
GTGGTTGAGGGGATGGTTTTCGGGGTACCAATCATAGGTGTGCCAATGGCATATGAGCAGCCAAGCAATGCCAAGG
TGGTGGTTGACAATGGTATGGGCATGGTCGTTCCAAGAGATAAGATCAATCAAAGACTTGGAGGAGAGGAGGTGGC
GAGGGTCATTAAACATGTTGTGCTGCAAGAAGAAGCGAAGCAAATAAGAAGAAAAGCTAATGAAATTAGTGAGAGT
ATGAAGAAGATAGGGGACGCAGAGATGAGTGTGGTGGTGGAGAAGCTGCTGCAGCTTGTCAAGAAATCTGAATAA。
CAATCCTTCGGCAGAAATGTTGAAAAAAACTTCTCATCTTCAATACAACTCATAGAACTGCAACTTCCCAATACAT
TCCCTGAACTTCCTTCACAAAATCAGACCACAAAAAACCTTCCTCCCCATCTTATTTATACTCTCGTGGGAGCATT
TGAAGATGCAAAACCTGCTTTTTGCAACATCTTGGAGACGCTTAAACCAACCCTTGTTATGTATGATTTGTTCCAA
CCATGGGCAGCAGAGGCAGCTTACCAGTATGACATAGCTGCTATTTTGTTCTTACCCTTATCTGCAGTAGCCTGCT
CTTTCTTGCTGCACAATATCGTAAATCCCAGCCTGAAATACCCTTTCTTTGAATCTGATTACCAAGATAGAGAAAG
CAAGAACATCAATTACTTCCTGCATCTTACTGCCAATGGCACCTTAAACAAAGACAGGTTCTTAAAAGCTTTCGAA
CTATCTTGCAAATTTGTGTTCATCAAAACATCAAGAGAGATTGAATCCAAGTACTTGGATTATTTTCCTTCTTTAA
TGGGAAATGAAATAATTCCAGTAGGGCCTCTAATCCAAGAACCTACCTTCAAGGAAGATGATACAAAGATCATGGA
CTGGCTGAGCCAAAAGGAGCCTCGTTCAGTCGTGTATGCATCCTTTGGCAGTGAGTACTTTCCTTCCAAGGATGAA
ATACATGAGATAGCTAGTGGGTTATTGCTCAGCGAGGTTAATTTTATATGGGCTTTCAGATTACATCCTGATGAAA
AAATGACTATCGAGGAGGCACTGCCTCAGGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGATAGTACA
AGGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAATTTTAAGGCATGGAAGCATCGGCGGATTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGCTCG
GTGGTTGAGGGGATGGTTTTCGGGGTACCAATCATAGGTGTGCCAATGGCATATGAGCAGCCAAGCAATGCCAAGG
TGGTGGTTGACAATGGTATGGGCATGGTCGTTCCAAGAGATAAGATCAATCAAAGACTTGGAGGAGAGGAGGTGGC
GAGGGTCATTAAACATGTTGTGCTGCAAGAAGAAGCGAAGCAAATAAGAAGAAAAGCTAATGAAATTAGTGAGAGT
ATGAAGAAGATAGGGGACGCAGAGATGAGTGTGGTGGTGGAGAAGCTGCTGCAGCTTGTCAAGAAATCTGAATAA。
[0029] 经基因克隆及全基因组序列比对发现，部分柑橘属种质如甜橙、柚等中存在一条与柚Cm1,2RhaT基因核苷酸序列同源性为92％的基因序列，将其命名为dGlcT‑1，甜橙
dGlcT‑1基因(CsdGlcT‑1)的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示：
dGlcT‑1基因(CsdGlcT‑1)的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示：
[0030] ATGGATACCAAGCATCAAGATAAGCCAAGCATTCTCATGTTACCATGGCTAGCTCATGGGCACATATCTACATACCTTGAACTTACCAAGAAGCTTTCACAGAAAAACTTTCACATATATTTCTGCTCTACTCCCATCAATCTA
CAATCCATCAGCAAAAATGATGAAGAAAACTTCTTATCTTCAATACAACTCATAGAACTGCAACTTCCCAATACAT
TCCCTGAACTTCCTCCACAAAATCACACCACAAAAAACCTTCCTCCCCATCTTATTTTACTCTCGTGGCAGCATTT
