一种脑黑质基因敲除快速建立帕金森病动物模型的方法

摘要

本发明提供了一种脑黑质基因敲除快速建立帕金森病动物模型的方法。本发明公开了一种可高效特异敲除PINK1基因的sgRNA；还提供了通过靶向敲除动物中脑黑质的PINK1基因建立帕金森疾病动物模型的方法，具体通过将sgRNA和CRISPR核酸酶注射至动物大脑黒质部位，对PINK1基因造成目标片段缺失；3～4周后可出现明显帕金森疾病典型运动障碍症状，无药物治疗下运动障碍不可恢复。所述方法直接造成黑质部位神经元死亡，无副作用，成模率逾90％，表型稳定，适用性和重复性好，为帕金森病药物筛选、干细胞治疗、基因缺陷修复治疗及PINK1基因缺失的致病机理研究等提供重要模型，具有巨大的经济价值和临床前研究意义。

权利要求

1.一组特异靶向PINK1基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA包括：PINK1 exon2sgRNA:

5’-GGCTGGAGGAGTATCTGATAGGG-3’；

和PINK1 exon4sgRNA:

5’-CCGGGTTCTCCGCGCTTTCACC-3’。

2.含有权利要求1所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA核苷酸序列的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述的表达载体为CRISPR/Cas9系统质粒载体。

4.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为通过如下方法得到的表达载体：将px552病毒表达载体中的hSyn序列改造为CMV启动子序列，并将GFP序列替换为RFP序列得到的表达载体。

5.权利要求1所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或权利要求2～4任一项所述的重组表达载体在帕金森疾病动物模型构建中的应用。

6.一种帕金森疾病动物模型的建立方法，其特征在于：通过运用权利要求1所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或权利要求2～4任一项所述的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌靶向敲除动物中脑黑质中的PINK1基因实现。

7.根据权利要求6所述的帕金森疾病动物模型的建立方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或权利要求2～4任一项所述的重组表达载体和CRISPR核酸酶或其重组表达载体进行病毒包装；

(2)将所述的病毒包装后的sgRNA或重组表达载体和CRISPR核酸或其重组表达载体注射至受试动物大脑黒质部位，通过靶向性核酸内切酶对PINK1基因造成目标片段的缺失；3～4周后可出现明显帕金森疾病典型运动障碍症状，无药物治疗下运动障碍不可恢复。

8.根据权利要求7所述的帕金森疾病动物模型的建立方法，其特征在于：步骤(1)中所述的sgRNA或含有所述sgRNA的重组表达载体和CRISPR核酸酶或其重组表达载体按摩尔比1:(1～5)进行配比；

步骤(1)同时使用权利要求1所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或权利要求2～4任一项所述的重组表达载体；

PINK1 exon2sgRNA与PINK1 exon4sgRNA按摩尔比1:1进行配比；

所述的动物为非人灵长类动物。

9.根据权利要求7所述的帕金森疾病动物模型的建立方法，其特征在于：步骤(1)中所述的CRISPR核酸酶为Cas9；

步骤(1)所述的CRISPR核酸酶表达载体为载有CRISPR核酸酶的AAV病毒载体；

步骤(2)中所述的注射为立体定位注射；

所述的动物为猕猴、食蟹猴。

10.根据权利要求7所述的帕金森疾病动物模型的建立方法，其特征在于，所述的CRISPR核酸酶表达载体为通过如下步骤得到的表达载体：通过酶切位点Xba1和AgeI删除px551质粒的Mecp2启动子序列，并连接携带有Xba1和AgeI两酶切序列的CMV启动子序列，构建得到所述的表达载体。

说明书

一种脑黑质基因敲除快速建立帕金森病动物模型的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种脑黑质基因敲除快速建立帕金森病动物模型的方法。

