雷公藤甲素靶向前药及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，特别涉及靶向诱生型一氧化氮合酶(iNOS)雷公藤甲素前药及其制备方法和应用。该雷公藤甲素靶向前药的R1为L‑精氨酸、L‑精氨酸甲酯、L‑Nω‑NO‑精氨酸、L‑Nω‑NO‑精氨酸甲酯、L‑胍氨酸、L‑硫代胍氨酸、L‑赖氨酸或L‑鸟氨酸。本发明利用炎症部位诱生型一氧化氮合酶(iNOS)高表达的特点，以iNOS特异性底物(基团)对雷公藤甲素进行半合成制备前药，通过其靶向特性降低雷公藤甲素的毒性、改善其生物利用度，其抗炎效果显著好于雷公藤甲素，可以实现对雷公藤甲素有效开发和利用。

权利要求

1.一种雷公藤甲素衍生物，其特征在于，其为式I所示化合物：

其中，R1为以下结构中的一种：

2.权利要求1所述雷公藤甲素衍生物的制备方法，其特征在于，将雷公藤甲素琥珀酸酯加入有机溶剂-水混合溶剂中，加入碱使体系碱化，在活化剂的作用下活化羧基，得到雷公藤甲素琥珀酸酯活性中间体，之后加入氨基酸的水溶液反应，得到雷公藤甲素衍生物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱为NaHCO3、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、碳酸钾、三乙胺、DIPEA、DMAP以及N-甲基吗啉中一种或两种。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述活化剂为六氟磷酸酯碳鎓盐、四氟磷酸酯碳鎓盐以及六氟磷酸酯鏻鎓盐。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述雷公藤甲素琥珀酸酯、碱、活化剂、氨基酸质量比为1：(2.02～4.06)：(0.52～2.29)：(1.23～2.36)。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述活化剂为六氟磷酸酯碳鎓盐、四氟磷酸酯碳鎓盐或六氟磷酸酯鏻鎓盐中的一种或几种，所述六氟磷酸酯碳鎓盐为：HATU、HBTU、HCTU、HApyU或HBpyU中的一种或几种；所述四氟磷酸酯碳鎓盐为：TBTU、TSTU或TNTU中的一种或几种；所述六氟磷酸酯鏻鎓盐为：BOP、pyBOP或pyAOP中的一种或几种。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂-水混合溶剂中有机溶剂为DMF、THF、乙腈、DMSO、1,4二氧六环、丙酮或吡啶中的一种或几种。

8.权利要求1所述雷公藤甲素衍生物在制备具有抗炎、抗肿瘤或免疫抑制作用的药物制剂中的应用。

9.一种雷公藤甲素衍生物药物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述雷公藤甲素衍生物和药学上可接受的辅料。

说明书

雷公藤甲素靶向前药及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，特别涉及靶向诱生型一氧化氮合酶(iNOS)雷公藤甲素靶向前药及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 雷公藤甲素又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇，CAS编号为38748-32-2，分子式为C20H24O6，分子量为360.4，其化学结构式见式Ⅱ，它是从卫矛科植物雷公藤的根、叶、花及果实中提取的一种松香烷类二萜内酯。

[0003]

[0004] 现代药理研究表明，雷公藤甲素具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等作用，特别是对类风湿性关节炎(RA)具有很好的疗效，雷公藤甲素能在短时间内明显减轻关节肿胀、疼痛，改善关节功能障碍，与传统的激素类药物、非甾体抗炎药相比有较大的优势。雷公藤甲素难溶于水，易溶于甲醇、二甲基亚砜、无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿等；由于雷公藤甲素水溶性差，治疗窗窄，毒性大，不良反应率达到44％，因而其应用受到限制。在免疫系统中，一氧化氮(NO)既是白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的效应分子，也是它们的调节分子。NO产生异常可能导致多种疾病的发生，如炎症、休克、哮喘等与NO过量生成有关，一氧化氮合酶是以L-精氨酸和L-瓜氨酸为底物催化合成NO的，因此一氧化氮合酶(NOS)可以作为药物靶点进行相关药物的研发。文献(European Journal of Pharmacology,2004,494(1):1-9.)报道雷公藤甲素可以阻断NF-κB以及JNK的磷酸化，从而抑制NO的合成和iNOS的表达来发挥抗炎和免疫抑制活性。US6569893公开了在雷公藤甲素C-14位引入水溶性氨基酸或多肽制备前药，以此来提高其水溶性和生物利用度。本发明利用炎症部位诱生型一氧化氮合酶(iNOS)高表达的特点，以iNOS特异性底物L-精氨酸、L-瓜氨酸及其类似物对雷公藤甲素进行半合成制备前药，化合物经体内吸收后靶向炎症部位，能有效降低雷公藤甲素毒性，同时也改善其生物利用度，其抗炎效果显著好于雷公藤甲素，可以实现对雷公藤甲素有效开发和利用。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明提供了靶向诱生型一氧化氮合酶(iNOS)雷公藤甲素前药及其制备方法和应用。该雷公藤甲素靶向前药具有较高的生物活性。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种雷公藤甲素靶向前药，其为式I所示化合物：