GAAGATGCAAAACCAGCATTTTGCAACATCCTGGAGACGCTTAAACCAACCCTTGTTATGTATGATTTATTCCAAC
CATGGGCAGCAGAGGCAGCTTACCAGTATCACATAGCTGCTGTTTTGTTCTTAACCATATCTGCAGTAGCCGGTTC
TTACTTGCTGCACAATATCATAAATCCCAGCCTGAAGTACCCTTTCTTTGAATCTGACTTCCTCGATAGAGAAAAC
AAGAAAATCAACCGCTTCATGCATCCTACTGCCAATGGCACCTTAAACAAAGACAGGAACTTAAAAGCTTTTGAAC
TATCTTGCAAATTTGTGTTCATCAAAACATCAAGAGAGATCGAATCCAAGTACTTGGATTATTTTCCTTCTTTGAT
GGAAAATGAAATAGTTCCAGTTGGGCCTCTAGTTCAAGAATCTATATTCAAAGAAGATGATACGAAGATTATGGAC
TGGCTGAGCCAAAAGGAGCCTTGGTCAGTAGTGTTTGTATCATTTGGCAGTGAGTACTTTCTTTCCAAGGATGAAA
TGCATGAGATAGCCAGTGGGTTATTGCTCAGCGAGGTTAGTTTTATACGGGTTTTGAGATTACATCCTGATGAAAA
AATTACTATCGAGGAGGCACTGCCTCAAGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGTTAGTACAA
GGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAATTTTAAGGCATGGAAGGATCGGCGGTTTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGTTCGG
CAGTTGAAGGGATGGTGTTCGGGGTACCAATCATAGCTATGCCAATGGTATATGAGCAGTCAAGGAATGCCAAAGT
GGTGGTTGATATCGGTATGGGCATGGACGTGCCGAGAGATAAGATCAATCAAAGACTTAGAAGAGAGGAGGTGGCA
AGGGTCATTAAACATGTTTTGCTGCAAGAAGAAGGGAAGCAAATAAGAAGAAAAGCTAAAGAAATGAGTGAGAGGA
TGAGAAGATAGGAGACTCAGAGATGAATGTGGTAGTGGAGAAGCTGCTGCTGCTTGTTAAGAAATCTGAATAA。
CAATCCATCAGCAAAAATGATGAAGAAAACTTCTTATCTTCAATACAACTCATAGAACTGCAACTTCCCAATACAT
TCCCTGAACTTCCTCCACAAAATCACACCACAAAAAACCTTCCTCCCCATCTTATTTTACTCTCGTGGCAGCATTT
GAAGATGCAAAACCAGCATTTTGCAACATCCTGGAGACGCTTAAACCAACCCTTGTTATGTATGATTTATTCCAAC
CATGGGCAGCAGAGGCAGCTTACCAGTATCACATAGCTGCTGTTTTGTTCTTAACCATATCTGCAGTAGCCGGTTC
TTACTTGCTGCACAATATCATAAATCCCAGCCTGAAGTACCCTTTCTTTGAATCTGACTTCCTCGATAGAGAAAAC
AAGAAAATCAACCGCTTCATGCATCCTACTGCCAATGGCACCTTAAACAAAGACAGGAACTTAAAAGCTTTTGAAC
TATCTTGCAAATTTGTGTTCATCAAAACATCAAGAGAGATCGAATCCAAGTACTTGGATTATTTTCCTTCTTTGAT
GGAAAATGAAATAGTTCCAGTTGGGCCTCTAGTTCAAGAATCTATATTCAAAGAAGATGATACGAAGATTATGGAC
TGGCTGAGCCAAAAGGAGCCTTGGTCAGTAGTGTTTGTATCATTTGGCAGTGAGTACTTTCTTTCCAAGGATGAAA
TGCATGAGATAGCCAGTGGGTTATTGCTCAGCGAGGTTAGTTTTATACGGGTTTTGAGATTACATCCTGATGAAAA
AATTACTATCGAGGAGGCACTGCCTCAAGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGTTAGTACAA
GGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAATTTTAAGGCATGGAAGGATCGGCGGTTTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGTTCGG
CAGTTGAAGGGATGGTGTTCGGGGTACCAATCATAGCTATGCCAATGGTATATGAGCAGTCAAGGAATGCCAAAGT
