一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用

摘要

本发明公开了一种酶活提高的α‑淀粉酶突变体及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明的突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α‑淀粉酶的第82位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸或将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α‑淀粉酶的第405位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸或同时将将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α‑淀粉酶的第82位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸以及第405位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸得到的；将以编码本发明的突变体的基因为目的基因、以pHY300PLK为表达载体、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5为表达宿主构建得到的重组枯草芽孢杆菌工程菌发酵48h，可使得发酵液中α‑淀粉酶的酶活提高至474.7U/mL。

权利要求

1.一种酶活提高的α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述酶突变体是通过将氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第405位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸得到的；

或所述酶突变体是通过同时将氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第82位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸以及第405位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸得到的。

2.如权利要求1所述的一种酶活提高的α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述α-淀粉酶的来源为嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）。

3.如权利要求1或2所述的一种酶活提高的α-淀粉酶突变体，其特征在于，所述α-淀粉酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。

4.编码权利要求1-3任一所述的一种酶活提高的α-淀粉酶突变体的基因。

5.携带权利要求4所述基因的重组质粒。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的构建方法为先根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，再根据设计的突变引物，以携带α-淀粉酶基因的载体为模板进行定点突变。

7.携带权利要求4所述基因或权利要求5或6所述重组质粒的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WS5。

9.权利要求1-3任一所述的一种酶活提高的α-淀粉酶突变体，或权利要求4所述的基因，或权利要求5或6所述的重组质粒，或权利要求7或8所述的宿主细胞在水解淀粉、制备糊精、制备低聚糖、制备麦芽糖以及制备葡萄糖方面的应用。

说明书

一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

[0002] α-淀粉酶(α-amylase，EC.3.2.1.1)是一种重要的糖苷水解酶，其具有广泛的底物偏好性以及产物特异性，能切断淀粉以及相关α-葡聚糖分子中的α-1,4-葡萄糖苷键，并将
淀粉水解为可溶性糊精、低聚糖及麦芽糖和葡萄糖，同时，其能够保留产物的α-异构体构
象。

[0003] 因此，α-淀粉酶被广泛应用于食品、洗涤、造纸、纺织、酒精和医药等行业。

[0004] 根据作用温度的不同，α-淀粉酶也可分为高温、中温和低温α-淀粉酶。其中，高温α-淀粉酶具有良好的热稳定性，且来源广泛，可以从植物、动物和微生物中提取得到。植物、
动物和微生物来源的α-淀粉酶中，微生物来源的高温α-淀粉酶在生产成本、发酵稳定性和
生产时间等方面均比其他来源的有更明显的优势；而在微生物来源的高温α-淀粉酶中，细
菌来源的高温α-淀粉酶热稳定性优势更为明显。

[0005] 因此，来源于细菌的高温α-淀粉酶具有巨大的应用前景。

[0006] 目前，已经有很多文献研究了来源于不同细菌的高温α-淀粉酶在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等细菌中异源表达的情况。

[0007] 高温α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达量比在枯草芽孢杆菌中的高，但由于大肠杆菌在进行发酵产酶的过程中会产生内毒素等有害物质，对人体不利，大大限制了其应用；而枯
草芽孢杆菌的细胞壁不含内毒素，是一种非致病的土壤微生物，已被美国食品药物管理局
和中国相关部门认定为食品安全级菌株GRAS(Generally recognized as safe)，但高温α-
淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达的表达量与活性十分低。

[0008] 上述缺陷均使得来源于细菌的高温α-淀粉酶在工业上难以得到广泛的应用。

发明内容

[0009] 为解决上述问题，本发明提供了一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用。此突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第82位氨基酸由赖氨酸突变为
谷氨酸或将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第405位氨基酸由丝氨酸突变为
精氨酸或同时将将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第82位氨基酸由赖氨酸突
变为谷氨酸以及第405位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸得到的；将以编码此突变体的基因
为目的基因、以pHY300PLK为表达载体、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5为表达宿
主构建得到的重组枯草芽孢杆菌工程菌发酵48h，可使得发酵液中α-淀粉酶的酶活提高至
474.7U/mL。

[0010] 本发明的技术方案如下：

[0011] 本发明提供了一种酶活提高的α-淀粉酶突变体，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第82位氨基酸和/或第405位氨基酸进行突变得到的。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第82位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸得到的；

[0013] 或所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第405位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸得到的；