背景技术

[0002] 帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)作为仅次于老年痴呆(AD)的第二大神经退行性疾病，在中国65岁以上人群中的发病率高达1～2％(Pringsheim et al.,2014；Koprich et al.2017)。帕金森病的临床症状表现为运动障碍，静止性震颤，肌肉僵直等。该病的病理改变主要是由于中脑黑质中的多巴胺能神经细胞发生变性坏死及伴有胞质内包涵体——路易小体(Lewy body)的出现(Dawson et al.,2010)。由于大量多巴胺神经元死亡，病人脑中的多巴胺严重减少而导致帕金森病的运动障碍发生。随着人类老龄化增加，帕金森疾病患者也逐渐增多，这对患者本人、家庭和整个社会均造成巨大的负担。目前对于帕金森病没有方法可以延缓或逆转病理进程，其主要原因之一是缺乏合适的动物模型可用于医药开发。为解决这一问题，合格的PD动物模型尤为重要。

[0003] 帕金森疾病的动物模型建立目前主要包括神经毒素模型和遗传基因模型。神经毒素模型常用的有四种：6-羟多巴胺(6-OHDA)模型，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6－四氢吡啶(MPTP)模型，百草枯模型及鱼藤酮模型。其中MPTP诱导的PD模型因建模快而在医学研究中的应用非常广泛，但药物诱导损伤模型的缺点是毒性较大，并不能真正模拟病人的遗传学突变及缓慢发病的进程(Potashkin JA et al,2010)。而遗传基因模型有针对功能获得型突变的转基因动物模型和针对功能缺失型突变的基因敲除模型，这类方法建立的模型基于在猴胚胎时期进行基因修饰(Yang et al.,2015)。虽然此法能够模拟病人的基因突变但受困于技术瓶颈，利用胚胎或干细胞构建相关基因修饰的灵长类动物模型非常困难，且在时间上较为漫长，将耗费巨大人力、物力和财力，不利于大规模的药物筛选。

[0004] 近年来发展的基因编辑新技术CRISPR/Cas9在定向对基因进行精确修饰上展现出了巨大的潜力，已被广泛用于不同种属进行基因组改造和基因修饰。CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA介导Cas9蛋白对基因进行编辑和修饰的新技术。目前，RNA介导的Cas9系统能够成功介导细菌、植物细胞、斑马鱼胚胎、小鼠、人源细胞、非人灵长类动物食蟹猴胚胎、甚至人类废弃胚胎等的基因组编辑(Cho et al.,2013；Cong et al.,2013；Jinek et al.,2013；Mali et al.,2013；Niu et al.,2014；Shan et al.,2013；Chen et al.,2015)。且该技术还可通过基因敲入成功纠正疾病动物的缺陷基因(Schwank et al.,
2013；Wu et al.,2013)或者改组为病毒载体建立癌症动物模型(Platt et al.,2014)等。
该技术使用方便、简单且打靶效率较高，还可在目的基因的多个位点设计多种gRNA以完全敲除目的基因。

[0005] PINK1基因突变可因基因功能缺失而导致早发型帕金森疾病。然而，目前报导的所有敲除PINK1基因后的啮齿类动物模型动物都不能有效地模拟帕金森疾病的病理和行为特性。例如，PINK1基因敲除小鼠并不会出现临床PD病人的典型病理特性——中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡和显著的运作障碍(Kitada et al.,2009)。因此，采用敲除PINK1基因的策略是否能成功制备PD动物模型存在众多不确定因素和不可预见性，而不同种属动物之间的巨大差异进一步加大了研究难度。同时，目前也未见相关通过敲除该基因而成功获得PD大动物模型的报道，因此，对于其中的技术瓶颈与技术困难，有待研究攻破；如何构建与人类更为相似的PD模型也成为PD疾病研究的重要课题。

发明内容

[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种特异靶向PINK1基因的sgRNA，所述的sgRNA可通过CRISPR-Cas9系统造成PINK1基因的DNA大片段缺失，高效实现对PINK1基因的特异性敲除。

[0007] 本发明的另一目的在于提供载有所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

[0008] 本发明的又一目的在于提供一种帕金森疾病动物模型的建立方法，是基于在帕金森病的易损脑区(中脑黑质)中直接靶向敲除PINK1基因建立的。

[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0010] 一组特异靶向PINK1基因的sgRNA，所述的sgRNA选自下列中的至少一种：

[0011] (1)PINK1 exon2 sgRNA:5’-GGCTGGAGGAGTATCTGATAGGG-3’(SEQ ID NO.2)，位于PINK1基因的2号外显子；

