一种苯并芘半抗原的制备方法及其用途转让专利
申请号 : CN201810548480.3
文献号 : CN108997103B
文献日 : 2021-03-30
发明人 : 庄惠生 , 马振
申请人 : 上海交通大学
摘要 :
权利要求 :
1.苯并芘半抗原在制备苯并芘人工包被原中的应用,所述苯并芘半抗原的分子式为C27H20O,结构式如式(Ⅰ)所示:(Ⅰ);
所述苯并芘半抗原的合成路线如式(Ⅱ)所示:(Ⅱ);
制备方法包括以下步骤:
(1)取500mL三口圆底烧瓶,分别加入0.4g苯并芘、0.42g NIS、10g酸性氧化铝和30mL甲苯,室温搅拌反应48h,并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚=1:25(v/v)的薄层色谱监测上述反应直至原料消失;再将上述反应产物经过滤除去残余酸性氧化铝后合并有机相,分别用饱和亚硫酸钠溶液、饱和NaCl溶液、超纯水各萃取三次,所得有机相经无水MgSO4干燥、过滤、减压浓缩、采用二氯甲烷和石油醚的混合物重结晶提纯,得黄色粉末状固体物6‑碘苯并芘,产率为76.2%;
(2)向100mL单口烧瓶中分别加入0.27g步骤(1)中所得6‑碘苯并芘、0.01g醋酸钯和
0.02g LiCl,加入20mL DMF溶解,再依次加入70µL 4‑戊烯‑2‑醇和200µL三乙胺,在120℃下搅拌反应15h,并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚=1:2(v/v)的薄层色谱监测上述反应至反应完全;
(3)将步骤(2)中的反应产物冷却至室温,加入120mL甲苯,分别用饱和NaCl溶液和超纯水各萃取三次,所得有机相经无水MgSO4干燥、过滤、减压浓缩得粗产品,再经淋洗液为甲基叔丁醚:石油醚=1:2(v/v)的硅胶色谱柱分离净化,得到苯并芘半抗原BaP=O,产率为86.2%。
2.苯并芘半抗原在制备苯并芘人工多克隆抗体中的应用,所述苯并芘半抗原的分子式为C27H20O,结构式如式(Ⅰ)所示:(Ⅰ);
所述苯并芘半抗原的合成路线如式(Ⅱ)所示:(Ⅱ);
制备方法包括以下步骤:
(1)取500mL三口圆底烧瓶,分别加入0.4g苯并芘、0.42g NIS、10g酸性氧化铝和30mL甲苯,室温搅拌反应48h,并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚=1:25(v/v)的薄层色谱监测上述反应直至原料消失;再将上述反应产物经过滤除去残余酸性氧化铝后合并有机相,分别用饱和亚硫酸钠溶液、饱和NaCl溶液、超纯水各萃取三次,所得有机相经无水MgSO4干燥、过滤、减压浓缩、采用二氯甲烷和石油醚的混合物重结晶提纯,得黄色粉末状固体物6‑碘苯并芘,产率为76.2%;
(2)向100mL单口烧瓶中分别加入0.27g步骤(1)中所得6‑碘苯并芘、0.01g醋酸钯和
0.02g LiCl,加入20mL DMF溶解,再依次加入70µL 4‑戊烯‑2‑醇和200µL三乙胺,在120℃下搅拌反应15h,并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚=1:2(v/v)的薄层色谱监测上述反应至反应完全;
(3)将步骤(2)中的反应产物冷却至室温,加入120mL甲苯,分别用饱和NaCl溶液和超纯水各萃取三次,所得有机相经无水MgSO4干燥、过滤、减压浓缩得粗产品,再经淋洗液为甲基叔丁醚:石油醚=1:2(v/v)的硅胶色谱柱分离净化,得到苯并芘半抗原BaP=O,产率为86.2%。
说明书 :
一种苯并芘半抗原的制备方法及其用途
技术领域
背景技术
畸性和致突变性,在环境介质中广泛存在。苯并芘的毒性具有长期和隐匿特性,人体接触或
摄入BaP后能够在体内蓄积,在表现出症状前具有较长潜伏期。由于BaP来源广泛,且对人体
危害性较大,引起了国内外学者的广泛研究,目前国内外对苯并芘检测的研究多集中于大
气、水体等环境介质及粮油、肉类等食品,最常用的检测方法有气相色谱、气相色谱‑质谱、
高效液相色谱等仪器分析方法。
度IC50为24ng/mL;Pschenitza等利用固相萃取结合ELISA的方法检测食用油中的苯并芘,其
检测下限为0.63μg/mg。另外,生物素‑亲和素‑酶联免疫吸附法(BA‑ELISA)等高灵敏度的免
疫检测技术不断兴起,是一种将抗原抗体间的特异性识别免疫反应与酶的高效催化性能以
及生物素‑亲和素系统结合在一起而发展起来的非均相免疫分析技术,即将抗体或抗原生
物素化,利用固相包覆的抗原或抗体专一、特异性的识别结合,再利用链酶亲和素偶联生物
素化抗体,最后通过酶来催化小分子底物产生肉眼可辨别的颜色变化,由于固相结合的酶
