指纹图谱鉴别山豆根真伪的方法

摘要

本发明公开了一种指纹图谱鉴别山豆根真伪的方法，通过测定山豆根药材样品的液相图谱来判断该山豆根药材样品的真伪。本发明提供的鉴别方法能全面反映山豆根的有效化学成分，从整体上反映山豆根药材样品的质量，准确可靠，而且操作简便易行、成本低、实用性强，有利于大范围推广，非常适用于山豆根药材及其产品质量的检测和监控。

权利要求

1.指纹图谱鉴别山豆根真伪的方法，其特征在于，通过测定山豆根药材样品的液相图谱来判断该山豆根药材样品的真伪；

以标准山豆根非生物碱指纹图谱中的10个色谱峰作为特征峰，当山豆根药材样品的液相图谱中未同时出现这10个特征峰时，山豆根药材样品为伪劣品；当山豆根药材样品的液相图谱中10个特征峰的相对保留时间与标准山豆根非生物碱指纹图谱的相似度高于85%时，山豆根药材样品为优质品，其中，按出峰顺序以10个特征峰中的第三个特征峰为参照峰，其余9个特征峰的相对保留时间分别为：0.403、0.462、1.077、1.600、1.883、1.899、

1.948、1.975、2.081；

按出峰顺序前四个特征峰对应的化合物分别为红车轴草苷、异红车轴草苷、芒柄花黄素、2-( 2',4'-二羟基苯基) -5,6 -二氧亚甲基苯并呋喃，第六个特征峰对应的化合物为

3-甲氧基高丽槐素，第九个特征峰对应的化合物为越南槐醇；

先将山豆根药材样品制成供试品溶液，然后测定供试品溶液的液相图谱，其中，供试品溶液的制备过程具体包括：称取山豆根药材样品粉末，加入山豆根药材样品粉末5 20倍重~量的提取液，回流提取1 2 h，过滤，取滤液，将滤液进行减压旋蒸回收提取液至蒸干，得粗~提取物，向粗提取物中加水溶解，过大孔树脂，用体积分数为10 39%的乙醇溶液洗脱后，再~用体积分数为40 95%的乙醇溶液洗脱，收集40 95%的乙醇溶液洗脱部分，减压旋蒸回收乙~ ~醇溶液至蒸干，得精提取物，向精提取物中加甲醇溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，定容；

提取液是体积分数为65 95%的乙醇溶液；

~

测定山豆根药材样品的液相图谱的具体条件包括：高效液相色谱仪所用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为30℃；液相色谱检测时波长为205 nm，进样量为10 μl，流速为1.0 ml/min；液相色谱检测采取梯度洗脱，其中，乙腈为流动相A，水为流动相B，乙腈所占体积比的变化具体为：在0 5 min内，乙腈所占体积比为25%，在5 55 min内，乙腈所~ ~占体积比从25%逐渐增大至50%，在55 80 min内，乙腈所占体积比从50%逐渐增大至95%；

~

高效液相色谱仪所用的色谱柱为Waters Sunfire-C18柱，柱内径为4.6 mm，柱高为250 mm，硅胶粒径为5 μm。

说明书

指纹图谱鉴别山豆根真伪的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种鉴别山豆根真伪的方法。更具体地说，本发明涉及一种指纹图谱鉴别山豆根真伪的方法，属于中药材鉴定方法技术领域。

背景技术

[0002] 山豆根为豆科植物越南槐的干燥根及根茎，具有清热解毒，消肿利咽的功效，含有苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、蝙蝠葛碱、染料木素、β-固甾醇、黄酮等成分，现行的《中国药典》对山豆根质量控制方法比较简单，仅以苦参碱和氧化苦参碱含量作为药材质量评价的指标，而苦参碱和氧化苦参碱不是山豆根特有成分，且对苦参碱和氧化苦参碱的指标测定难以从整体上反应药材质量。

[0003] 指纹图谱技术作为一种多组分化学成分样品的有效质量控制方法，能够从整体上反映待测样品的整体性特征，目前被广泛应用于中药材质量控制。所以为了更准确评价山豆根药材质量，需要建立一种能全面反映山豆根有效化学成分的指纹图谱。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供一种指纹图谱鉴别山豆根真伪的方法，其能全面反映山豆根中的有效化学成分，从整体上反映山豆根药材样品的质量。

[0005] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种指纹图谱鉴别山豆根真伪的方法，通过测定山豆根药材样品的液相图谱来判断该山豆根药材样品的真伪。

