一种TFEB的新易位伴侣及其检测引物和应用

摘要

本发明公开了一种TFEB的新易位伴侣及其检测引物和应用。TFEB的新易位伴侣，为ACTB‑TFEB基因易位，基因融合发生于ACTB的3号外显子与TFEB基因2号外显子之间，包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。检测TFEB新易位伴侣的PCR引物由ACTB‑E3‑F：SEQ ID NO.1和TFEB‑E2‑R:SEQ ID NO.2组成。测所述的TFEB的易位伴侣的试剂在制备ACTB‑TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。本发明为ACTB‑TFEB易位性肿瘤的快速准确的诊断提供了新的工具。

权利要求

1.一种ACTB-TFEB融合基因，其特征在于，包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；ACTB基因共6个外显子；基因融合发生于ACTB的3号外显子与TFEB基因2号外显子之间。

2.检测权利要求1所述的ACTB-TFEB融合基因的PCR引物。

3.根据权利要求2所述的PCR引物，其特征在于所述的PCR引物由ACTB-E3-F：如SEQ ID NO.1所示和TFEB-E2-R: 如SEQ ID NO.2所示组成。

4.检测权利要求1所述的ACTB-TFEB融合基因的试剂在制备ACTB-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的检测权利要求1所述的ACTB-TFEB融合基因的试剂为检测权利要求1所述的ACTB-TFEB融合基因的PCR引物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的PCR引物由ACTB-E3-F：如SEQ ID NO.1所示和TFEB-E2-R: 如SEQ ID NO.2所示组成。

7.一种ACTB-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂，其特征在于包含权利要求2或3所述的PCR引物。

说明书

一种TFEB的新易位伴侣及其检测引物和应用

技术领域

[0001] 本发明属于医学检验领域，涉及一种TFEB的新易位伴侣及其检测引物和应用。

背景技术

[0002] 2016年WHO对2004年肾细胞癌病理组织学分类进行了修改，新增了TFEB基因易位相关性肾癌(TFEB易位性肾癌)。TFEB基因位于6p21.1，是TFEB易位性肾癌的唯一驱动基因，其致病机理清晰明确：这类肿瘤均涉及位于6p21.1的TFEB基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFEB融合蛋白，而TFEB作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前WHO分类中仅纳入1种单一易位形式，即MALAT1-TFEB。然而近年来散在个案报道指出，TFEB易位性肾癌存在不同的易位伴侣和融合基因，包括KHDRBS2-TFEB,COL21A1-TFEB,CADM2-TFEB等。

[0003] TFEB易位性肿瘤是一罕见类型肿瘤，虽然其总体发病率很低，但该疾病以发病年龄轻为突出特征，因此造成极其沉重的家庭及社会负担。且研究表明，该肿瘤与肾脏常见肿瘤(透明细胞性肾细胞癌)无论从发病机制还是激活的信号通路上均存在显著差别，因而临床治疗指南亦对其治疗方案有所区分，TFEB易位性肿瘤的治疗靶点亟待进一步研究。因此，根据基因型来精确诊断此类肿瘤显得十分重要。

[0004] 目前常用的诊断TFEB易位性肿瘤的检测方法主要包括免疫组织化学和荧光原位杂交。免疫组织化学检测细胞核TFEB融合蛋白直观、快捷、价格低，但其缺点是该方法容易受到多种因素影响，如组织固定时间、组织修复方式、抗体克隆号以及人为的判读因素等等，使得结果可能出现假阳性或假阴性。染色体荧光原位杂交(FISH)始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。但这两种检测方法只能提示存在TFEB蛋白的高表达或TFEB基因的易位，均不能明确肿瘤中发生的具体易位改变。精确检测TFEB易位性肿瘤的易位伴侣和融合基因位点，不仅是患者预后预测的依据，也是未来靶向治疗的指导，因此，明确TFEB易位性肿瘤的基因易位位点，具有重要的临床意义。

[0005] 目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验，针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合，对肿瘤组织中提取出的RNA逆转录之后进行PCR扩增并测序，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计PCR引物将有利于TFEB易位性肿瘤检测准确度的进一步提高。

发明内容

[0006] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种TFEB的新易位伴侣。

[0007] 本发明的另一目的是提供该新易位伴侣的检测引物。

[0008] 本发明的又一目的是提供引物的应用。

[0009] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0010] 一种TFEB的新易位伴侣，为ACTB-TFEB基因易位，ACTB基因位于7p22.1(7号染色体，位置5527148-5530601，序列来自GeneBank，序列版本号GRCh38.p7)，共6个外显子；基因融合发生于ACTB的3号外显子与TFEB基因2号外显子之间。我们通过高通量测序方法检测未知融合对象的TFEB肿瘤患者的标本，发现所述的TFEB的新易位伴侣：ACTB-TFEB基因易位，这一位点国内外文献均未报道过，原有TFEB融合基因扩增引物也无法检测出这一融合基因，因此会导致漏诊。所述的TFEB的新易位伴侣包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

[0011] 本发明所述的TFEB的新易位伴侣在制备ACTB-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。

[0012] 一种检测ACTB-TFEB易位性肿瘤的PCR引物，为检测本发明所述的ACTB-TFEB基因易位的PCR引物。所有能够检测本发明所述ACTB-TFEB基因易位的引物对均在本发明的保护范围内。

[0013] 所述的PCR引物优选由ACTB-E3-F：SEQ ID NO.1和TFEB-E2-R:SEQ ID NO.2组成。

[0014] 针对本发明找到的新的新易位伴侣，我们在ACTB的3号外显子和TFEB的2号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物GC含量在40％～60％之间，退火温度最好接近72℃，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作，石蜡标本RNA碎裂严重，因此扩增产物不宜过长，需要控制在300bp以下。