[0014] 或所述酶突变体是通过同时将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第82位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸以及第405位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸得到的。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶为高温α-淀粉酶。

[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶的来源为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。

[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。

[0018] 本发明提供了编码上述一种酶活提高的α-淀粉酶突变体的基因。

[0019] 本发明提供了携带上述基因的重组质粒。

[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的构建方法为先根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，再根据设计的突变引物，以携带α-淀粉酶基因的载体为模板
进行定点突变。

[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述突变引物中，正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7，反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8。

[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒载体为pHY300PLK。

[0023] 本发明提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5。

[0025] 所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5记载于公开号为CN106754466A的专利文本中。

[0026] 本发明提供了上述一种酶活提高的α-淀粉酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在水解淀粉、制备糊精、制备低聚糖、制备麦芽糖以及制备葡萄糖方面的应
用。

[0027] 有益效果：

[0028] (1)本发明通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第82位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸或将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第405位氨基酸由
丝氨酸突变为精氨酸或同时将将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的α-淀粉酶的第82位氨基
酸由赖氨酸突变为谷氨酸以及第405位氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸得到了酶活提高的α-
淀粉酶突变体；

[0029] (2)将以编码本发明的突变体的基因为目的基因、以pHY300PLK为表达载体、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5为表达宿主构建得到的重组枯草芽孢杆菌工程菌发
酵48h，可使得发酵液中α-淀粉酶的酶活提高至474.7U/mL。

附图说明

[0030] 图1为重组质粒pHY-SPamyE-amyS(K82E/S405R)构建流程图；

[0031] 图2为重组质粒pHY-SPamyE-amyS(K82E/S405R)的QuickCutTM Hind III酶切验证结果；

[0032] 其中，M为DL1000DNA Marker，泳道1为pHY-SPamyE-amyS QuickCutTM Hind III酶切条带；

[0033] 图3为含有重组质粒pHY-SPamyE-amyS(K82E/S405R)的重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图；

[0034] 其中，M为中分子量标准蛋白，泳道1为Bacillus subtilis WS5/pHY-SPamyE-amyS(K82E/S405R)摇瓶发酵上清条带。

具体实施方式

[0035] 本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。

[0036] 下述实施例中涉及的检测方法如下：

[0037] 酶活检测方法：将1mL的1％的可溶性淀粉溶液和0.9mL的20mM、pH6.0的磷酸缓冲液充分混匀，在70℃预热10min，加入0.1mL粗酶液，振荡混匀，反应5min后加入3mL DNS，振
荡，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂进
行同样操作作为空白)。

[0038] 酶活单位定义：在上述条件下，定义每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖所需酶量为一个淀粉水解活力单位。

[0039] 下述实施例中所涉及的培养基如下：

[0040] 种子培养基：8～12g/L的蛋白胨、4～6g/L的酵母粉以及8～12g/L的氯化钠。

[0041] 发酵培养基：20～25g/L的酵母浸膏、5～10g/L的大豆蛋白胨以及4～6g/L的甘油，初始pH为6～7。

[0042] LB固体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl、0.2g/L的琼脂粉。

[0043] LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl。

[0044] 生长培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl、0.5M的山梨醇。

[0045] 电转缓冲液：0.5M的山梨醇、0.5M的甘露醇、10％的葡萄糖。

[0046] 复苏培养基RM：0.5M的山梨醇、0.38M的甘露醇、10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl。

[0047] 下述实施例中涉及的α-淀粉酶如下：

[0048] 所述α-淀粉酶的来源为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0049] 下面，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶的第82位的赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)所得的突变体命名为K82E；将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶的第
405位的丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)所得的突变体命名为S405R；将氨基酸序列如SEQ ID 
NO.1所示的α-淀粉酶的第82位的赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)，同时将第82位的赖氨酸(K)
突变为谷氨酸(E)所得的突变体命名为K82E/S405R。

[0050] 实施例1：α-淀粉酶突变体的制备

[0051] (1)α-淀粉酶单突变体的制备

[0052] 根据氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶的基因序列，分别设计并合成引入K82E、S405R突变的引物，利用快速PCR技术，以携带编码野生型α-淀粉酶的基因的重组载
体pET20b-amyS模板，对α-淀粉酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第82位的
Lys密码子变成Glu密码子，第405位的Ser密码子变成Arg密码子，得到单突变α-淀粉酶；