[0008]

[0009] 其中，其中，R1为L-精氨酸、L-精氨酸甲酯、L-Nω-NO2-精氨酸、L-Nω-NO2-精氨酸甲酯、L-胍氨酸、L-硫代胍氨酸、L-赖氨酸或L-鸟氨酸。

[0010] 本发明还提供了该雷公藤甲素靶向前药的制备方法，该制备方法包括：活化羧基：将雷公藤甲素琥珀酸酯加入有机溶剂-水混合溶剂中，在碱性环境中加入活化剂，得到雷公藤甲素琥珀酸酯活性酯中间体。酰胺化阶段：将氨基酸配成高浓度水溶液调节pH为该氨基酸的等电点，缓慢滴加至反应体系得雷公藤甲素靶向前药。

[0011] 作为优选，该制备方法包括：将雷公藤甲素琥珀酸酯加入有机溶剂-水混合溶剂中，再加入碱使体系碱化，混合搅拌后，缓慢分批加入活化剂，反应活化完全后滴加pH为该氨基酸等电点的高浓度水溶液反应24h，旋干溶剂直接通过柱层析纯化得到雷公藤甲素靶向前药。

[0012] 作为优选，碱为NaHCO3、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、碳酸钾、三乙胺、DIPEA、DMAP以及N-甲基吗啉中一种或两种。

[0013] 作为优选，活化剂为六氟磷酸酯碳鎓盐、四氟磷酸酯碳鎓盐或六氟磷酸酯鏻鎓盐中的一种或几种。

[0014] 作为优选，六氟磷酸酯碳鎓盐为：HATU、HBTU、HCTU、HApyU或HBpyU中的一种或几种。

[0015] 作为优选，四氟磷酸酯碳鎓盐为：TBTU、TSTU或TNTU中的一种或几种。

[0016] 作为优选，六氟磷酸酯鏻鎓盐为：BOP、pyBOP或pyAOP中的一种或几种。

[0017] 作为优选，雷公藤甲素琥珀酸酯、碱、活化剂与氨基酸的重量比为1：(2.02～4.06)：(0.52～2.29)：(1.23～2.36)。

[0018] 作为优选，有机溶剂-水混合溶剂中有机溶剂为DMF、THF、乙腈、DMSO、1,4二氧六环、丙酮或吡啶中的一种或几种。

[0019] 作为优选，有机溶剂-水混合溶剂中，有机溶剂与水的体积比为(10:1.2)～(10:4.6)。

[0020] 本发明还提供了该雷公藤甲素靶向前药在制备具有抗炎、抗肿瘤或免疫抑制作用的药物制剂中的应用。

[0021] 本发明还提供了一种雷公藤甲素靶向前药的药物制剂，包括本发明雷公藤甲素靶向前药和药学上可接受的辅料。

[0022] 本发明提供了雷公藤甲素靶向前药及其制备方法和应用。该雷公藤甲素靶向前药为式Ⅱ所示化合物，其中，R1为L-精氨酸、L-精氨酸甲酯、L-Nω-NO-精氨酸、L-Nω-NO-精氨酸甲酯、L-胍氨酸、L-硫代胍氨酸、L-赖氨酸或L-鸟氨酸。

[0023] 本发明通过化学半合成手段修饰雷公藤甲素得到能靶向炎症部位诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的雷公藤甲素前药，有效降低毒性，并改善其生物利用度，效果显著好于雷公藤甲素，可以实现对雷公藤甲素有效开发和利用。

