铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因及其重组表达载体和应用

摘要

本发明涉及铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因及其重组表达载体和应用，通过克隆铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因，并通过根癌农杆菌介导的方法将该基因转入铃铛子中，获得转基因植株，过表达AlODC后，能够显著提高铃铛子植株中腐胺及托品烷生物碱的含量，为利用转基因技术高效生产莨菪碱和东莨菪碱提供了一种理想方法。

权利要求

1.铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因，其特征在于：所述ALODC基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因，其特征在于：所述ALODC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.含有权利要求2所述铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由SEQ ID NO.1所示序列连入pBI121载体的BamH I和Sac I酶切位点之间而得。

4.权利要求1或2所述铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因在提高茄科植物莨菪碱和东莨菪碱的含量中的应用；所述茄科植物为铃铛子。

5.权利要求3所述重组表达载体在提高茄科植物莨菪碱和东莨菪碱的含量中的应用；

所述重组表达载体由SEQ ID NO.1所示序列连入pBI121载体的BamH I和Sac I酶切位点之间而得，所述茄科植物为铃铛子。

6.一种提高铃铛子生物碱含量的方法，其特征在于：通过在铃铛子植株中过表达铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因，所述ALODC基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述生物碱为莨菪碱和东莨菪碱。

7.根据权利要求6所述一种提高铃铛子生物碱含量的方法，其特征在于：在铃铛子植株中过表达铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因的方法为转基因技术，具体为：克隆铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因，然后构建含有所述ALODC基因的重组表达载体，再将获得的表达载体转化根癌农杆菌，接着用含有AlODC基因的重组表达载体的根癌农杆菌浸染铃铛子外植体，经再生诱导、抗性筛选、PCR检测获得转鸟氨酸脱羧酶ALODC基因植株。

说明书

铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因及其重组表达载体和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因，还涉及含有该基因的载体和应用。

背景技术

[0002] 托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)是一类来源于少数茄科植物的次生代谢产物，因为具有显著的药理学活性，已被人们作为传统药物使用了近3000年。现代临床上常用的是莨菪碱(hyoscyamine)(或者其外消旋体阿托品)和东莨菪碱(scopolamine)，也包括药效稍低的山莨菪碱(anisodamine)，它们都是作用于副交感神经系统的抗胆碱药物，主要用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等，市场需求十分巨大，其中东莨菪碱药效更强，副作用更弱，价格也更昂贵。然而在大多数植物中TAs含量尤其是东莨菪碱含量极低，如植株中东莨菪碱含量仅为干重的0.01％～0.08％，不能满足市场需求。所以，利用代谢工程技术提高资源植物中TAs含量是相关产业长期追求的目标。第一例TAs代谢工程的报道起始于1992年，即第一个TAs功能基因HnH6H被克隆的一年之后，将HnH6H基因转入植株中使之超表达，惊奇地发现转基因当代和子一代植株的茎叶中几乎全是东莨菪碱，莨菪碱被完全转化了，表明H6H是很有效的遗传改造靶标基基因，王细荣等植株同时超表达TAs合成途径上游和下游的两个关键酶基因PMT和H6H，使终产物东莨菪碱干重含量达到了9mg/g证明了该策略的优越性。但是在植株中如何大幅度提高植株中托品烷生物碱的总含量，特别是莨菪碱的含量一直没有有效的手段。

[0003] 铃铛子，又名藏茄、唐冲那薄、喜马拉雅山莨菪，茄科山莨菪属，原产自我国西藏(东南部)、云南(西北部)，尼泊尔、不丹、锡金亦有分布，生长于3200-4000米的高海拔地区，株高50-150cm。是一种多年生宿根草本，医药上常用根提取托品烷类生物碱。铃铛子植株繁茂高大，全株密布绒毛和星状毛，根粗壮，全株肉质化程度高。与我国传统药源植物颠茄相比具有生物量大、生物碱含量高的特点，且极适宜在我国西藏等高海拔地区大面积种植。而野生铃铛子中莨菪碱和东莨菪碱含量仍然很低，代谢工程是有效提高铃铛子莨菪碱和东莨菪碱最有效的方法。