[0053] 其中，重组载体pET20b-amyS为实验室保存(Ref:L Z,D X,W J.Improving the 2+
thermostability and enhancing the Ca binding of the maltohexaose-formingα-
amylase from Bacillus stearothermophilus.Journal of Biotechnology.2016；222:
65–72.)。

[0054] 引入K82E突变的定点突变引物为：

[0055] 核苷酸序列为SEQ ID NO.5的正向引物：5’-CAAGTACGGCACCGAGGCCCAGTAC-3’(下划线为突变碱基)

[0056] 核苷酸序列为SEQ ID NO.6的反向引物：5’-GTACTGGGCCTCGGTGCCGTACTTG-3’(下划线为突变碱基)

[0057] 引入S405R突变的定点突变引物为：

[0058] 核苷酸序列为SEQ ID NO.7的正向引物：5’-CTATCTGGACCACAGAGACATCATTGGCTGG-3’(下划线为突变碱基)

[0059] 核苷酸序列为SEQ ID NO.8的反向引物：5’-GGTCCAGCCAATGATGTCTCTGTGGTCCAGA-3’(下划线为突变碱基)

[0060] PCR体系见表1：

[0061] 表1 PCR反应体系

[0062] 5xPhusion HF Reaction Buffer 10.0μLdNTP 4.0μL
pET20b-amyS 0.5μL
正向引物 0.5μL
反向引物 0.5μL
Primerstar DNA 0.5μL
ddH2O Up to 50μL

[0063] PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1kb/min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保温。

[0064] PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

[0065] 将验证正确的PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨
苄青霉素)中培养后提取质粒，所有突变质粒均测序正确，得到的重组菌分别命名为E.coli 
JM109/pET20b-amyS(K82E)、E.coli JM109/pET20b-amyS(S405)。

[0066] 测序正确的突变体，从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到的重组菌分别命名为E.coli BL21(DE3)/
pET20b-amyS(K82E)、E.coli BL21(DE3)/pET20b-amyS(S405)。

[0067] (2)α-淀粉酶双突变体的制备

[0068] 以(1)中得到的单突变体K82E编码基因为模板，设计并合成引入S405R突变的引物，利用快速PCR技术，以携带编码单突变体K82E的基因的重组载体pET20b-amyS(K82E)为
模板，对α-淀粉酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第405位的Ser密码子变成
Arg密码子，得到α-淀粉酶的双突变体。

[0069] 引入S405R突变的定点突变引物、PCR反应体系、反应条件及突变基因的测定方法同(1)。

[0070] 将验证正确的PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨
苄青霉素)中培养后提取质粒，所有突变质粒均测序正确，得到的重组菌命名为E.coli 
JM109/pET20b-amyS(K82E/S405R)。

[0071] 测序正确的突变体，从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到的重组菌命名为E.coli BL21(DE3)/
pET20b-amyS(K82E/S405R)。

[0072] 实施例2：α-淀粉酶突变体在大肠芽孢杆菌中摇瓶发酵产酶验证

[0073] (1)α-淀粉酶突变体在大肠芽孢杆菌中摇瓶发酵产酶

[0074] 分别挑取重组菌E.coli BL21(DE3)/pET20b-amyS(K82E)、E.coli BL21(DE3)/pET20b-amyS(S405)、E.coli BL21(DE3)/pET20b-amyS(K82E/S405R)于37℃下于LB液体培
养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到发酵培养基
(含100μg/mL氨苄青霉素)中，在25℃摇床中培养48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min
除菌体，收集离心上清液得到粗酶液。

[0075] (2)α-淀粉酶突变体在大肠芽孢杆菌摇瓶发酵酶活测定

[0076] 测定α-淀粉酶突变体K82E、S405R、K82E/S405R在大肠芽孢杆菌BL21(DE3)摇瓶发酵酶活，α-淀粉酶单突变和双突变体酶的摇瓶培养48h酶活力列于表2中，其中双突变体
K82E/S405R的酶活是野生型酶活的2.1倍，单突变体S405R的酶活是野生型酶活的1.9倍，而
单突变体K82E的酶活仅是野生型酶活的1.2倍。

[0077] 表2α-淀粉酶野生酶及突变体的酶活

[0078]酶 野生菌 K82E S405R K82E/S405R
酶活/U·mL-1 1208.3 1450.0 2295.8 2537.4

[0079] 实施例3：构建重组载体pHY-SPamyE-amyS、pHY-SPamyE-amyS(K82E/S405R)