GGTGGTTGATATCGGTATGGGCATGGACGTGCCGAGAGATAAGATCAATCAAAGACTTAGAAGAGAGGAGGTGGCA
AGGGTCATTAAACATGTTTTGCTGCAAGAAGAAGGGAAGCAAATAAGAAGAAAAGCTAAAGAAATGAGTGAGAGGA
TGAGAAGATAGGAGACTCAGAGATGAATGTGGTAGTGGAGAAGCTGCTGCTGCTTGTTAAGAAATCTGAATAA。
[0031] 柚dGlcT‑1基因(CmdGlcT‑1)的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示：
[0032] ATGGATACCAAGCATCAAGATAAGCCAAGTATTCTCATGTTACCATGGCTAGCTCATGGGCACATATCTACATACCTTGAACTTACCAAGAAGCTTTCACAGAAAAACTTTCACATATATTTCTGCTCTACTCCCATCAATCTA
CAATCCATCAGCAAAAATGATGAAGAAAACTTCTCATCTTCAATACAACTCATAGAACTGCAACTTCCCAATACAT
TCCCTGAACTTCCTCCACAAAATCACACCACAAAAAACCTTCCTCCCCATCTTATTTTTACTCTCATGGCAGCATT
TGAAGATGCAAAACCAGCATTTTGCAACATCCTGGAGACGCTTAAACCAACCCTTGTTATGTATGGTTTATTCCAA
CCATGGGCAGCAGAGGCGGCTTACCAGTATCACATAGCTGCTGTTTTGTTCTTAACCATATCTGCAGTAGCCGGTT
CTTACTTGCTGCACAATATCATAAATCCCAGCCTGAAGTACCCTTTCTTTGAATCTGACTTCCTCGATAGAGAAAA
CAAGAAAATCAACCGCTTCATGCATCGTACTGCCAATGGCACCTTAAACAAAGACAGGAACTTAAAAGCTTTTGAA
CTATCTTGCAAATTTGTGTTCATCAAAACATCAAGAGAGATCGAATCCAAGTACTTGGATTATTTTCCTTCTTTGA
TGGAAAATGAAATAGTTCCAGTTGGGCCTCTAGTTCAAGAATCTATATTCAAAGAAGATGATACGAAGATTATGGA
CTGGCTGAGTCAAAAGGAGCCTTGGTCAGTAGTGTTTGTATCATTTGGCAGCGAGTACTTTCTTTCCAAGGATGAA
ATGCATGAGATAGCCAGTGGGTTATTGCTCAGCGAGGTTAGTTTTATATGGGTTTTGAGATTACATCCTGATGAAA
AAATTACTATCGAGGAGGCACTGCCTCAAGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGTTAGTACA
AGGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAATTTTAAGGCATGGAAGGATCGGCGGATTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGTTCG
GCAGTTGAAGGGATGGTGTTCGGGGTACCAATCATAGCTATGCCAATGGTATATGAGCAGTCAGGGAATGCCAAAG
TGGTGGTTGATATCGGTATGGGCATGGACGTGCCGACAGATAAGATCAATCAAAGACTTAGAAGAGAGGAGGTGGC
AAGGGTCATTAAACATGTTGTGCTGCAAGAAGAAGGGAAGCAAATAAGAAGAAAAGCTAAAGAAATGAGTGAGAGG
ATGAAGAAGATAGGAGACTCAGAGATGAATGTGGTAGTGGAGAAGCTGCTGCAGCTTGTTAAGAAATCTGAATAA。
CAATCCATCAGCAAAAATGATGAAGAAAACTTCTCATCTTCAATACAACTCATAGAACTGCAACTTCCCAATACAT
TCCCTGAACTTCCTCCACAAAATCACACCACAAAAAACCTTCCTCCCCATCTTATTTTTACTCTCATGGCAGCATT
TGAAGATGCAAAACCAGCATTTTGCAACATCCTGGAGACGCTTAAACCAACCCTTGTTATGTATGGTTTATTCCAA
CCATGGGCAGCAGAGGCGGCTTACCAGTATCACATAGCTGCTGTTTTGTTCTTAACCATATCTGCAGTAGCCGGTT
CTTACTTGCTGCACAATATCATAAATCCCAGCCTGAAGTACCCTTTCTTTGAATCTGACTTCCTCGATAGAGAAAA
CAAGAAAATCAACCGCTTCATGCATCGTACTGCCAATGGCACCTTAAACAAAGACAGGAACTTAAAAGCTTTTGAA