[0012] (2)PINK1 exon4 sgRNA:5’-CCGGGTTCTCCGCGCTTTCACC-3’(SEQ ID NO.3)，位于PINK1基因的4号外显子。

[0013] 同时利用所述的两条sgRNA序列，可特异性靶向PINKI基因并高效实现该基因的大片段敲除。

[0014] 含有所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA核苷酸序列的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。

[0015] 所述的表达载体优选为来自于多次筛选确定的CRISPR/Cas9系统质粒载体；进而优选为能有效转染神经细胞的腺相关病毒(AAV)载体。

[0016] 所述的腺相关病毒(AAV)载体优选为通过如下方法得到的表达载体：将px552病毒表达载体中的hSyn序列改造为CMV启动子序列，并将GFP序列替换为RFP序列，从而更好地在脑部的神经细胞及其它细胞中表达RFP并高效敲除PINK1基因。具体操作步骤优选为：通过ApaI和BamHI酶切位点将原px552病毒表达载体中的hSyn序列改造为CMV启动子序列，并通过BamHI和EcoRI酶切位点将GFP序列替换为RFP序列。

[0017] 所述的px552病毒表达载体购自Addgene。

[0018] 所述的细胞优选为非人灵长类动物大脑的细胞。

[0019] 所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或重组表达载体在帕金森疾病动物模型构建中的应用。

[0020] 一种帕金森疾病动物模型的建立方法，通过靶向敲除动物中脑黑质中的PINK1基因实现。

[0021] 所述的动物优选为非人灵长类动物；更优选为猕猴、食蟹猴。

[0022] 具体包括如下步骤：

[0023] (1)将所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或含有所述sgRNA的重组表达载体和CRISPR核酸酶或其重组表达载体进行病毒包装；

[0024] (2)将所述的病毒包装后的sgRNA或其重组表达载体和CRISPR核酸酶或其重组表达载体注射至受试动物大脑黒质部位，通过靶向性核酸内切酶对PINK1基因造成目标片段的缺失；3～4周后可出现明显帕金森疾病典型运动障碍症状，无药物治疗下运动障碍不可恢复。

[0025] 该方法可高效实现在中脑黑质中直接靶向敲除PINK1基因。

[0026] 步骤(1)中所述的sgRNA或含有所述sgRNA的重组表达载体和CRISPR核酸酶或其重组表达载体优选按摩尔比1:(1～5)进行配比。

[0027] 步骤(1)优选同时使用所述的两种特异靶向PINK1基因的sgRNA或含有所述sgRNA的重组表达载体；PINK1 exon2 sgRNA与PINK1 exon4 sgRNA优选按摩尔比1:1进行配比。

[0028] 步骤(1)中所述的CRISPR核酸酶优选为Cas9。

[0029] 步骤(1)所述的CRISPR核酸酶重组表达载体优选为载有CRISPR核酸酶的AAV病毒载体；更优选为通过如下步骤得到的AAV病毒载体：

[0030] 通过酶切位点Xba1和AgeI删除px551质粒的Mecp2启动子序列，并连接携带有Xba1和AgeI两酶切序列的CMV启动子序列，构建得到所述的AAV病毒载体，从而可以在大脑中各个细胞表达SpCas9。

[0031] 所述的px551质粒购自Addgene。

[0032] 步骤(2)中所述的注射优选为立体定位注射。

[0033] 发明人基于CRISPR/Cas9技术建立了PINK1基因敲除的猕猴模型，发现PINK1基因缺失可引发猕猴早期大脑神经元细胞死亡，提示PINK1在灵长类大脑功能中具有重要作用。发明人采用立体定位注射方法将携带有PINK1基因打靶位点的CRISPR/Cas9病毒载体注射入各年龄段受试猴的大脑黑质部位。注射3～4周后，受试猴均出现类似于帕金森疾病病人的运动障碍症状，后续病理学检测发现被注射区域附近神经元发生明显退变及死亡。发明人所建立的这种帕金森疾病模型方法简单快速高效，且从基因水平上对内源性的PINK1基因进行遗传学修饰，更能模拟病人的突变形式，可大规模用于帕金森病人药物的筛选。

[0034] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0035] 1.本发明提供了一种sgRNA，可通过CRISPR-Cas9系统造成PINK1基因的DNA大片段缺失，高效实现对PINK1基因的特异性敲除。