[0080] 具体步骤如下(构建流程见图1)：

[0081] (1)设计含有同源臂的引物amyS-F、amyS-R，以重组载体pET20b-amyS、pET20b-amyS(K82E/S405R)为模板，PCR扩增出带有同源臂的amyS、amyS(K82E/S405R)

[0082] (2)设计引物pHY-F、pHY-R，以重组载体pHY300PLK-β-CGTase为模板，PCR扩增出载体pHY-SPamyE，其中重组载体pHY300PLK-β-CGTase为实验室保存(Ref:Zhang,K.,Duan,X.,
Wu,J.2016.Multigene disruption in undomesticated Bacillus subtilis ATCC 6051a 
using the CRISPR/Cas9system.Scientific Reports,6.Bacillus subtilis)。

[0083] 引物序列见表3：

[0084] 表3引物序列

[0085]

[0086]

[0087] 注：划线部分为同源臂序列。

[0088] PCR体系见表4：

[0089] 表4 PCR反应体系

[0090]

[0091] PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1kb/min，30个循环，PCR产物进行胶回收。

[0092] (3)将(1)、(2)中扩增出且已回收的两段片段根据 H Cloning Kit试剂盒要求按照插入片段和载体的摩尔比例为2:1进行混合，应用下面连接体系进行连接后将
连接产物转入E.coli JM109感受态细胞，涂板后于37℃过夜培养；

[0093] 连接体系见表5：

[0094] 表5 HD Cloning Kit试剂盒连接体系

[0095] 体系组分 组分用量5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2.0μL
pHY-SPamyE 1.2μL
amyS/amyS(K82E/S405R) 3.5μL
ddH2O 3.3μL

[0096] 连接条件：50℃，25min。

[0097] (4)从过夜培养的平板上挑单菌落，接LB液体培养基于37℃，200rpm下培养8～10hTM
后提质粒进行QuickCut  Hind III酶切验证(验证结果见图2)，酶切验证成功即得重组载
体pHY-SPamyE-amyS、pHY-SPamyE-amyS(K82E/S405R)。

[0098] 酶切体系见表6：

[0099] 表6 QuickCutTM Hind III酶切体系

[0100]

[0101] 酶切条件：37℃酶切反应20min。

[0102] 实施例4：构建分别含有α-淀粉酶野生型及突变体的枯草芽孢杆菌重组菌

[0103] 选取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5作为宿主细胞，构建重组菌，具体步骤如下：

[0104] (1)用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5，然后在LB平板上划线，37℃培养过夜活化；

[0105] (2)从LB平板上挑步骤(1)的单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；

[0106] (3)取2.5mL转接入40mL生长培养基，37℃，200rpm震荡培养4～5h；

[0107] (4)将菌液冰浴10min，然后5000g，4℃，离心5min收集菌体；

[0108] (5)用50ml预冷的电转缓冲液洗涤菌体，5000g，4℃，离心5min去上清，如此漂洗4次；

[0109] (6)将洗涤后的菌体重悬于1mL电转缓冲液中，分装到1.5mL EP管中，每管装200μl感受态细胞；

[0110] (7)将200μL感受态细胞中分别加入10μL实施例3所得的重组质粒，冰浴18min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次，电转仪设置：2.4kv，25μF，200Ω；

[0111] (8)电击完毕后立即加入1mL复苏培养基RM缓慢吹吸混匀，37℃，200rpm，复苏3h后，涂含四环素抗性(50ug/mL)的平板，挑选阳性转化子即得到分别含有重组载体pHY-
SPamyE-amyS、pHY-SPamyE-amyS(K82E/S405R)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5。

[0112] 实施例5：枯草芽孢杆菌WS5重组菌摇瓶发酵产酶及α-淀粉酶酶活的测定

[0113] 将实施例4中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中于35～38℃、180～220rpm条件下培养8～10h，得到种子液，然后将种子液转接至发酵培养基中，于发酵培养
基中于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h，发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液；
(含有重组质粒pHY-SPamyE-amyS(K82E/S405R)的重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵上清的SDS-
PAGE电泳结果见图3)

[0114] 将得到的粗酶液进行酶活检测，检测结果为：含有重组载体pHY-SPamyE-amyS、pHY-SPamyE-amyS(K82E/S405R)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5的酶活分别为206.4U/
mL、474.7U/mL。

[0115] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。