CTATCTTGCAAATTTGTGTTCATCAAAACATCAAGAGAGATCGAATCCAAGTACTTGGATTATTTTCCTTCTTTGA
TGGAAAATGAAATAGTTCCAGTTGGGCCTCTAGTTCAAGAATCTATATTCAAAGAAGATGATACGAAGATTATGGA
CTGGCTGAGTCAAAAGGAGCCTTGGTCAGTAGTGTTTGTATCATTTGGCAGCGAGTACTTTCTTTCCAAGGATGAA
ATGCATGAGATAGCCAGTGGGTTATTGCTCAGCGAGGTTAGTTTTATATGGGTTTTGAGATTACATCCTGATGAAA
AAATTACTATCGAGGAGGCACTGCCTCAAGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGTTAGTACA
AGGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAATTTTAAGGCATGGAAGGATCGGCGGATTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGTTCG
GCAGTTGAAGGGATGGTGTTCGGGGTACCAATCATAGCTATGCCAATGGTATATGAGCAGTCAGGGAATGCCAAAG
TGGTGGTTGATATCGGTATGGGCATGGACGTGCCGACAGATAAGATCAATCAAAGACTTAGAAGAGAGGAGGTGGC
AAGGGTCATTAAACATGTTGTGCTGCAAGAAGAAGGGAAGCAAATAAGAAGAAAAGCTAAAGAAATGAGTGAGAGG
ATGAAGAAGATAGGAGACTCAGAGATGAATGTGGTAGTGGAGAAGCTGCTGCAGCTTGTTAAGAAATCTGAATAA。
[0033] 通过基因转化BY‑2烟草细胞悬浮系结合底物转化实验发现，dGlcT‑1催化黄烷酮‑7‑O‑葡萄糖苷形成非苦的黄烷酮‑7‑O‑二‑葡萄糖苷，而1,2RhaT则催化同样的底物形成苦
味的新橘皮糖苷类，两者同源性极高但催化能力截然不同。
味的新橘皮糖苷类，两者同源性极高但催化能力截然不同。
[0034] 因此，开发柑橘属果实前苦味表型相关的分子标记应该开发1,2RhaT基因的分子标记，同时应避免与1,2RhaT基因高同源的dGlcT‑1基因的干扰。通过Clustal及GeneDoc3.2
软件进行1,2RhaT基因与柚CmdGlcT‑1基因和甜橙CsdGlcT‑1基因的比对并寻找片段差异较
大的部分设计分子标记，序列如SEQ ID NO:1所示：
软件进行1,2RhaT基因与柚CmdGlcT‑1基因和甜橙CsdGlcT‑1基因的比对并寻找片段差异较
大的部分设计分子标记，序列如SEQ ID NO:1所示：
[0035] ATCCAAGAACCTACCTTCAAGGAAGATGATACAAAGATCATGGACTGGCTGAGCCAAAAGGAGCCTCGTTCAGTCGTGTATGCATCCTTTGGCAGTGAGTACTTTCCTTCCAAGGATGAAATACATGAGATAGCTAGTGGGTTA
TTGCTCAGCGAGGTTAATTTTATATGGGCTTTCAGATTACATCCTGATGAAAAAATGACTATCGAGGAGGCACTGC
CTCAGGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGATAGTACAAGGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAAT
TTTAAGGCATGGAAGCATCGGCGGATTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGCTCGGTGGTTGAGGGGATGGTTTTCGGG
GTACCAATCATAGGTGTGCCAATGGCATATGAGCAGCCAAGCAATGCCAAGGTGGTGGTTGACAATGGTATGGGCA
TGGTCGTTCCAAG。
TTGCTCAGCGAGGTTAATTTTATATGGGCTTTCAGATTACATCCTGATGAAAAAATGACTATCGAGGAGGCACTGC
CTCAGGGCTTTGCTGAGGAGATTGAAAGGAATAATAAGGGAATGATAGTACAAGGTTGGGTTCCGCAGGCTAAAAT
TTTAAGGCATGGAAGCATCGGCGGATTTTTGAGTCATTGTGGTTGGGGCTCGGTGGTTGAGGGGATGGTTTTCGGG
GTACCAATCATAGGTGTGCCAATGGCATATGAGCAGCCAAGCAATGCCAAGGTGGTGGTTGACAATGGTATGGGCA
TGGTCGTTCCAAG。
[0036] 实施例2：分子标记的果实前苦味表型相关性验证
