一种二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体

摘要

本发明涉及一种二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体，所述晶体结构式为C72H92Ca2N20O32P4·9H2O，正交晶系，P212121空间群，19号，晶胞参数为α＝β＝γ＝90°，Z＝4，晶胞体积R＝0.07，晶体真密度为1.455kg/m3，每个晶胞中有4个最小不对称单元组成，每个最小不对成单元又包含4个二丁酰环磷腺苷阴离子、两个钙离子，和9个结晶水。所述结晶粉末的堆积密度大于0.35g/mL，振实密度大于0.38g/mL，HPLC纯度大于99.2％。

权利要求

1.一种二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体，其特征在于，所述的晶体，其结构式为C72H92Ca2N20O32P4·9 H2O，正交晶系，P212121空间群，每个晶胞中有4个最小不对称单元组成，Z=4；

晶胞参数为a= 16.2439(7) Å，b=21.4366(9) Å，c= 27.7464(11) Å，α=β=γ=90°，Z=4，晶胞体积 V= 9661.7(7) Å3，晶体真密度为1.455 kg/m3。

2.一种药物组合物，它含有权利要求1所述的晶体，以及药物上可接受的赋形剂或载体。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物呈注射用冻干粉针制剂或无菌分装针制剂形式。

4.一种饲料组合物，它含有权利要求1所述的晶体，以及饲料上可接受的其他的添加剂和营养成分。

5.一种制备权利要求1所述晶体的方法，其特征在于，所述的方法包括，从含有二丁酰环磷腺苷钙的溶液中，结晶出二丁酰环磷腺苷钙盐，从所述溶液中分离出晶体，和干燥所分离的晶体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括在所述干燥期间对晶体进行机械冲压。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有二丁酰环磷腺苷钙的溶液中，溶剂包括乙醇、水、正丙醇、异丙醇中的任意一种或它们的混合溶剂。

说明书

一种二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体

技术领域

[0001] 本发明属于医药及饲料添加剂的精制领域，具体地说，涉及一种二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体结构，和一种二丁酰环磷腺苷钙盐的结晶粉末，以及其制备方法。

背景技术

[0002] 二丁酰环磷腺苷钙(Calcium Dibutyacyladenosine Cyclophosphate，DbcAMPCa)，学名N6，2′-O-Dibutyryladenosine-3′，5′-cyclic monophosphoric acid，calcium，其一价阴离子的分子结构式见附图1，是环磷腺苷(cAMP)的衍生物，因其相比环磷腺苷具有更好的细胞膜透过性，且能对抗体内磷酸二酶的水解，故其作用时间和速度均比cAMP持久和迅速，因次在治疗心脏病、免疫性疾病等方面具有显著的作用效果(CN101172112A)。

[0003] 目前的制备方法，基本上都是以cAMP为原料，经过化学方法在其分子中加入两个丁酞基制备而成。已报道的实现过程大致可以分为以下两类：(1)cAMP与三乙胺在非质子溶剂(常用如吡啶)作用下成cAMP-乙胺盐，而后加入正丁酐进行酰化呈浆状，最后加入氯化钙成钙盐。典型的工艺如专利CN103242403A、专利CN104262436A、专利CN105566424A、WO2007/143897A1所报道；(2)cAMP先与氢氧化钙反应生成cAMP-Ca盐，而后与丁酸酐发生反应制得二丁酰环磷腺苷钙盐，然后再分离冻干或干燥制得产品。但无论哪种方法所制得产品，其产品的质量，尤其体现在产品的纯度和颗粒性方面均存在问题，导致产品不稳定，容易吸潮，尤其明显的是存在刺鼻性的气味。这是由于制备过程中所引入的丁酐，水解之后变成丁酸，而缺乏有效的精制手段从而引起丁酸的残留而产生的，单纯通过冻干或直接喷干的方法很难去除。另一方面，在二丁酰环磷腺苷的合成的过程，不可避免的会产生单丁酰或三丁酰环磷腺苷，由于分子结构的相似性，若没有有效的分离纯化方法，则难以去除。

[0004] 关于产品的纯化，根据现有的报道，大致有两种方法，一是通过层析分离(如专利CN103242403A)；二是通过制备色谱分离(如专利CN104262436A)；三是通过甲醇丙酮等有机溶剂直接萃取、转化、洗涤(如专利CN101020707A)。这几种方法虽然可以将HPLC纯度提高至90％以上，但是存在几个问题，要么成本高，不适合规模化生产；要么对单丁酰环磷腺苷或丁酸的去除效果较差；要么产品的颗粒度太差，堆密度小，且稳定性差；多数情况下，以上三个问题同时存在。