附图说明

[0024] 图1示实施例1甲素琥珀酸L-精氨酸酰胺(TR-1)制备路线；

[0025] 图2示实施例2甲素琥珀酸L-精氨酸酰胺甲酯(TR-2)制备路线；

[0026] 图3示实施例3甲素琥珀酸L-Nω-NO-精氨酸酰胺(TR-3)制备路线；

[0027] 图4示实施例4甲素琥珀酸L-Nω-NO-精氨酸酰胺甲酯(TR-4)制备路线；

[0028] 图5示实施例5甲素琥珀酸L-瓜氨酸酰胺(TR-5)制备路线；

[0029] 图6示实施例6甲素琥珀酸L-硫代瓜氨酸酰胺(TR-6)制备路线；

[0030] 图7示实施例7甲素琥珀酸L-赖氨酸酰胺(TR-7)制备路线；

[0031] 图8示实施例8甲素琥珀酸L-鸟氨酸酰胺(TR-8)制备路线。

具体实施方式

[0032] 本发明公开了雷公藤甲素靶向前药及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0033] 本发明提供的雷公藤甲素靶向前药的制备方法具体步骤为：

[0034] 1.雷公藤甲素琥珀酸端位羧基的活化(活性酯中间体)

[0035] 以THF-水(v:v)＝10:1.5为溶剂、重量份数为1的雷公藤甲素琥珀酸酯搅拌溶解，加入重量份数为2.02～4.06的三乙胺搅拌均匀，分批缓慢加入重量份数0.52～2.29的活化剂，室温搅拌活化45min～1h，TLC检测活化完全后，于低温反应器冷却至-5℃～-30℃,搅拌备用。

[0036] 2.活性酯中间体酰胺化阶段

[0037] 另称取重量份数为1.23～2.36的氨基酸，溶于500μL水中，将该氨基酸的水溶液调节pH为该氨基酸的等电点，使用微量移液枪分五次将氨基酸的水溶液滴加至冷却好的活化体系中，20min内滴完，缓慢恢复至室温反应2～24h。TLC检测反应完毕后，旋干溶剂，于层析柱上纯化，流动相：CHCl3:MeOH＝20:1。

[0038] 本发明提供的雷公藤甲素靶向前药及其制备方法和应用中所用原料药或辅料均可由市场购得。

[0039] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0040] 实施例1雷公藤甲素琥珀酸L-精氨酸酰胺的制备

[0041] 雷公藤甲素靶向前药的制备方法，包括以下步骤：

[0042] A1：雷公藤甲素琥珀酸端位羧基的活化

[0043] 如图1所示的制备工艺。以THF-水(v:v)＝10:1.5为溶剂、重量份数为1的雷公藤甲素琥珀酸酯搅拌溶解，加入重量份数为2.02～4.06的三乙胺搅拌均匀，分批缓慢加入重量份数0.52～2.29的活化剂，室温搅拌活化45min～1h，TLC检测活化完全后，于低温反应器冷却至-5℃～-30℃,搅拌备用。

[0044] B1：活性酯中间体酰胺化阶段

[0045] 另称取L-精氨酸25mg(0.141mmol)，溶于500μL水中，将L-精氨酸的水溶液调节pH为11，使用微量移液枪分五次将氨基酸的水溶液滴加至冷却好的活化体系中，20min内滴完，缓慢恢复至室温反应2～24h。TLC检测反应完毕后，旋干溶剂，于层析柱上纯化，流动相：CHCl3:MeOH＝20:1，得白色固体65mg，收率97％。投料配比见表1。

[0046] 表1雷公藤甲素琥珀酸L-精氨酸酰胺投料配比

[0047]

[0048]

[0049] 目标化合物验证数据：雷公藤甲素琥珀酸L-精氨酸酰胺1H NMR(600MHz,)δ5.05(s,1H),4.24(dd,J＝7.3,5.3Hz,1H),3.93(d,J＝3.0Hz,1H),3.60(d,J＝2.8Hz,1H),3.44(d,J＝5.6Hz,1H),3.30–3.27(m,2H),3.17(ddt,J＝20.7,13.6,6.8Hz,2H),2.77–2.65(m,3H),2.58(t,J＝7.1Hz,2H),2.27–2.19(m,2H),2.05(t,J＝10.6Hz,1H),1.91–1.82(m,3H),
1.69(dt,J＝13.7,7.3Hz,1H),1.64–1.59(m,2H),1.47(dd,J＝12.5,4.9Hz,1H),1.35–1.25(m,1H),1.02(d,J＝15.1Hz,3H),0.92(t,J＝7.5Hz,3H),0.81(t,J＝7.4Hz,3H).MS-EI(m/z):639.26[M+Na]+。