[0037] 对实施例1中确定的柑橘果实前苦味表型相关的分子标记(SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列)进行验证，具体如下：
[0038] 针对上述分子标记设计引物，引物序列如下：
[0039] 正向引物：5’‑ATCCAAGAACCTACCTTCAAG‑3’(SEQ ID NO:2)；
[0040] 反向引物：5’‑CTTGGAACGACCATGCCCATACCAT‑3’(SEQ ID NO:3)。
[0041] 利用上述引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该标记的多态性和扩增稳定性。
[0042] 2.1实验材料
[0043] 如表1所示，共收集柑橘属88个柑橘栽培种的成熟果实和幼嫩叶片材料。其中包括24种柚类、24种宽皮橘类、24种橙类、9种枸橼类、2种大翼橙以及5种宜昌橙，每个栽培种的
缩写如表1所示。成熟果实的汁胞用于进行类黄酮代谢分析，而幼嫩叶片用于进行基因组
DNA的提取，所有材料经处理后立即进行液氮冷冻，并保存在‑80℃备用。
缩写如表1所示。成熟果实的汁胞用于进行类黄酮代谢分析，而幼嫩叶片用于进行基因组
DNA的提取，所有材料经处理后立即进行液氮冷冻，并保存在‑80℃备用。
[0044]
[0045] 表1
[0046] 2.2柑橘果实中黄烷酮糖苷类的提取及定性分析
[0047] 分别取88个柑橘栽培种的果实冻干粉0.1g加入到含有5ml 80％甲醇的离心管中，在FS60超声萃取仪(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中40℃恒温震荡60min。每个样品
的提取产物经离心后，取1ml上清经0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC以及LC‑MS等分析。
的提取产物经离心后，取1ml上清经0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC以及LC‑MS等分析。
[0048] 采用HPLC系统(1525双元梯度泵、717自动进样器联合2996PDA检测器)对类黄酮进行检测并分析，C18Hypersil GOLD色谱柱(4.6×250mm，5μm,Thermo scientific，USA)用来
分离类黄酮。流动相A为0.1％的甲酸，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈。流动相洗脱条件
为：0‑20min 10‑20％B；20‑35min 20‑25％B；35‑55min 25‑35％B；55‑65min 35‑55％B；65‑
70min 55‑75％B；70‑75min 75％B；75‑78min 75‑10％B；78‑80min 10％B。在整个检测阶
段，流速为1ml/min，进样体积为10μl，且柱温维持在35℃。紫外检测范围为210‑400nm，检测
波长为280nm。采用1200系列高分辨率HPLC系统串联QTOF6520质谱仪(Agilent
Technologies,Palo Alto,CA,USA)进行类黄酮定性分析。利用Zorbax Eclipse Plus C18
反向色谱柱(2.1×100mm，1.8mm Agilent Technologies，USA)进行类黄酮分离，且进样量
为2μl。其中，流动相A为0.1％的甲酸，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈。流动相洗脱条件
为：0min–10％B；20min–95％B；22min–95％B；22.1min–10％B；30min–10％B。在整个检测阶
段，流动相流量被设定为0.3ml/min，且柱温维持在35℃。另外，电喷雾离子化源按照如下条
件设定：气体温度为350℃，干燥的气体流速为10ml/min，雾化压力为40psig；正离子模式下
的毛细管电压均为3.5kV，碰撞电压为135V，Skimmer电压为65V。
分离类黄酮。流动相A为0.1％的甲酸，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈。流动相洗脱条件
为：0‑20min 10‑20％B；20‑35min 20‑25％B；35‑55min 25‑35％B；55‑65min 35‑55％B；65‑
70min 55‑75％B；70‑75min 75％B；75‑78min 75‑10％B；78‑80min 10％B。在整个检测阶
段，流速为1ml/min，进样体积为10μl，且柱温维持在35℃。紫外检测范围为210‑400nm，检测
波长为280nm。采用1200系列高分辨率HPLC系统串联QTOF6520质谱仪(Agilent
Technologies,Palo Alto,CA,USA)进行类黄酮定性分析。利用Zorbax Eclipse Plus C18
反向色谱柱(2.1×100mm，1.8mm Agilent Technologies，USA)进行类黄酮分离，且进样量