[0005] 由于技术所限，国内目前关于二丁酰环磷腺苷钙盐的标准还是《化学药品地标升国标第九册》，版本较老，关于产品规格的标准比较低——“按干燥品计算，含C18H23N5O8P·1/2Ca不得少于80.0％，淡黄色粉末，有特臭，有引湿性”，但是对于医药而言，杂质和颗粒性问题是阻碍高端化发展的瓶颈。

[0006] 另一方面，关于二丁酰环磷腺苷钙结构的报道虽然专利PCT/CN2007/001640中提出说可以含有0～2.5个结晶水，专利CN104478979A给出无结晶水晶型的粉末X-ray衍射图，但是均未能从分子层面给出其彻底的三维结构信息，且无定型产品和无结晶水产品相对于含有结晶水的二丁酰环磷腺苷钙盐晶体产品而言，容易吸潮，具有不稳定性。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种二丁酰环磷腺苷钙的新的晶型及晶体学数据，同时，提供一种纯度高，杂质少，产品颗粒性好的二丁酰环磷腺苷结晶粉末，及其制备方法，消除了产品的气味，提高了产品的品质。

[0008] 本发明意在给出一种二丁酰环磷腺苷钙的单晶结构，并提供一种二丁酰环磷腺苷钙的结晶粉末，和其制备方法。所述方法所制得的产品，在结构上具有稳定性，在纯度和颗粒性能上都有很好的改善。

[0009] 具体地，这种单晶结构的结构式为C72H92Ca2N20O32P4·9H2O，正交晶系，P212121空间群，每个晶胞中有4个最小不对称单元组成，Z＝4，晶胞参数为α＝β＝γ＝90°，Z＝4，晶胞体积 晶体真
密度为1.455kg/m3。详细的晶体学数据见表1和表2。

[0010] 表1二丁酰环磷酸腺苷钙C72H92Ca2N20O32P4·9H2O的晶胞参数

[0011]

[0012]

[0013] 表2二丁酰环磷酸腺苷钙C72H92Ca2N20O32P4·9H2O晶体中非氢原子的位置及各项异性参数(Angstrom)

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[0021]

[0022] 具体地，这种单晶结构每个晶胞中有4个最小不对称单元组成，每个最小不对称单元又包含4个二丁酰环磷腺苷阴离子、两个钙离子，和9个结晶水，最小不对称单元呈现出四聚体结构，具体情况见附图3，晶胞结构图见附图2，最小不对称单元中二丁酰环磷腺苷的三维结构见图4。

[0023] 所述这种二丁酰环磷腺苷钙的结构特征在于，具有如附图5所示的用CuKα射线作为特征X射线进行衍射分析的衍射图谱，以衍射角2θ±0.2表示为：5.20，6.36，7.58，9.34，10.40，14.48，17.72，22.50，23.54等，具体衍射峰的数据见表3。

[0024] 表3二丁酰环磷腺苷钙C72H92Ca2N20O32P4·9H2O的X-ray粉末衍射的特征谱线[0025]

[0026] 一种二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体粉末，具有大于0.35g/mL的堆积密度，优选大于0.40g/mL，更优选大于0.45g/mL；或具有大于0.38g/mL振实密度，优选大于0.43g/mL，更优选大于0.48g/mL，具有良好的颗粒性和流动性。

[0027] 本发明所述的二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体，具体地，其另一个特征在于，二丁酰环磷腺苷钙盐的化学纯度，HPLC纯度大于99.2％，单丁酰环磷腺苷与三丁酰环磷腺苷的残留量小于0.5wt％，优选小于0.3wt％，更优选小于0.1wt％；其丁酸、丁酐、吡啶、三乙胺杂质残留总量之和小于0.1wt％，优选小于0.05wt％。其另一个特征在于，消除原料中长期以来存在的臭味(由于溶剂残留所致)，本发明所得的产品没有异味。

[0028] 本发明所述的二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体，需要指出的是，该晶体粉末会因为干燥方式的不同，或储存环境湿度的不同而可能呈现出不同的表观水含量(包含自由水和结合水)，因此其水含量可以为在0.5wt％～9.97wt％，优选5.5wt％～8.5wt％。

[0029] 本发明所述的二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体，具体地，具有大于10μm，优选大于20μm，更优选大于30μm，更优选大于50μm的d50。

[0030] 本发明所述的二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体，具体地，具有大于3μm，优选大于6μm，更优选大于10μm的d10。

[0031] 一种药物组合物，它含有本发明所述的具有独特性质的二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体，以及药物上可接受的赋形剂或载体。这种赋性剂可以是甘露醇、葡萄糖、山梨醇、乳糖、海藻糖、木糖、氨基酸、无机盐、可溶性淀粉、糊精、可溶性纤维素类物质等。