[0036] 2.本发明公开了一种快速建立帕金森疾病动物模型的方法，特别是非人灵长类动物，即特异性敲除非人灵长类动物(如猴)大脑黑质部位内源性的PINK1基因，并优选了两种高效敲除PINK1基因的打靶序列。与传统建立帕金森模型的方法相比，本发明方法具有如下显著的优点：(1)快速：注射3～4周后，受试动物开始出现类似于帕金森病人的运动障碍及伴随的脑部黑质区域神经元死亡，该模型比小动物更能模拟PD病人的病理变化与运动障碍等重要表型；(2)高效：直接对帕金森疾病的重要发病脑区黑质部位进行内源性PINK1基因敲除，造成黑质部位神经元死亡，无副作用，造模使用动物11头，成功10头，成模率在90％以上；(3)表型稳定，该方法建立的动物模型表型稳定，无明显浮动；(4)该模型的病理机制与PD病人相同，因PNIK1基因突变造成的功能丧失而导致帕金森病，而目前携带PNIK1突变的啮齿类动物不能模拟多巴胺神经元的死亡的病理学特征和帕金森病行为学表征。药物诱导的帕金森病猴模型是靠药物毒性造成多巴胺神经元的死亡，进而影响多样性运动功能，药物毒性造成的急性病理变化与帕金森病人的渐进性病理发展尤其是因内源性基因突变而造成的病理变化有很大区別，且造模效率低、模型稳定性差(Potashkin et al,2010)。而本发明的方法可让动物适当地模拟帕金森病病人的基因突变而致病，并且表型稳定，更适合于药物开发和病理机制研究。(5)适用性及重复性好，本发明的帕金森病模型构建方法可适用于不同年龄阶段的受试动物，适用性显著优于现有技术；同时，在不同年龄的受试动物上均能实现本发明的目的和预期效果，重复性好。

[0037] 3.本发明公开的帕金森病模型基于使用与人类更为接近的非人灵长类动物。与传统所述的小动物模型相比，更能模拟人类家族性遗传帕金森病特征。发明人在前期研究工作中，发现PINK1基因在不同动物种属中的表达具有明显差异性，表现为在灵长类动物大脑中表达丰富，而在小鼠及实验猪大脑中表达明显少于灵长类动物。并且大量研究发现特异性全身敲除PINK1基因并未造成小鼠中脑黑质内多巴胺神经元死亡这一典型的帕金森病人的病理特征(Dawson et al.,2010)。因此，在非人灵长类动物(猴子)中特异性敲除PINK1基因能更好地模拟病人的症状。

[0038] 4.本发明公开的该模型建立方法基于同时双位点对大动物PINK1基因进行敲除，双位点打靶能够造成PINK1基因的DNA大片段缺失，更能高效消除PINK1基因的表达，从而达到PINK1基因缺失后造成大脑黑质部位神经元死亡的显著效果。

[0039] 本发明所提供的特异性敲除猴大脑中PINK1基因快速建立帕金森病模型的方法，能够为帕金森病药物筛选，干细胞治疗，基因缺陷修复治疗及PINK1基因缺失的致病机理研究等提供重要模型，具有巨大的经济价值和临床前研究意义。

[0040] 5.本发明的方法可靶向修饰病灶起始区，对其他区域无影响。而现有技术中转基因动物模型往往造成全身性的基因表达改变，这种改变与临床病理不同，可能会影响动物模型的适用性。