量与待测物的量呈现一定的量比关系,可实现定性或定量分析。在BA‑ELISA方法中,一个亲
和素分子上的4个亚单位都能分别专一特异性的识别结合一个生物素分子,亲和常数高达
1015mol/L,提高固相载体上结合的酶数量,减少与试剂间的非特异性识别反应,提高检测
方法的灵敏度。
的活性官能基质,需要在BaP小分子上引入活性官能团,以便与载体蛋白偶联,如氨基、羧
基、羰基等。目前,针对BaP半抗原制备方法操作步骤复杂,产率一般较低,且可选择的BaP半
抗原制备方法种类较少。
发明内容
半抗原的制备方法,合成方法简单,速度快,产率高,用于制备BaP人工包被原和BaP人工多
克隆抗体,以及建立痕量BaP的免疫分析检测方法。
测上述反应至反应完全;
监测上述反应至原料消失为止;再将上述反应产物过滤除去残余酸性氧化铝后合并有机
相,分别用饱和亚硫酸钠溶液、饱和NaCl溶液、超纯水各萃取三次,所得有机相经无水MgSO4
干燥、过滤、减压浓缩,以及用二氯甲烷和石油醚重结晶提纯,得黄色粉末状固体物6‑碘苯
并芘,产率为76.2%;
胺(1.40mmo1),在120℃下搅拌反应15h,并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚=1:2(v/v)的
薄层色谱监测上述反应至反应完全;
洗液为甲基叔丁醚:石油醚=1:2(v/v)的硅胶色谱柱分离净化,即得,且产率为86.2%。
建立提供基础。
附图说明
具体实施方式
售可得。
反应;反应液分别用饱和Na2SO3溶液、饱和NaCl溶液和超纯水各萃取3次,再经过无水MgSO4
干燥及浓缩后,用石油醚和二氯甲烷重结晶纯化,得淡黄色粉末6‑碘苯并芘(455.2mg)。
(v/v)的薄层色谱显示原料点判断反应是否完全。
叔丁醚:石油醚=1:2(v/v)的硅胶色谱柱分离净化,得浅黄色粉末状产物,即为苯并芘半抗
原(201.8mg)。
成对环境中痕量BaP的检测。其中,BaP包被原OVA‑BaP的制备过程为:
待反应完全后,取540mg硼氢化钠溶于4.5mLddH2O中,加入到上述反应溶液中室温震荡反应
5h,反应液在氮吹下去除溶剂,将残渣分别用盐酸溶液(pH2.0)、蒸馏水洗涤两次,60℃烘箱
中烘干,得黄色BaP羧基衍生物(BaP‑COOH)。
50mgOVA溶于5mL0.01M、pH7.40的磷酸盐缓冲液中,将上述半抗原反应液逐滴加入到上述蛋
白质溶液中,4℃搅拌反应5h。待反应结束后,装入透析袋,用0.01M、pH7.40的磷酸盐缓冲液
透析3d,低温离心分离上清液,得BaP包被原OVA‑BaP。
苯环单取代峰,弯曲),732(C‑H,弯曲),可以看出BaP半抗原中有明显的羰基基团特征峰。
7.77(m,2H,8‑H,9‑H),7.88(dd,1H,1‑H,2‑H),7.91(d,1H,12‑H),8.00(dd,1H,1‑H),8.14
(dd,1H,3‑H),8.21(d.1H,4‑H),8.26(d,1H,5‑H),8.53‑8.55(m,1H,7‑H),8.99(d,1H,11‑
H),9.04‑9.06(m,1H,10‑H),进一步证明本发明成功制得BaP半抗原。
蛋白和偶联物之间的紫外吸收光谱存在着显著的关系和差异。另外,在偶联物的紫外吸收
光谱中不仅分别包含OVA的特征峰,还有新的吸收峰出现在373nm,可以判断半抗原与载体
蛋白成功偶联。
0.01M、pH7.40磷酸盐缓冲液),37℃温育1h。
溶液和50μL生物素化BaP抗体(bio‑pAb‑BaP)稀释液,同时设置阴性及空白对照孔,阴性孔
加入100μL阴性血清;空白孔每孔100μL0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液,37℃温育1h。
液,37℃温育1h。
mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL,利用上述建立的BA‑ELISA
方法检测BaP标准溶液。根据检测结果,以BaP标准液浓度的对数值作为横坐标,以抑制率作
为纵坐标,建立BA‑ELISA方法检测BaP的标准曲线如图4所示,抑制率的计算如公式(1)所
示,
于上海交通大学环境科学与工程学院附近(P1‑P5);农业土壤样品采自于上海奉贤区某农用
菜地(A1‑A5);沉积物样品采自于上海青草沙水库(S1‑S5),结果如表1所示,BA‑ELISA与HPLC
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方法的检测结果具有较好的相关性,如附图5所示,相关系数R =0.9896,所建立的BA‑
ELISA方法准确可靠,适用于环境样品中痕量BaP的定量检测。
围。