[0032] 一种饲料组合物，它含有本发明所述的具有独特性质的二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体，以及饲料上可接受的其他的添加剂和营养成分。

[0033] 本发明所述的二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体的制备方法，包括，将二丁酰环磷腺苷钙的粗品溶解于溶液之中，从含有二丁酰环磷腺苷钙的溶液中，结晶出二丁酰环磷腺苷钙盐，从所述溶液中分离出晶体，和干燥所分离的晶体。

[0034] 具体地，其中该方法包括在所述干燥期间对晶体进行机械冲压。

[0035] 具体地，在所述制备方法中，所述溶液中的溶剂包括乙醇、水、正丙醇、异丙醇中的一种或它们的混合溶剂。其中，二丁酰环磷腺苷钙盐粗品与溶剂的质量比为(0.7～3∶10)，结晶过程中温度范围可以是10～60℃。

[0036] 在所述制备方法中，具体地，比如将二丁酰环磷腺苷钙盐粗品加入到溶剂中，在10～60℃下充分搅拌混匀，而后通过降温或升温，在搅拌状态下，使其产生过饱和度，而后缓慢结晶出二丁酰环磷腺苷钙固体，晶桨经过抽滤或离心进行固液分离，所得固体在30～70℃下真空干燥，即得二丁酰环磷腺苷钙固体结晶粉末。

[0037] 需要指出的是，在所述制备方法中，所述的二丁酰环磷腺苷粗品可以是在本发明背景技术中所提到的当前常见制备方法中所制备出的产品，其HPLC纯度在60％以上的，优选在70％以上的，更优选在80％以上的，更优选在85％以上的；可以含有部分单丁酰环磷酸腺苷及其钙盐，三丁酰环磷酸腺苷及其钙盐，丁酸，丁酐，三乙胺，色素等常见杂质；也可以是结晶度很差甚至是无定形呈现的粗品。

[0038] 需要指出的是，在所述制备方法中，在有机溶剂存在条件下的结晶过程，为了减少有机溶剂挥发，可以考虑在结晶器上安装冷凝回流装置，冷凝温度依据冷媒的不同可以设定不同温度，比如-10～20℃。所述的冷媒可以使用乙醇，乙二醇，水。

[0039] 需要指出的是，在所述制备方法中，在固液分离后，根据情况，可以选择使用洗涤剂对固液分离后的固体进行洗涤，以除去固体表面携带的结晶母液中的杂质，洗涤剂可以为乙醇、水、正丙醇、异丙醇、甲醇、丙酮中的一种或它们之间的混合。

[0040] 需要指出的是，在所述制备方法中，干燥的过程对二丁酰环磷腺苷钙盐稳定性和水含量有一定影响，较低的干燥温度容易降低干燥效率，可能引起干燥不充分导致溶剂残留超标或者结块的现象；过高的干燥温度容易使得产品失去结晶水，而失去结晶水的晶体粉末，放置在室内环境下可能会发生吸潮。在本制备方法下，干燥方式优选鼓风干燥，干燥温度可以从30～70℃，优选35～45℃，干燥气流的湿度优选30％～65％，过低湿度的气流容易带来结晶水的损失，过高湿度的气流容易使产品吸收较多自由水。

[0041] 需要指出的是，结晶过程可以间歇或者连续地进行。当该工艺过程间歇进行时，优选向结晶体系中添加晶种。优选地，结晶连续地进行。

[0042] 另外，本发明所涉及的二丁酰环磷腺苷钙盐晶体结构的更加详细的信息，在说明书附图中给出。

[0043] 本发明涉及的二丁酰环磷腺苷钙盐晶体及所述的制备方法，通过下面非限制性的实施例将进一步阐明，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能以限定本发明的保护范围。

[0044] 所述的二丁酰环磷腺苷钙盐的晶体结构，具体地，检测这种晶体结构的方法及仪器陈述如下：

[0045] 单晶X-ray衍射测定晶体结构与解析方法：取培养出的质量较好的二丁酰环磷腺苷钙盐单晶，切割成约0.22×0.24×0.26mm3大小的块状，经布鲁克APEX-II CCD衍射仪Mo Kα放射源(石墨单色器， )对样品进行照射，并收集衍射数据，衍射数据经SAINT进行还原后用SHELXTL软件直接法进行结构解析，并基于F2的全矩阵最小二乘法精修，所有的非氢原子通过各向异性精修。最终数据通过Mercury或Materials Studio 6.0软件作图。