[0004] 鸟氨酸脱羧酶(ODC)是大多数植物体内腐胺合成的关键酶基因，而腐胺是托品烷生物碱和合成的重要前提物质，前人报道在曼陀罗中过表达老鼠的鸟氨酸脱羧酶基因(ODC)能够微量提高曼陀罗生物碱的含量。而铃铛子过表达内源ODC基因目前尚未有相关的报道。因此来自于植物体本身的内源ODC基因的研究就显得重要而有意义。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因；本发明的目的之二在于提供含有所述铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供所述铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因在提高茄科植物莨菪碱和东莨菪碱的含量中的应用；本发明的目的之四在于提供所述重组表达载体在提高茄科植物莨菪碱和东莨菪碱的含量中的应用；本发明的目的之五在于提供一种提高铃铛子生物碱含量的方法；本发明的目的之六在于提供过表达所述铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因的茄科植物。

[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0007] 1.铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因，其特征在于：所述ALODC基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 优选的，所述ALODC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 2、含有所述铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因的重组表达载体。

[0010] 优选的，所述重组表达载体由SEQ ID NO.1所示序列连入pBI121载体的BamHI和Sac I而得。

[0011] 3、所述铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因在提高茄科植物莨菪碱和东莨菪碱的含量中的应用。

[0012] 4、所述重组表达载体在提高茄科植物莨菪碱和东莨菪碱的含量中的应用。

[0013] 5、一种提高铃铛子生物碱含量的方法，通过在铃铛子植株中过表达铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因，所述ALODC基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0014] 优选的，在铃铛子植株中过表达铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因的方法为转基因技术，具体为：克隆铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因，然后构建含有所述ALODC基因的重组表达载体，再将获得的表达载体转化根癌农杆菌，接着用含有AlODC基因的重组表达载体的根癌农杆菌浸染铃铛子外植体，经再生诱导、抗性筛选、PCR检测获得转鸟氨酸脱羧酶ALODC基因植株。

[0015] 6、含有所述铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因的茄科植物。

[0016] 优选的，所述茄科植物为铃铛子。

[0017] 本发明的有益效果在于：本发明首次在铃铛子克隆了AlODC，并通过根癌农杆菌介导的方法将该基因转入铃铛子中，获得转基因植株，过表达AlODC后，能够显著提高铃铛子植株中腐胺及托品烷生物碱的含量，特别是植株中莨菪碱和东莨菪碱，为生物代谢工程，利用转基因技术高效生产莨菪碱和东莨菪碱提供了一种理想方法。同时本发明还建立了稳定测量植株中莨菪碱和东莨菪碱含量的方法，为利用植株大规模生产植株素奠定了基础。