附图说明

[0041] 图1是改造后的AAV-Cas9及AAV-sgRNA载体(即AAV-U6sgRNA-CMV-RFP载体)示意图。

[0042] 图2是猴PINK1基因打靶位点第二外显子和第四外显子的示意图。

[0043] 图3是本发明针对猴PINK1基因第二外显子设计打靶位点的示意图，分别为PINK1 exon2-T1,T2,T3。

[0044] 图4是本发明针对猴PINK1基因第四外显子设计打靶位点的示意图，分别为PINK1 exon4-T1,T2,T3。

[0045] 图5是在猴胚胎水平上验证所设计的打靶位点的打靶效率的代表性DNA凝胶电泳结果图。

[0046] 图6是本发明对猴PINK1基因双位点打靶造成的PINK1基因大片段缺失及其它突变类型的示意图。

[0047] 图7是T7E1酶切法检测结果分析图。

[0048] 图8是全基因组分析脱靶效应结果分析图。

[0049] 图9是猴脑定位注射AAV载体的操作示意图。

[0050] 图10是猴大脑立体定位注射AAV载体后RFP抗体的免疫组化染色结果照片图。

[0051] 图11是脑立体定位注射AAV载体61天后猴大脑黑质免疫组化染色结果照片图。

[0052] 图12是为左侧黑质注射对照AAV载体与右侧黑质注射AAV载体敲除PINK1后神经元数目的统计结果分析图(n＝11只猴，***<0.001)。

[0053] 图13是猴脑立体定位注射AAV载体2个月后的猴大脑MRI图。

[0054] 图14是猴脑立体定位注射AAV载体3周后受试动物出现运动障碍症状的照片图。

[0055] 图15是定量分析注射前与注射后左右两侧肢体动作移动准确性频率的统计分析图(***p<0.001)。

[0056] 图16是脑立体定位注射AAV载体后的不同时间段动物运动障碍症状情况分析结果图，其中，BI为注射前；PI为注射后；DT为药物治疗。

[0057] 图17是对出现运动障碍症状的受试猴经过药物治疗前后的两侧肢体动作移动准确性频率结果分析图。

具体实施方式

[0058] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0059] 实施例1表达载体的改造

[0060] 改造表达目的质粒的病毒载体如图1，具体构建流程方法如下(相关具体操作可通过本领域常规技术手段实现)：

[0061] 1.用pAAV-pMecp2-SpCas9-spA(购自Addgene，px551，plasmid#60957)骨架质粒上的Xba1和AgeI两酶切位点将Mecp2启动子序列删除，连接携带有Xba1和AgeI两酶切序列的CMV启动子序列，从而实现其在大脑中各个细胞表达SpCas9，得到AAV-Cas9。

[0062] 2.对于AAV-U6sgRNA-hSyn-GFP(Addgene，px552，plasmid#60958)质粒的改造是通过ApaI和BamHI将原载体中的hSyn序列改造为CMV启动子序列，并通过BamHI和EcoRI两酶切位点将GFP序列替换为RFP序列，得到AAV-U6sgRNA-CMV-RFP载体。

[0063] 改造后的AAV质粒载体通过测序结果验证了质粒构建成功。

[0064] 实施例2构建含有猴PINK1基因靶序列的CRISPR/Cas9的sgRNA载体

[0065] 1.sgRNA序列的设计

[0066] 为了筛选能够进行基因编辑且脱靶效应较小的PINK1 sgRNA序列，申请人利用NCBI的Blast软件在猴PINK1蛋白质编码区基因(SEQ ID NO.1)上筛选了脱靶效应低且符合CRISPR/Cas9结合基因组特征(5’-G(19N)-NGG3’)或者(5’-CCN(19N)-C-3’)的靶序列位点。

[0067] 发明人在猴PINK1基因的2号及4号外显子(图2)分别设计了多个sgRNA，即：PINK1 exon2-T1,T2,T3(图3)和PINK1exon4-T1,T2,T3(图4)，其中PINK1 exon2-T靶序列中含有特异的Hpy188I酶切位点序列便于检测突变。sgRNA具体序列信息如表1所示：

[0068] 表1 sgRNA序列信息

[0069]

[0070]

[0071] 2.sgRNA的筛选

[0072] Cas9 mRNA及PINK1各位点的sgRNA合成步骤具体如下：

[0073] (1)Cas9 mRNA合成

[0074] 通过在Addgene上购买带有T7启动子的Cas9质粒(MLM3613,Addgene，货号：#42251)。将该Cas9质粒经PmeI内切酶(NEB,R0560)线性化后可利用体外转录试剂盒(Ambion,AM1344)进行体外转录。反应体系如下：2.5nM NTP 4μL，10×reaction buffer 2μL，DNA 1μg，T7 enzyme mix 2μL，nucease-free water补至20μL，37℃温箱孵育2h；随后用1μL DNase于37℃消化15min；然后补加DEPC水至50μL，加25μL LiCl(7.5mM)，-20℃沉淀
30min；然后低温4℃以14000rpm转速离心30min；去上清，沉淀再用75％乙醇洗一次，同样以
14000rpm离心8min，最后添加适量的nucease-free water溶解从而制备得到Cas9 mRNA。