为2μl。其中，流动相A为0.1％的甲酸，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈。流动相洗脱条件
为：0min–10％B；20min–95％B；22min–95％B；22.1min–10％B；30min–10％B。在整个检测阶
段，流动相流量被设定为0.3ml/min，且柱温维持在35℃。另外，电喷雾离子化源按照如下条
件设定：气体温度为350℃，干燥的气体流速为10ml/min，雾化压力为40psig；正离子模式下
的毛细管电压均为3.5kV，碰撞电压为135V，Skimmer电压为65V。
[0049] 在柑橘中，含量最为丰富的类黄酮是黄烷酮糖苷类，黄烷酮糖苷类又包括具有苦味的新橘皮糖苷类，以及无苦味的芸香糖苷类。其中新橘皮糖苷类主要由新圣草次苷，柚皮
苷，新橙皮苷和枳属苷构成，且以柚皮苷和新橙皮苷含量最为丰富；而芸香糖苷类则主要由
圣草次苷，柚皮芸香苷，橙皮苷和香风草苷构成，且以柚皮芸香苷和橙皮苷为主。这八种黄
烷酮糖苷类物质在HPLC中的保留时间和紫外光谱吸收，及在LC/MS中正离子模式下的键断
裂规律如表2所示。用来进行质谱分析的软件为Agilent MassHunter Qualitative
Analysis(Agilent Corporation,MA,USA)。
苷，新橙皮苷和枳属苷构成，且以柚皮苷和新橙皮苷含量最为丰富；而芸香糖苷类则主要由
圣草次苷，柚皮芸香苷，橙皮苷和香风草苷构成，且以柚皮芸香苷和橙皮苷为主。这八种黄
烷酮糖苷类物质在HPLC中的保留时间和紫外光谱吸收，及在LC/MS中正离子模式下的键断
裂规律如表2所示。用来进行质谱分析的软件为Agilent MassHunter Qualitative
Analysis(Agilent Corporation,MA,USA)。
[0050] 保留时间(Min) 紫外光谱吸收(UV‑Vis) 键断裂规律(母离子，碎片离子)圣草次苷 19.545 284,328 597[M+H]+,289[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
新圣草次苷 21.191 284,332.7 597[M+H]+,289[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
柚皮芸香苷 24.276 282.8,330.4 581[M+H]+,273[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
柚皮苷 25.974 283.1,330.5 581[M+H]+,273[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
橙皮苷 27.082 284.3,328.2 611[M+H]+,303[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
新橙皮苷 28.901 284.3,332.8 611[M+H]+,303[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
香风草苷 40.607 282.8,329.2 595[M+H]+,287[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
枳属苷 41.523 284.3,332.9 595[M+H]+,287[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
新圣草次苷 21.191 284,332.7 597[M+H]+,289[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
柚皮芸香苷 24.276 282.8,330.4 581[M+H]+,273[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
柚皮苷 25.974 283.1,330.5 581[M+H]+,273[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
橙皮苷 27.082 284.3,328.2 611[M+H]+,303[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
新橙皮苷 28.901 284.3,332.8 611[M+H]+,303[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
香风草苷 40.607 282.8,329.2 595[M+H]+,287[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
枳属苷 41.523 284.3,332.9 595[M+H]+,287[M+H‑rhamnosy‑glucosyl]+
[0051] 表2