附图说明

[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

[0019] 图1为植株中莨菪碱和东莨菪碱测定结果(A：叶中莨菪碱含量；B：根中莨菪碱含量；C：叶中东莨菪碱含量；B：根中东莨菪碱含量)。

具体实施方式

[0020] 具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

[0021] 实验材料铃铛子(Anisodus luridus Link et Otto)种子采集于中国西藏，并保存于西藏农牧学院。

[0022] 实施例1、铃铛子鸟氨酸脱羧酶ALODC基因的克隆

[0023] (1)铃铛子基因组总RNA的提取

[0024] 铃铛子基因组总RNA的提取使用TIANGEN公司的RNA试剂盒。取50-100mg植株须根在液氮中迅速研磨成粉末，加入550μL裂解液RL(已加入巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀。9800rpm离心5min，吸取450μL转移至过滤柱CS上，CS放在收集管中，12000rpm离心5分钟，小心吸取收集管中的上清400μL至RNase-free的离心管中，缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，转入吸附柱CR3中，12000rpm离心1min，弃废液，将CR3放回收集管中。向CR3中加入
350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，弃废液，将CR3放回收集管中。向CR3中央加入80μL的DNase1工作液(10μL DNase1储存液+70μL RDD溶液，轻柔混匀)，室温(18～25℃)静置15分钟。向CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，弃废液，将CR3放回收集管中。向CR3中加入500μL漂洗液RW(加入乙醇)，室温(18～25℃)静置2分钟，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将CR3放回收集管中，重复一次。12000rpm离心5min。将CR3置于室温放置5min，将CR3放入新的RNase-free中，向吸附膜的中间部位悬空滴加70μLRNase-free dd H2O，室温静置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。取10μL放于RNase-free小管中，用于跑胶和测浓度；剩余的60μL放于RNase-free离心管中-80℃保存。

[0025] (2)铃铛子ALODC基因的克隆

[0026] 将所获的基因组总RNA通过反转录酶反转录获得第一链cDNA，根据SEQ ID NO.1所示的DNA序列，设计并合成完整编码框的上游引物和下游引物，具体如下：

[0027] 上游引物：F-AlODC-OE:5'-gcggatccatggccggccaaacagtcatcg-3'(SEQ ID NO.3)(下划线处为BamHI酶切位点)；

[0028] 下游引物：R-AlODC-OE:5'-gcgagctctcagcttggataagcataagc-3'(SEQ ID NO.4)(下划线处为Sac I酶切位点)；

[0029] 以合成的第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物对，经PCR扩增后进行测序(上海桑尼生物科技有限公司)，其核苷酸如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0030] 实施例2、构建含AlODC基因的植物表达载体及工程菌构建

[0031] 首先，将实施例1克隆得到的ALODC基因与PJET载体(大连Takara公司)连接，构建中间载体PJET-AlODC；再将中间载体PJET-AlODC用(BamH I/Sac I)酶切，同时用相同的酶切表达载体pBI121，回收AlODC基因片段和pBI121载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证，得到含AlODC基因的植物表达载体，简称为AlODC-pBI121。

[0032] 将重组表达载体AlODC-pBI121转化根癌农杆菌(EHA105)，筛选阳性克隆，并进行PCR验证。

[0033] 实施例3、根癌农杆菌介导ALODC基因转化植株及转基因筛选

[0034] (1)外植体的预培养；铃铛子种子用1g/L的GA3溶液浸泡过夜，用自来水稍冲洗后用体积分数为70％的乙醇消毒1min，然后用质量分数为50％的次氯酸钠溶液除菌10min，用无菌水冲洗多次后，接种于不添加激素的MS+200mg/L Cef固体培养基上。25C，16h/8h(light/dark)光照条件下培养约15d左右，种子萌发出两片子叶，下胚轴长约1cm，可用于遗传转化。

[0035] (2)农杆菌活化与外植体的共培养：从划线培养的平板上挑取一个农杆菌EHA105-pBI121-AlODC单克隆，接种于15mL YEP(Rif+Str+Kan)液体培养基中，28℃，200r/min振荡培养24-48h；5000rpm离心6min收集菌体，用转化共培培养基(1/2MS+AS100μmol/L)悬浮菌体，调OD600到0.5即可用于转化，剪取植株子叶和下胚轴，在活化好的农杆菌菌液中浸泡5min，吸干菌液，将外植体铺在添加有滤纸的转化共培培养基上，25℃，暗培养4d。同时以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

[0036] (3)抗性再生植株的筛选：共培结束后，将外植体转入除菌和再生培养基(MS+1.0mg/l ZT+0.5mg/L IAA)，25℃，16h/8h(light/dark)光照条件下进行培养，5d左右转接一次培养基。继续培养1月后，剥离抗性芽或带芽点的抗性愈伤转入不含筛选压的生根培养基中继续培养，直至完整的再生植株形成，编号并继代再生植株在基本培养基上培养，即可获得kan抗性再生植株，用于后续实验。