[0050] 实施例2雷公藤甲素琥珀酸L-精氨酸酰胺甲酯制备

[0051] 雷公藤甲素靶向前药的制备方法，包括以下步骤：

[0052] A2：雷公藤甲素琥珀酸端位羧基的活化

[0053] 如图2所示的制备工艺。以THF-水(v:v)＝10:1.5为溶剂、重量份数为1的雷公藤甲素琥珀酸酯搅拌溶解，加入重量份数为2.02～4.06的三乙胺搅拌均匀，分批缓慢加入重量份数0.52～2.29的活化剂，室温搅拌活化45min～1h，TLC检测活化完全后，于低温反应器冷却至-5℃～-30℃,搅拌备用。

[0054] B2：活性酯中间体酰胺化阶段

[0055] 另称取L-精氨酸25mg(0.141mmol)，溶于500μL水中，将L-精氨酸的水溶液调节pH为11，使用微量移液枪分五次将氨基酸的水溶液滴加至冷却好的活化体系中，20min内滴完，缓慢恢复至室温反应2～24h。TLC检测反应完毕后，旋干溶剂，于层析柱上纯化，流动相：CHCl3:MeOH＝20:1，得白色固体62mg，收率91％。投料配比见表2。

[0056] 表2雷公藤甲素琥珀酸L-精氨酸酰胺甲酯制备投料配比

[0057]

[0058]

[0059] 目标化合物验证数据：雷公藤甲素琥珀酸L-精氨酸酰胺甲酯1H NMR(600MHz,)δ5.04(s,1H),4.42(dd,J＝8.9,5.2Hz,1H),3.94(d,J＝3.0Hz,1H),3.70(s,3H),3.60(d,J＝
2.9Hz,1H),3.43(d,J＝5.7Hz,1H),3.28(dd,J＝3.0,1.3Hz,2H),3.22–3.15(m,2H),2.77–
2.66(m,3H),2.58(t,J＝6.9Hz,2H),2.28–2.18(m,3H),2.11–2.00(m,1H),1.91–1.85(m,
3H),1.67(dddd,J＝13.3,9.2,8.0,2.9Hz,3H),1.49–1.43(m,1H),1.37–1.25(m,5H),1.00(s,3H),0.91(d,J＝7.0Hz,3H),0.80(d,J＝6.9Hz,3H).MS-EI(m/z):631.29[M+H]+。

[0060] 实施例3雷公藤甲素琥珀酸L-Nω-NO2-精氨酸酰胺制备

[0061] 余下实施例均采用实施例1以及实施例2的操作步骤，不再重复赘述，只是所用的溶剂、碱、投料量的不同，这些改变将在附图说明以及投料配比中体现。

[0062] 如图3所示合成线路，制备投料配比见表3。

[0063] 表3雷公藤甲素琥珀酸L-Nω-NO2-精氨酸酰胺制备投料配比

[0064]

[0065] 目标化合物验证数据：雷公藤甲素琥珀酸L-Nω-NO2-精氨酸酰胺，白色固体粉末，54mg，收率75％。1H NMR(600MHz,)δ8.52(d,J＝3.9Hz,1H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.33(dd,J＝8.4,4.4Hz,1H),5.04(s,1H),4.78(dd,J＝25.4,8.2Hz,2H),4.29(s,1H),3.92(d,J＝3.1Hz,1H),3.59(d,J＝2.9Hz,1H),3.44(d,J＝5.6Hz,1H),3.32(s,2H),2.74(s,2H),
2.68–2.60(m,2H),2.55(s,1H),2.22(s,2H),2.04(td,J＝12.3,3.2Hz,1H),1.87(dd,J＝
17.5,10.7Hz,3H),1.69(d,J＝14.5Hz,3H),1.47(dd,J＝12.5,5.1Hz,1H),1.34–1.25(m,
5H),1.00(s,3H),0.90(d,J＝7.0Hz,3H),0.80(d,J＝6.9Hz,3H).MS-EI(m/z):662.26[M+H]+。

[0066] 实施例4雷公藤甲素琥珀酸L-Nω-NO2-精氨酸酰胺甲酯制备

[0067] 如图4所示合成线路，制备投料配比见表4：

[0068] 表4雷公藤甲素琥珀酸L-Nω-NO2-精氨酸酰胺制备投料配比

[0069]