[0075] (2)sgRNA的体外转录合成

[0076] 将PINK1基因各个sgRNA质粒构建到含T7启动子的骨架质粒上Pmd 18T simple vector(Takara,货号D103A)，用BbsI酶切位点连接构建，随后将连接有目的基因打靶序列的sgRNA载体经T7-cr fwd和tracr rev引物进行PCR后，胶回收PCR片段；T7-cr fwd序列：5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’，tracr rev序列：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’。随后利用Ambion体外转录试剂盒进行体外转录合成与纯化，步骤见上述Cas9 mRNA的体外转录合成体系。

[0077] 在猴胚胎水平上验证所设计的位点的打靶效率，胚胎注射操作步骤见文献Tu et al.2017(DOI:10.1038/srep42081)。

[0078] 单个位点注射检测打靶效率注射剂量及组合如下：Cas9 mRNA(200ng L-1)/PINK1 exon2-T1(50ng L-1)；Cas9 mRNA(200ng L-1)/PINK1 exon2-T2(50ng L-1)；Cas9 mRNA(200ng L-1)/PINK1 exon2-T3(50ng L-1)；Cas9 mRNA(200ng L-1)/PINK1 exon4-T1(50ng -1 -1 -1 -1L )；Cas9 mRNA(200ng L )/PINK1 exon4-T2(50ng L )；Cas9 mRNA(200ng L )/PINK1 exon4-T3(50ng L-1)。在猴胚胎细胞中利用PCR克隆剪切后的DNA进行测序来评价sgRNA的剪切效率及脱靶效应等，对所涉及的各位点的sgRNA的打靶效率进行验证及分析。

[0079] (1)收集注射有Cas9/PINK1 sgRNA的四细胞期猴胚胎细胞，用Lysis buffer 55℃裂解3小时，其中Lysis buffer配方为50m mol Tri-hcl(pH8.5)，1m mol EDTA(pH8.0)，0.5％(v/v)Tween20，20mg/L proteinase K。

[0080] (2)由于猴胚胎细胞数目较少(DNA模板量较少)需要通过巢式PCR扩增出目的条带。因此需要设计两对nested引物(如表2所示)，利用Pink1-Exon2-1st-F/Pink1-Exon2-1st-R及Pink1-Exon4-1st-F/Pink1-Exon4-1st-R先进行1次PCR，随后再从1次PCR产物中取1μL作为模板DNA利用Pink1-Exon2-2st-F/Pink1-Exon2-2st-R及Pink1-Exon4-2st-F/Pink1-Exon4-2st-R引物进行第二次PCR。所使用的引物序列如下表所示：

[0081] 表2 PINK1基因Exon2及Exon4的巢式PCR引物序列

[0082]

[0083] (3)将第二次PCR后的产物利用靶位点上特异的酶切位点进行突变检测，其中，PINK1 Exon2 PCR产物利用Hpy188I酶切鉴定；PINK1 Exon4 PCR产物使用利用T7E1 assay，进行检测。

[0084] 所述的Hpy188I(货号为R0617)、T7 Endonuclease I酶(货号为M0302)均购自NEB公司。

[0085] ①Hpy188I酶切体系20μL(根据情况也可做120μL体系)，具体操作参照说明书进行：

[0086] DNA    4μL

[0087] Enzyme 0.5μL

[0088] Buffer 2μL

[0089] 加水补至20μL，37℃酶切2～3h。

[0090] ②T7E1 assay：

[0091] 取PCR产物3～5μL首先进行退火DNA双链重新结合配对，PCR程序如下：95℃，10min；85℃，1min；75℃，1min；65℃，1min；55℃，1min；45℃，1min；35℃，1min；25℃，1min；4℃，10min。随后加T7E1酶进行酶切(具体操作参照说明书进行)，37℃孵育45min。