[0006] 优选的是，以标准山豆根非生物碱指纹图谱中的10个色谱峰作为特征峰，当山豆根药材样品的液相图谱中未同时出现这10个特征峰时，山豆根药材样品为伪劣品；当山豆根药材样品的液相图谱中10个特征峰的相对保留时间与标准山豆根非生物碱指纹图谱的相似度高于85％时，山豆根药材样品为优质品，其中，按出峰顺序以10个特征峰中的第三个特征峰为参照峰，其余9个特征峰的相对保留时间分别为：0.403、0.462、1.077、1.600、1.883、1.899、1.948、1.975、2.081。

[0007] 优选的是，按出峰顺序前四个特征峰对应的化合物分别为红车轴草苷、异红车轴草苷、芒柄花黄素、2-(2',4'-二羟基苯基)-5,6-二氧亚甲基苯并呋喃，第六个特征峰对应的化合物为3-甲氧基高丽槐素，第九个特征峰对应的化合物为越南槐醇。

[0008] 优选的是，先将山豆根药材样品制成供试品溶液，然后测定供试品溶液的液相图谱，其中，供试品溶液的制备过程具体包括：称取山豆根药材样品粉末，加入山豆根药材样品粉末5～20倍重量的提取液，回流提取1～2h，过滤，取滤液，将滤液进行减压旋蒸回收提取液至蒸干，得粗提取物，向粗提取物中加水溶解，过大孔树脂，用体积分数为10～39％的乙醇溶液洗脱后，再用体积分数为40～95％的乙醇溶液洗脱，收集40～95％的乙醇溶液洗脱部分，减压旋蒸回收乙醇溶液至蒸干，得精提取物，向精提取物中加甲醇溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤后，定容。

[0009] 优选的是，提取液是体积分数为65～95％的乙醇溶液。

[0010] 优选的是，测定山豆根药材样品的液相图谱的具体条件包括：高效液相色谱仪所用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为25～35℃；液相色谱检测时波长为200～320nm，进样量为5～10μl，流速为0.8～1.2ml/min；液相色谱检测采取梯度洗脱，其中，乙腈为流动相A，水为流动相B，乙腈所占体积比的变化具体为：在0～5min内，乙腈所占体积比为25％，在5～55min内，乙腈所占体积比从25％逐渐增大至50％，在55～80min内，乙腈所占体积比从50％逐渐增大至95％。

[0011] 优选的是，测定山豆根药材样品的液相图谱的具体条件包括：高效液相色谱仪所用的色谱柱为Waters Sunfire-C18柱，柱内径为4.6mm，柱高为250mm，硅胶粒径为5μm，柱温为30℃；液相色谱检测时波长为205nm，进样量为10μl，流速为1.0ml/min。

[0012] 本发明至少包括以下有益效果：本发明通过测定山豆根药材样品的液相图谱，然后与标准山豆根非生物碱指纹图谱进行比对，以10个特征峰为山豆根质量的评价指标，能全面反映山豆根的有效化学成分，从整体上反映山豆根药材的质量，能准确可靠地鉴别山豆根药材的真伪，具有药材样品处理简单方便、检测结果重复性好、检测灵敏度高的优点，能实现对山豆根药材及其产品质量的稳定控制，保证山豆根药材及其产品的安全供应，有利于大力推广和应用山豆根。本发明通过相似度试验、精密度试验、稳定性试验、重复性试验和特征峰指认试验对该方法进行验证，结果表明本发明提供的检测方法准确可靠，能够反映山豆根中的多个有效化学成分，从整体上反映山豆根药材的质量，从而获得更加准确可靠的检测结果。此外，本发明提供的鉴别方法操作简便易行、成本低、实用性强，适合大范围推广，非常适用于山豆根药材及其产品质量的检测和监控。

[0013] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

[0014] 图1为本发明其中一实施例所述的10批山豆根真品的液相图谱；

[0015] 图2为本发明其中一实施例所述的标准山豆根非生物碱指纹图谱。

具体实施方式

[0016] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

[0017] 需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0018] <实施例>

[0019] 指纹图谱鉴别山豆根真伪的方法包括以下步骤：

[0020] 步骤一：称取山豆根药材样品粉末2g，加入山豆根药材样品粉末20倍重量、体积分数为85％的乙醇溶液，回流提取2h，过滤，取滤液，将滤液进行减压旋蒸回收乙醇溶液至蒸干，得粗提取物，向粗提取物中加20ml水溶解，过大孔树脂，用体积分数为39％的乙醇溶液洗脱后，再用体积分数为95％的乙醇溶液洗脱，收集95％的乙醇溶液洗脱部分，减压旋蒸回收乙醇溶液至蒸干，得精提取物，向精提取物中加甲醇溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤后，定容至10ml容量瓶，得供试品溶液；

[0021] 步骤二：测定供试品溶液的液相图谱，其中，测定液相图谱的具体条件包括：

[0022] 色谱仪：Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；

[0023] 色谱柱：Waters Sunfire-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；

[0024] 柱温：30℃；

[0025] 检测波长：205nm；

[0026] 进样量：10μl；

[0027] 流速：1.0ml/min；

[0028] 流动相：乙腈为流动相A，水为流动相B，按表1进行梯度洗脱：

[0029] [表1]