[0052] 各类黄酮代谢物通过对比相应商业标准品的保留时间、紫外光谱吸收(UV‑Vis)及其键断裂规律来进行精准定性，同时结合质谱数据库(http://www.massbank.jp)乃至文献
报道进行辅助定性。
报道进行辅助定性。
[0053] 2.3不同柑橘种质基因组DNA的提取及分子标记扩增
[0054] 使用新型植物DNA提取试剂盒(DN‑Plant DNA Mini Kit；Aidlab,China)完成对采集的88种柑橘种质的幼嫩叶片的基因组DNA的提取，利用上述分子标记的特异性引物对分
别对不同材料进行PCR扩增，PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，57℃退火30s，
72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；12℃30min。
别对不同材料进行PCR扩增，PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，57℃退火30s，
72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；12℃30min。
[0055] 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测各柑橘种质中是否存在分子标记。
[0056] 2.4结果
[0057] 如图1所示，HPLC以及LC‑MS检测结果显示，在选择的24种柚类(17种柚、5种葡萄柚以及2种柚杂种)栽培种果实中，均积累苦味的新橘皮糖苷类。而且在所选择的的柚类果实
中，柚皮柑是其含量占绝对优势的新橘皮糖苷类；而在葡萄柚中的鸡尾葡萄柚(JW)以及柚
杂种中的奥布兰科(OBL)果实中，除了柚皮柑外，还大量积累苦味的新橙皮苷。利用分子标
记特异性引物进行PCR检测结果显示，在所选择的24种柚类DNA中，均检测到了实施例1中分
子标记的存在；
中，柚皮柑是其含量占绝对优势的新橘皮糖苷类；而在葡萄柚中的鸡尾葡萄柚(JW)以及柚
杂种中的奥布兰科(OBL)果实中，除了柚皮柑外，还大量积累苦味的新橙皮苷。利用分子标
记特异性引物进行PCR检测结果显示，在所选择的24种柚类DNA中，均检测到了实施例1中分
子标记的存在；
[0058] 所选的24种橙类栽培种包括18种甜橙和6种酸橙，而甜橙又由6种普通甜橙、9种脐橙以及3种血橙组成。HPLC以及LC‑MS检测结果显示，所有的18种甜橙果实均无法积累苦味
的新橘皮糖苷类，而6种酸橙中则大量积累苦味的新橘皮糖苷类。其中，柚皮柑和新橙皮苷
是酸橙果实中含量最为丰富的新橘皮糖苷类。利用分子标记特异性引物进行PCR检测结果
显示，所选的18种甜橙均未检测到实施例1中分子标记的存在。而在6种酸橙基因组DNA中，
则均检测到前面所述分子标记的存在。
的新橘皮糖苷类，而6种酸橙中则大量积累苦味的新橘皮糖苷类。其中，柚皮柑和新橙皮苷
是酸橙果实中含量最为丰富的新橘皮糖苷类。利用分子标记特异性引物进行PCR检测结果
显示，所选的18种甜橙均未检测到实施例1中分子标记的存在。而在6种酸橙基因组DNA中，
则均检测到前面所述分子标记的存在。
[0059] 所选的24种宽皮柑橘类包括橘、柑和杂柑类。HPLC以及LC‑MS检测结果显示，仅部分杂柑或者莽山野柑(特殊种质)果实中能够积累苦味的新橘皮糖苷类。不同于其他种质，
瓯柑(OG)中含量最为丰富的是新橙皮苷，而不是柚皮柑，而在所选的橘类和柑类栽培种果
实中，则均无法检测到新橘皮糖苷的存在。利用分子标记特异性引物进行PCR检测结果显
示，在所选的20种橘类和柑类DNA中，均未检测到实施例1中分子标记的存在，而在瓯柑
(OG)、丑柑(CG)、药香柑(YXG)以及莽山野柑(MSYG)基因组DNA中，则均检测到分子标记的存
在。
瓯柑(OG)中含量最为丰富的是新橙皮苷，而不是柚皮柑，而在所选的橘类和柑类栽培种果
实中，则均无法检测到新橘皮糖苷的存在。利用分子标记特异性引物进行PCR检测结果显
示，在所选的20种橘类和柑类DNA中，均未检测到实施例1中分子标记的存在，而在瓯柑
(OG)、丑柑(CG)、药香柑(YXG)以及莽山野柑(MSYG)基因组DNA中，则均检测到分子标记的存
在。
[0060] HPLC以及LC‑MS检测结果显示，所选的9种枸橼类果实中，均未积累苦味的新橘皮糖苷类；而在2种大翼橙和5种宜昌橙果实中，均检测到苦味的新橘皮糖苷类的存在。利用分
子标记特异性引物进行PCR检测结果显示，在所选的9种枸橼类DNA中，均未检测到实施例1
中分子标记的存在；而在大翼橙和宜昌橙基因组DNA中，则均检测到前述分子标记的存在。
子标记特异性引物进行PCR检测结果显示，在所选的9种枸橼类DNA中，均未检测到实施例1
中分子标记的存在；而在大翼橙和宜昌橙基因组DNA中，则均检测到前述分子标记的存在。
[0061] 结果表明，在所选的88种柑橘种质中，实施例1的分子标记能够准确用于柑橘属果实新橘皮糖苷类所诱发的前苦味表型的鉴定。
[0062] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。