[0070] 目标化合物验证数据：雷公藤甲素琥珀酸L-Nω-NO2-精氨酸酰胺甲酯，白色固体粉末，50mg，收率68％。1H NMR(600MHz,)δ5.04(s,1H),4.76(ddd,J＝17.7,9.3,1.5Hz,2H),4.43(s,1H),3.92(d,J＝3.2Hz,1H),3.69(s,3H),3.59(d,J＝2.8Hz,1H),3.44(d,J＝
5.7Hz,1H),3.21(dd,J＝13.8,7.0Hz,1H),2.74(dd,J＝10.9,5.4Hz,2H),2.65(dd,J＝
11.7,5.5Hz,1H),2.62(t,J＝6.7Hz,1H),2.58(dd,J＝7.7,5.9Hz,1H),2.53(dt,J＝13.7,
6.6Hz,1H),2.23(dt,J＝11.8,4.4Hz,2H),2.04(s,1H),1.88(s,2H),1.84(d,J＝3.4Hz,
6H),1.47–1.45(m,1H),1.37(s,1H),1.30(d,J＝5.4Hz,1H),1.26(s,1H),0.99(s,3H),0.90(d,J＝7.0Hz,3H),0.79(d,J＝6.9Hz,3H).MS-EI(m/z):676.28[M+H]+。

[0071] 实施例5雷公藤甲素琥珀酸甲素琥珀酸L-瓜氨酸酰胺制备

[0072] 如图5所示合成线路，制备投料配比见表5：

[0073] 表5雷公藤甲素琥珀酸L-瓜氨酸酰胺制备投料配比

[0074]

[0075] 目标化合物验证数据：雷公藤甲素琥珀酸L-瓜氨酸酰胺，白色固体粉末，56mg，收率83％。1H NMR(600MHz,)δ5.05(d,J＝3.1Hz,1H),4.79(dd,J＝16.7,1.4Hz,2H),4.25(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H),3.93(d,J＝3.2Hz,1H),3.60(d,J＝2.8Hz,1H),3.44(d,J＝5.8Hz,1H),3.09(t,J＝6.7Hz,2H),2.77–2.53(m,6H),2.23(ddd,J＝17.9,12.0,4.3Hz,2H),2.05(d,J＝3.0Hz,1H),1.92–1.81(m,3H),1.65(dd,J＝13.8,7.1Hz,1H),1.55–1.50(m,2H),1.48(dd,J＝12.5,5.0Hz,1H),1.30(ddd,J＝19.5,11.7,5.3Hz,3H),1.01(s,3H),0.91(d,J＝
7.0Hz,3H),0.80(d,J＝6.9Hz,3H).MS-EI(m/z):618.26[M+H]+。

[0076] 实施例6雷公藤甲素琥珀酸甲素琥珀酸L-硫代瓜氨酸酰胺制备

[0077] 如图6所示合成线路，制备投料配比见表6：

[0078] 表6雷公藤甲素琥珀酸L-硫代瓜氨酸酰胺制备投料配比

[0079]

[0080]

[0081] 目标化合物验证数据：雷公藤甲素琥珀酸L-硫代瓜氨酸酰胺，淡黄色固体粉末，58mg，收率84％。MS-EI(m/z):634.24[M+H]+。

[0082] 实施例7雷公藤甲素琥珀酸甲素琥珀酸L-赖氨酸酰胺制备

[0083] 如图7所示合成线路，制备投料配比见表7：

[0084] 表7雷公藤甲素琥珀酸L-赖氨酸酰胺制备投料配比

[0085]

[0086] 目标化合物验证数据：雷公藤甲素琥珀酸L-赖氨酸酰胺，米白色固体粉末，35mg，1
收率54％。H NMR(600MHz,METHANOL-D4)δ5.05(s,1H),4.79(d,J＝17.7Hz,2H),3.94(s,
1H),3.60(s,1H),3.44(s,1H),3.32(dd,J＝2.4,1.1Hz,1H),3.15(d,J＝3.4Hz,1H),2.80–
2.71(m,2H),2.72–2.54(m,3H),2.53–2.48(m,1H),2.23(dd,J＝20.8,12.8Hz,2H),2.05(s,
1H),1.87(dd,J＝17.4,10.7Hz,3H),1.70–1.62(m,1H),1.54–1.45(m,2H),1.43–1.36(m,
1H),1.35–1.20(m,5H),1.00(s,3H),0.91(d,J＝6.4Hz,3H),0.80(d,J＝5.9Hz,3H).[0087] MS-EI(m/z):589.27[M+H]+。