[0046] 粉末X-ray衍射(PXRD)：研磨后的样品，取约0.1g，通过粉末X射线衍射仪(日本理学Smartlab或Bruker D8 Advance)在室温下进行衍射数据收集，光源为Cu Kα射线扫描步长为0.02°，设定扫描电压40kV，电流40mA，扫描速率0.2s/0.02°，扫描范围2θ为2～40°，数据通过JADE 6.0软件处理作图。

[0047] d50和d10是用于表明粒度分布的通常的量。该d50是用于粒度的值，使得50vol.％的晶体具有小于这个值得尺寸。该d10是用于粒度的值，使得10vol.％的晶体具有低于这个值的尺寸。

[0048] 堆密度和“拍实密度”是尤其与粉末的流动特性相关的量。总体上，希望高的堆密度和“拍实密度”值。简而言之，堆密度指出在预定条件下每体积单位粉末的重量。换言之，在预定条件下多少克粉末可以供给到具有特定容积的样品保持器中。堆密度表示为通常以g/mL计的每体积单位的重量。“拍实密度”也表明了每体积单位粉末的重量，在这种情况下，在该粉末的保持器经受在预定条件下的拍打或振动的情况下。“拍实密度”表示为通常以g/mL计的每体积单位的重量。通过拍打或振动，更多的粉末可以供给到该保持器中。因此，对于同一粉末，其“拍实密度”高于堆密度。

[0049] 堆积密度与振实密度大的粉末，其比重往往较大，可以反映出晶体产品比较厚实，有质感，其稳定性也会相对较好；从另一个角度讲，堆积密度大的产品，颗粒的流动性一般较好，也便于储存和运输，更便于与其他组分高效混合。

[0050] 那么具体地，所述颗粒尺寸分布、堆积密度、拍实密度的测量方法如下：使用Microtrac S3500颗粒粒度分析仪确定来自混合器的样品的颗粒尺寸分布(包括d10和d50)，干法测定；

[0051] 颗粒的堆积密度按USP方法II(第1914页)来测定；

[0052] 颗粒的拍实密度通过，依据GB/T 5162-2006，通过FZS4-4经济型振实密度测定仪进行测定。具体地，测定条件为：拍实装置的振动冲程为3±0.1MM，振动频率为每分钟250±15次。

[0053] 具体地，所述结晶粉末水含量的测定方法为卡尔费休法，可以通过瑞士万通的870 Titrino plus实用型容量法卡尔费休水分测定仪进行测定。

[0054] 所述结晶粉末的纯度通过高效液相色谱法进行测定。具体地，流动相为75∶25的0.05mol/l的磷酸二氢钾缓冲液与乙腈，紫外检测器，测试波长273nm，流速1.0ml/min，C18反相色谱柱，进样量5微升。

[0055] 有益效果：本发明提供了一种二丁酰环磷腺苷钙的新的晶型，并给出了其详细的单晶结构信息。本发明所给出的结晶粉末，具有纯度高，HPLC纯度大于99.2％，颗粒性好，流动性好，稳定性好的特点，且有效的去除了刺鼻的臭味(由丁酸的残留所引起)，可用于医药、饲料等领域，适合工业化开发。

附图说明

[0056] 图1二丁酰环磷腺苷一价阴离子的分子结构式；

[0057] 图2二丁酰环磷酸腺苷钙C72H92Ca2N20O32P4·9H2O的晶胞堆积图；

[0058] 图3最小不对称单元的四聚体结构；

[0059] 图4最小不对称单元中二丁酰环磷腺苷的三维结构；

[0060] 图5二丁酰环磷腺苷钙C72H92Ca2N20O32P4·9H2O的粉末X-ray衍射图。

具体实施方式

[0061] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0062] 实施例1：

[0063] 取150g二丁酰环磷腺苷钙盐粗品，加入1000mL无水乙醇之中，在50℃下充分溶解，过程在带有夹套的1.5L的结晶器中进行，搅拌速度控制设定200r/min，使用三弯叶推进式搅拌桨，桨叶直径为80mm，结晶器顶部带有冷凝回流装置，结晶体系夹套采用冷却循环水控温。溶解10min后，以2℃/h的速率，缓慢降温，同时以2.0mL/min的流速泵入异丙醇，加入异丙醇的体积为800～1200mL，当温度降温至10℃，维持2h，而后下罐，抽滤方式进行固液分离，使用400mL无水丙酮对滤饼进行洗涤，而后置于35℃鼓风干燥箱中，以相对平衡湿度RH为65％的气流进行干燥4h，而后获得二丁酰环磷腺苷钙盐纯品，卡尔费休法测定水分含量为(7.5±0.5)％，其质量指标见表4。