[0037] 将获得的kan抗性再生植株用PCR检测，检测引物根据目的基因所在表达盒p35s-ALODC-nos序列p35s和AlODC分别设计正向引物和反向引物，具体引物如下：

[0038] 上游引物：F-p35s:5'-gatgcctctgccgacagtggtc-3'SEQ ID NO.5；

[0039] 下游引物：R-AlODC:5'-tcagcttggataagcataagc-3'(SEQ ID NO.6)；

[0040] 结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化植株基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

[0041] 本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化植株的含AlODC基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化植株，获得经PCR检测的转基因植株植株。转基因植株植株的获得为筛选获得较高莨菪碱和东莨菪碱含量的植株株系提供了直接素材。

[0042] 实施例4、利用HPLC-ELSD测定转基因植株中莨菪碱和东莨菪碱含量[0043] (1)HPLC条件及系统适用性以及标准溶液的配制

[0044] 色谱仪：日本岛津Shimadzu高效液相色谱仪(系统控制器：CBM-20Alite，泵：LC-20AD，柱温箱：CTO-20A，二极管阵列检测器：SPD-M20A，自动进样器：SIL-20A)；

[0045] 色谱柱：YMC-Pack ODS-A(150×6.0mm,5micron,12nm)；

[0046] 流动相：乙腈和甲醇等体积混合液:乙酸铵缓冲液(20mM乙酸胺，0.1％甲酸，pH＝4.0)＝17:83；

[0047] 流速：1mL/min

[0048] 检测波长：215nm

[0049] 柱温：40℃

[0050] 进样量：20μL

[0051] 标准曲线的制作分别称取莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱标准品(Sigma)配制成500μg·mL-1、250μg·mL-1、100μg·mL-1、50μg·mL-1、25μg·mL-1和10μg·mL-1浓度的梯度标准溶液，按照上述检测条件测定并绘制三种生物碱的标准曲线，算出各自的线性回归方程用于样品的定量计算.到达花期后，将全株叶片混合收集，40℃烘干，研磨成粉，过50目筛，按Kamada[200]等方法提取生物碱，具体如下：

[0052] 1)0.2g植物干粉加入20mL甲醇，超声破碎30min，如水温升高中间可换一次凉水，结束后室温静置1h；

[0053] 2)滤纸过滤，用10mL甲醇洗涤残渣，滤液40℃挥干；

[0054] 3)挥干的残渣用10mL氯仿+5mL 1N H2SO4溶液超声溶解，充分混匀；

[0055] 4)收集上层H2SO4相，冰浴上加入3mL氨水使溶液碱化，pH在10-12；

[0056] 5)用5mL氯仿萃取上述溶液一次，收集氯仿相；

[0057] 6)再用3mL氯仿萃取一次，收集氯仿相，合并两次氯仿相；

[0058] 7)40℃挥干氯仿，残渣用2mL生物碱存储缓冲液溶解。

[0059] 方程计算出样品中的莨菪碱和东莨菪碱含量(mg)，再除以样品的植株叶干重(g)，从而计算出植株植株中莨菪碱和东莨菪碱的含量，结果如图1所示。

[0060] 结果显示，转AlODC基因显著提高植株中莨菪碱和东莨菪碱含量。转ALODC基因植株中叶片中莨菪碱和东莨菪碱的含量最高可达到干重的3.5mg/g和5.5mg/g，分别是非转化普通植株(0.5mg/g干重)的4.7和3.67倍。图中WT表示非转化普通植株，VC表示的是空载体对照植株；L1,2,3,4,5和L6表示不同的转基因株系。在根中生物碱的含量也得到了类似大幅度的提升。

[0061] 本实施例采用HPLC法测定了转基因植株中莨菪碱和东莨菪碱含量，采用转化AlODC基因的代谢工程策略获得了莨菪碱和东莨菪碱高产的植株植株，为规模化生产莨菪碱和东莨菪碱提供了一种理想方法。

[0062] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。