[0092] (4)PCR产物初步鉴定出阳性克隆之后，送PCR产物测序再确认突变。

[0093] 结果如表3所示，图5为代表性DNA凝胶电泳结果图；其中WT代表未注射Cas9/PINK1 Exon2/Exon4 sgRNA的正常猴胚胎，而上图中的1～11为注射Cas9/PINK1 Exon2-T2 sgRNA的猴胚胎，而下图中的1～14为注射Cas9/PINK1 Exon4-T2 sgRNA的猴胚胎)。

[0094] 表3胚胎中的基因打靶效率比较

[0095]

[0096] 由此可见，CRISPR/Cas9在PINK1 exon2-T2及PINK1 exon4-T2位点的打靶效率与其它位点相比具有显著性差异，能够实现高效打靶。

[0097] 选用靶位点是可高效打靶的PINK1 exon2-T2及PINK1 exon4-T2用于后续的猴脑立体定位注射，进行动物建模，序列为：

[0098] PINK1 exon2 sgRNA(即PINK1 exon2-T2):

[0099] 5’-GGCTGGAGGAGTATCTGATAGGG-3’,

[0100] PINK1 exon4 sgRNA(即PINK1 exon4-T2):

[0101] 5’-CCGGGTTCTCCGCGCTTTCACC-3’，

[0102] 通过SapI酶切位点连接构建到实施例1改造后的AAV-U6sgRNA-CMV-RFP载体中得到病毒载体AAV-sgRNA-PINK1 Exon2和AAV-sgRNA-PINK1 Exon4，并验证了这两种sgRNA能够进行高效基因打靶，造成PINK1 DNA片段缺失与其它类型的突变(图6)，具体操作步骤见文献Hui Zhao et.al.,2017(DOI:10.1038/cr.2017.95.)；Niu Y et.al.,2014.(DOI:10.1016/j.cell.2014.01.027)中的描述。

[0103] 3.PINK1 exon2-T2、PINK1 exon4-T2的进一步研究

[0104] (1)T7E1酶切法检测

[0105] 在细胞与胚胎水平实验的检测所使用位点的脱靶效应作进一步研究，通过T7E1酶切法检测可能产生脱靶效应的基因(CDK15,UbcH42,UspY9 and OR2L2)，相关操作方法详见文献Niu Y et.al.,2014.(DOI:10.1016/j.cell.2014.01.027)。

[0106] T7E1酶切法检测结果如图7所示，展示了8个样本的检测结果；均未检测到脱靶效应发生，红色为与PINK1基因靶序列不同的碱基序列。

[0107] (2)全基因组脱靶效应分析

[0108] 对PINK1 exon2-T2、PINK1 exon4-T2进行全基因组脱靶分析，操作方法参考文献Wang et.al,2016(DOI:10.1038/srep20620)；Yang et.al.,J Clin Invest,2017(DOI:10.1172/JCI92087)。

[0109] 全基因组分析脱靶效应分析结果如图8所示，靶序列及对应20个潜在脱靶序列的相对测序深度统计表明，潜在的脱靶位点并未发生明显突变，但靶位点序列因发生突变而导致DNA reads数目减少。

[0110] 由此可见，本发明的两条sgRNA的脱靶效应(副作用)非常低。

[0111] 实施例3病毒包装及动物模型的构建

[0112] 对实施例2中所改造及构建的病毒载体AAV-sgRNA-PINK1 Exon2和AAV-sgRNA-PINK1 Exon4及实施例1构建得到的AAV-Cas9进行病毒包装，具体步骤见文献Yang et.al.,J Clin Invest,2017(doi:10.1172/JCI92087)，并通过立体定位注射方法注射入猴脑黑质部位，操作方法如图9所示。一共使用了11头食蟹猴进行动物模型的构建，其中6头为雄性，5头为雌性；3岁动物3头，8岁动物4头；12岁动物4头。

[0113] 具体注射方案为：通过核磁共振扫描图像(MRI)对猴大脑黑质部位进行立体定位，参数以MRI实际测量为准。随后在猴右侧黑质注射12μL(AAV-Cas9病毒滴度为1012vg/mL，AAV-sgRNA-PINK1滴度为1012vg/mL)的AAV-Cas9/AAV-sgRNA-PINK1 Exon2/AAV-sgRNA-PINK1 Exon4，其中，AAV-Cas9、AAV-sgRNA-PINK1 Exon2、AAV-sgRNA-PINK1 Exon4按注射体积10：1：1配比。左侧黑质注射上述AAV-Cas9/AAV-sgRNA-control混合病毒12μL(注射体积按10：2配比)。