[0088] 实施例8雷公藤甲素琥珀酸甲素琥珀酸L-鸟氨酸酰胺制备

[0089] 如图8所示合成线路，制备投料配比见表8：

[0090] 表8雷公藤甲素琥珀酸L-鸟氨酸酰胺制备投料配比

[0091]

[0092] 目标化合物验证数据：雷公藤甲素琥珀酸L-赖氨酸酰胺，白色固体粉末，45mg，收率72％。1H NMR(600MHz,METHANOL-D4)δ5.05(s,1H),4.82–4.73(m,2H),3.94(t,J＝3.0Hz,1H),3.60(d,J＝3.1Hz,1H),3.44(dd,J＝5.7,3.0Hz,1H),3.18(dd,J＝12.1,5.6Hz,1H),
2.78–2.48(m,6H),2.24(ddd,J＝27.6,14.7,9.8Hz,2H),2.08–2.00(m,1H),1.90–1.83(m,
3H),1.70–1.54(m,2H),1.47(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),1.31–1.26(m,3H),1.00(s,3H),0.91+
(d,J＝7.0Hz,3H),0.80(dd,J＝6.9,1.1Hz,3H).MS-EI(m/z):575.26[M+H]。

[0093] 试验例1抗炎活性测定试验

[0094] 2.1实验材料

[0095] 2.1.1药品与供试动物

[0096] 雷公藤甲素，西安乐森生物科技有限公司提供，(纯度99％)；TR-1～TR-8由成都大学药学与生物工程学院药物化学实验室合成并经HPLC验证其纯度均在99.5％以上。实验动物为BLBC种小鼠，8～12周龄，体重18～22g,雌雄随机；BNFB(2,4-二硝基氟苯)，Adamas试剂公司提供。

[0097] 2.1.2供试药品的配制

[0098] 致敏剂：BNFB，由丙酮-橄榄油(4:1)配置成0.5％的溶液现配现用。

[0099] 供试药物：雷公藤甲素、TR-1～TR-8由0.1％的CMC-Na配成0.4μg/mL的溶液备用。

[0100] 2.2实验方法

[0101] 2.2.1一次致敏

[0102] 小鼠随机分为4组，头尾标记，称重，记录。去除小鼠腹部部分鼠毛，使用0.5％BNFB涂布裸露部位25μL，持续2d，1次/d。

[0103] 2.2.2二次致敏

[0104] 在第一次致敏后5d，配0.5％DNFB溶液，在小鼠左耳二侧各涂布0.5％DNFB 10μL，右耳二侧涂布溶剂(丙酮-橄榄油4:1)。

[0105] 2.3给药

[0106] 腹腔注射于第二次致敏前12h、1h及第二次致敏后12h进行，共注射3次。分为4个组，设置阴性对照组，腹腔注射0.1％CMC-Na，其余腹腔注射按4μg/kg的剂量取供试药品注射。

[0107] 2.4处死

[0108] 处死小鼠后，用8mm打孔器在小鼠左右耳相同位置打孔，耳片称重记录计算耳肿胀度，耳肿胀度＝M(左耳-右耳)/M右耳，计算平均值。

[0109] 2.5数据分析

[0110] 动物实验后获得的数据，经分析归纳后得表9。

[0111] 表9雷公藤甲素及其靶向前药对小鼠的抗炎活性

[0112]衍生物及对照 剂量(μg/kg) 耳肿胀度
阴性对照 0 0.91±0.02
Triptolide 4 0.54±0.02
TR-1 4 0.44±0.03
TR-2 4 0.39±0.01
TR-3 4 0.33±0.01
TR-4 4 0.42±0.01
TR-5 4 0.24±0.04
TR-6 4 0.14±0.01
TR-7 4 0.38±0.01
TR-8 4 0.35±0.01

[0113] 2.6结果

[0114] 本发明中合成的靶向诱生型一氧化氮合酶(iNOS)雷公藤甲素前药TR-1～TR-8经过初步的小鼠实验，在相同的给药剂量、给药方式条件下，其抗炎活性均普遍优于参考药物(雷公藤甲素)。

[0115] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。