[0064] 实施例2：

[0065] 取300g二丁酰环磷腺苷钙盐粗品，加入1000mL水中，在10℃下充分溶解，过程在带有夹套的2L的结晶器中进行，搅拌速度控制设定200r/min，使用二叶锚式搅拌桨，桨叶直径为90mm，结晶体系夹套采用冷却循环水控温。充分溶解30min后，以2℃/h的速率，缓慢升温，直至升温至60℃，维持2h，而后下罐，用抽滤的方式进行固液分离，使用300mL甲醇体积分数为95％的甲醇水溶液对滤饼进行洗涤，而后置于40℃鼓风干燥箱中，以相对平衡湿度RH为45％的气流进行干燥4h，而后获得二丁酰环磷腺苷钙盐纯品，卡尔费休法测定水分含量为
7.65％，其粉末X射线衍射图谱如附图2所示，其他质量指标见表4。

[0066] 实施例3：

[0067] 取100g二丁酰环磷腺苷钙盐粗品，加入1000mL正丙醇乙醇溶液之中(正丙醇与乙醇的质量比为1∶1)，在50℃下充分溶解，过程在带有夹套的1.5L的结晶器中进行，搅拌速度控制设定250r/min，结晶体系夹套采用冷却循环水控温。充分溶解15min后，先以2℃/h的速率降温至35℃，而后以1℃/h的降温速率降温至10℃，维持2h，而后下罐，用抽滤的方式进行固液分离，使用250mL的无水乙醇对滤饼进行洗涤，而后置于50℃鼓风干燥箱中，以相对平衡湿度RH为55％的气流进行干燥4h，而后获得二丁酰环磷腺苷钙盐纯品，卡尔费休法测定水分含量为(7.5±0.5)％，其质量指标见表4。

[0068] 实施例4：

[0069] 取21kg二丁酰环磷腺苷钙盐粗品，加入300L水溶液之中，在20℃下充分溶解，而后以连续进料的方式，通过强制循环搅拌型结晶器(DTB)进行结晶，结晶室内操作温度控制在60℃，系统真空度控制在200mbar之下，搅拌转速控制在100r/min，料液经过不断蒸发浓缩而达到过饱和度，而后在结晶室内进行成核并生长，循环这个过程，直至工作室体积低于结晶罐工作要求的最低限度。晶桨通过离心机进行固液分离，滤液通过90％的乙醇水溶液进行洗涤，而后置于70℃鼓风干燥箱中，以相对平衡湿度RH为30％的气流进行干燥10h，而后获得二丁酰环磷腺苷钙盐纯品，卡尔费休法测定水分含量为(4.0±0.6)％，其质量指标见表4。

[0070] 对比例1：

[0071] 根据专利CN101020707A公开的二丁酰环磷腺苷钙的精制方法，采用甲醇和丙酮混合溶剂对二丁酰环磷腺苷钙的粗品进行精制，测试指标如表1(对比试验1)。另外，采用PCT/CN2007/001640所给出方法进行实验获得二丁酰环磷腺苷钙的测试结果如表4(对比试验2)。

[0072] 表4本发明所得产品与现有产品的对照结果

[0073]

[0074] 对比例2：

[0075] 考察二丁酰环磷腺苷钙三种不同形态(无定型、无结晶水、含有结晶水)的产品对环境湿度的敏感性。无定型产品依据CN 104262436 A所述方法制得，无结晶水产品参照CN104478979A所述方法制备，含有结晶水的产品参考本发明所给出的实施例1方法制备。将三种粉末分别放入25℃、相对湿度RH为36％、60％、80％、90％的湿度环境中，24h后用分析天平称重，观察实验前后样品的重量变化。得实验数据如表5所示。

[0076] 表5二丁酰环磷腺苷钙盐三种形态的固体粉末在不同湿度环境中的重量变化情况[0077] RH 36％ RH 60％ RH 80％ RH 90％无定型 101.5±0.5％ 108.1±0.6％ 107.7±0.8％ 115.4±2.1％
无结晶水 102.5±0.5％ 105.1±0.8％ 106.7±1.0％ 107.8±0.6％
含有结晶水的产品 100.0±0.3％ 100.0±0.2％ 100.2±0.3％ 100.5+0.5％

[0078] 由表5可以看出，无定型产品和无结晶水产品在RH 36％的湿度环境中就出现了吸潮，并随着环境中相对湿度的增加，其吸潮程度也逐步增加的现象；而本发明所制得的含有结晶水的二丁酰环磷腺苷钙盐产品在RH 36％～RH 90％的湿度氛围中，均呈现出良好的稳定性。