[0114] 图10为猴大脑立体定位注射61天后的结果照片，注射具体部位左侧黑质为AAV载体对照，右侧黑质为PINK1敲除病毒)。由于改造后的AAV载体表达RFP报告基因，RFP抗体(购自Rockland,货号#600-401-379)的免疫组化染色显示在注射孔位置附近有大面积的神经元表达病毒载体。具体步骤见文献①Yang et al.,J Neurosci,2015(DOI:10.1523/JNEUROSCI.0772-15.2015)；②Yang et al.,J Clin Invest 2017(doi:10.1172/JCI92087)中的描述。

[0115] 待病毒注射61天后，将注射后的猴子麻醉后灌流取出大脑黑质进行免疫组化染色。结果如图11所示，黑质中注射区(injected)的神经细胞(NeuN染色)与非注射区(non-injected)比较明显减少，而注射区残余的表达RFP报告基因的细胞多为胶质细胞。图12为左侧黑质注射AAV载体对照与右侧黑质注射AAV载体敲除PINK1后神经元数目的统计结果(n＝11只猴,***<0.001)。由此可见，在病毒注射61天后，注射敲除PINK1基因的病毒载体(AAV-Cas9/AAV-sgRNA-PINK1 Exon2/AAV-sgRNA-PINK1 Exon4)的右侧大脑黑质出现神经元退变及死亡，而对侧注射病毒载体对照(AAV-Cas9/AAV-sgRNA-control)的黑质部位神经元则无明显神经元死亡。

[0116] 此外，发明人还对注射2个月后的猴大脑进行MRI检测，结果如图13所示，MRI结果显示右侧黑质区域(箭头所指处)在敲除PINK1基因后出现结构性损伤(明显空洞)或密度减低，表明神经组织结构受损或缺失。上述检测均表明在黑质部位特异性敲除PINK1基因可导致神经元死亡。

[0117] 实施例4视频录像及行为学分析

[0118] 在实施例3对猴立体定位注射病毒后，同时对受试食蟹猴进行视频录像及行为学分析。

[0119] 动物肢体运动状况通过评价动物在开阔地自由行走和取食的准确性和稳定性获得。具体来讲，是将动物放置于一个空房间中，地面分散撒一些坚果，用摄像机记录动物自由行走和取食的行为动作。然后让3个实验不相关人员阅读录像，评价动物运动过程中有无运动障碍。同对侧未实施PINK1打靶的肢体运动相比，观察发现步伐间距异常、迈步左右偏移、取食不稳、动作速率减慢记录为一次运动异常。总的运动障碍频率取3个观测者的平均值除以总动作次数获得。

[0120] 发明人发现，立体定位注射3周后，猴出现类似于帕金森病人的运动障碍症状。由图14、图15可知，敲除右侧黑质PINK1基因3周后，该脑区交叉支配的左侧上下肢出现明显的运动障碍；而注射左侧黑质AAV载体对照病毒后的右侧下肢运动正常，上肢抓取食物正常。

[0121] 对动物运动障碍变化进行分析，结果如图16所示，运动功能障碍出现后，症状表型稳定，动物脑注射4周(由于不同动物症状出现时间略所不同，这可能与动物大小和耐受程度有关，但是通过本发明的构建方法，受试动物都会在3～4周后出现运动障碍症状)后开始出现运动功能障碍，其动作移动准确性对比注射前明显下降，而且，运动障碍表型稳定，注射后4周至16周运作障碍没有出现自我恢复或恶化的情况。

[0122] 在动物脑注射20周时，发明人还对有运动症状的注射猴口服给予复方左旋多巴胺(200mg/天)，结果如图17所示，实验发现治疗2周后能明显改善运动功能。

[0123] 总体来看，通过本发明的方法造模的11头动物中有10头出现典型PD病理与运动障碍，成模率逾90％，所以，本发明的方法是非常高效的。

[0124] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。