[0030]

[0031]

[0032] 步骤三：将山豆根药材样品的液相图谱与标准山豆根非生物碱指纹图谱中的10个特征峰进行比对，当山豆根药材样品的液相图谱中未同时出现这10个特征峰时，山豆根药材样品为伪劣品；当山豆根药材样品的液相图谱中10个特征峰的相对保留时间与标准山豆根非生物碱指纹图谱的相似度高于85％时，山豆根药材样品为优质品。

[0033] 其中，按出峰顺序将10个特征峰分别标记为1～10号峰，以3号峰为参照峰，其余9个特征峰的相对保留时间分别为：0.403、0.462、1.077、1.600、1.883、1.899、1.948、1.975、2.081。

[0034] <相似度试验>

[0035] 取10批山豆根真品(来源见表2)，按照实施例中供试品溶液的制备方法将山豆根真品制成真品溶液，并采用与实施例相同的液相图谱测定条件测定10批山豆根真品溶液的液相图谱，并记录这10批山豆根真品的液相图谱，结果见图1。

[0036] 其中，3号山豆根真品的液相图谱分离度和峰形均最好，作为标准山豆根非生物碱指纹图谱，见图2，图2中标记的1～10即为选定的10个特征峰，用于和山豆根药材样品的液相图谱进行比对，以鉴别山豆根药材样品的真伪。10个特征峰的保留时间分别为：15.291、17.562、37.976、40.894、60.753、71.513、72.119、73.993、75.003、79.046(单位：min)。由于芒柄花黄素在各批山豆根真品中均有出现，且分离度良好，故选择芒柄花黄素(即3号峰)作为参照峰(标记为S)，其余9个特征峰的相对保留时间分别为：0.403、0.462、1.077、1.600、
1.883、1.899、1.948、1.975、2.081。

[0037] 取芒柄花黄素标样，配制成与真品溶液浓度相同的标准品溶液，并采用与实施例相同的液相图谱测定条件测定芒柄花黄素标准品溶液的液相图谱，得芒柄花黄素标样的液相图谱，以芒柄花黄素标样的液相图谱中芒柄花黄素的保留时间为基准，计算10批山豆根真品的液相图谱中参照峰(S)的相对保留时间(记为S1～S10)，结果见表3。从表3能够看出，S1～S10介于0.893～0.981之间，说明10批山豆根真品的液相图谱中芒柄花黄素峰的保留时间与芒柄花黄素标样的保留时间的相似度介于0.893～0.981之间，相似度很高，说明采用液相指纹图谱来鉴别山豆根药材样品的真伪是比较准确可靠的。

[0038] [表2]

[0039]

[0040] [表3]

[0041]

[0042] <精密度试验>

[0043] 取同一份山豆根真品的真品溶液连续进样6次，采用与实施例相同的液相图谱测定条件进行测定，记录每次测定后的液相图谱，以3号峰为参照峰，计算其余9个特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示：6次测定中各特征峰相对保留时间的RSD(即相对标准偏差)<0.12％，相对峰面积的RSD<2.93％，表明本发明提供的方法精密度良好。

[0044] <稳定性试验>

[0045] 取同一份山豆根真品的真品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h测定其液相图谱，液相图谱的测定条件与实施例相同，记录每次测定后的液相图谱，以3号峰为参照峰，计算其余9个特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示：24h内各特征峰相对保留时间的RSD<0.31％，相对峰面积的RSD<2.04％，表明测试溶液在24h内稳定。

[0046] <重复性试验>

[0047] 取同一批山豆根真品6份，按照实施例中供试品溶液的制备方法将山豆根真品制成真品溶液，并采用与实施例相同的液相图谱测定条件测定6份真品溶液的液相图谱，记录每次测定后的液相图谱，以3号峰为参照峰，计算其余9个特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示：6份真品溶液中各特征峰相对保留时间的RSD<0.15％，相对峰面积的RSD<2.94％，表明本发明提供的方法重复性较好。

[0048] <特征峰指认试验>

[0049] 经过多种标样的单一比对，指认出10个特征峰中有6个特征峰对应的化合物为：1号峰为红车轴草苷，2号峰为异红车轴草苷，3号峰为芒柄花黄素，4号峰为2-(2',4'-二羟基苯基)-5,6-二氧亚甲基苯并呋喃，6号峰为3-甲氧基高丽槐素，9号峰为越南槐醇。这6中化合物均是山豆根抗鼻咽癌的活性成分，说明本发明提供的方法能较好地反映山豆根的有效化学成分。

[0050] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例和图例。