[0015] 经过多次调试和验证 ，最终设计的引物序列为 ：ACTB-E3-F：GGCATCCTCACCCTGAAGTA(SEQ ID NO.1)；TFEB-E2-R:AAGTGGACGGGGGTATTGA(SEQ ID NO.2)，理论扩增产物长254bp，扩增产物(融合基因)的全部序列如下：GGCATCCTCACCCTGAAGTACCCCATCGAGCACGGCATCGTCACCAACTGGGACGAGGAGCCAGCGCCGGCAGCCACCATGGCGTCACGCATAGGGTTGCGCATGCAGCTCATGCGGGAGCAGGCGCAGCAGGAGGAGCAGCGGGAGCGCATGCAGCAACAGGCTGTCATGCATTACATGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCTCGGAGGGCCGCCCACCCCGGCCATCAATACCCCCGTCCACTT(SEQ ID NO.3)。经实验验证，引物可成功扩增出目的条带，条带单一、特异。

[0016] 检测所述的TFEB的易位伴侣的试剂在制备ACTB-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。

[0017] 所述的检测TFEB的易位伴侣的试剂为检测所述的TFEB的易位伴侣的PCR引物。

[0018] 所述的PCR引物优选由ACTB-E3-F：SEQ ID NO.1和TFEB-E2-R:SEQ ID NO.2组成。

[0019] 一种ACTB-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂，包含本发明所述的PCR引物。

[0020] 有益效果：

[0021] 本发明针对高通量测序发现的新融合位点设计了特异性的PCR引物，扩大了原引物组合的检测范围，应用于临床，可提高诊断该类肿瘤的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该引物组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为三个工作日。采用本发明提供的探针组合进行检测ACTB-TFEB易位性肿瘤，不但方便、快速、可靠而且检出率高，可用于制备ACTB-TFEB易位性肿瘤诊断试剂盒，为ACTB-TFEB易位性肿瘤的快速准确的诊断提供了新的工具。

附图说明

[0022] 图1：在已知ACTB-TFEB融合型肿瘤中应用本发明引物组合(ACTB-E3-F；TFEB-E2-R)进行验证，成功检出的ACTB-TFEB融合基因测序图。

具体实施方式

[0023] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

[0024] 实施例1 针对明确诊断的病例进行验证：

[0025] 对于高通量测序RNA-seq检测出ACTB exon3-TFEB exon2新融合位点的病例，使用我们设计的引物进行验证。

[0026] 一、RNA的提取：

[0027] 严格按照RNeasy FFPE Kit操作说明进行提取。①脱蜡：将收集好的玻片进行二甲苯脱蜡，再用无水乙醇漂洗，风干后用手术刀片刮下来装入1.5ml EP管中；②酶解：加入150μl消化液,再加入10μl蛋白酶K，混匀，56℃酶解15min,80℃15min，冰上冷却；③加入16μl DNDNA酶缓冲液,再加入10μl DNase I,混匀，室温静置15mimin,12000rpm离心15min，取上清；④加入320μl结合液液再加入720μl无水乙醇，混匀，分2次转移至吸附柱中，8000rpm离心1min，，弃废液；⑤洗涤：加入500μl洗涤液,8000rpm离心1min；重复洗涤一次，弃废液，将吸附柱转移到一个新的2ml收集管中，12000rpm离心5min；⑥洗脱：将吸附柱转移到1.5ml的EP管中，加入100μl的洗脱液，室温静置1min,12000rpm离心1min，将收集好的洗脱液(即DNA提取液)进行浓度和纯度测定，-80℃保存存待用。

[0028] 二、逆转录PCR RT-PCR

[0029] 采用试剂盒(K1622，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，MBI)对RNA进行逆转录，方法详见试剂盒说明。PCR扩增引物为本专利ACTB-TFEB融合基因引物组合ACTB-E3-F/TFEB-E2-R。反应体系包括：0.125μl TaKaRa Ex TaqTMHS液，2.5μl 10×Taq Buffer(Mg2+plus)，2μl dNTP(均购自日本Takara公司)，引物浓度为20μmol/l，cDNA模版为100ng，无菌去离子水加至25μl。PCR扩增条件为94℃变性3min后，94℃30s、60℃30s、72℃
1min，共35次循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用3％琼脂糖，电压100V，电泳，溴化乙啶染色后于紫外光下观察结果，并送测序。

[0030] 结果：分别用本发明引物(ACTB-E3-F/TFEB-E2-R)PCR后可见单一特异的电泳条带，对扩增产物进行测序，得到ACTB exon3-TFEB exon2融合基因序列(图1)，证明本发明设计的引物组合可靠且敏感。

[0031] 实施例2 针对对照组病例进行检测

[0032] 我们对30例诊断明确的对照组病例(包括10例透明细胞性肾细胞癌，5例乳头状肾细胞癌，5例嫌色细胞性肾细胞癌，5例TFE3易位相关性肾细胞癌和5例MALAT1-TFEB易位相关性肾癌，理论上均不存在ACTB-TFEB基因融合)使用本发明的引物组合进行检测，RNA提取、逆转录PCR和测序方法同上。

[0033] 结果：使用本发明设计引物组合检测，未检测出ACTB-TFEB融合基因，证明本项目设计的引物特异性高。

[0034] 评价：本发明引物组合是对原有TFEB易位性肾细胞癌融合基因引物的补充，扩展了TFEB易位性肾细胞癌融合基因的类型，增加了RT-PCR方法诊断该肿瘤的检出率。