一种丝素蛋白纳米颗粒及其制备方法

摘要

本发明涉及一种丝素蛋白纳米颗粒及其制备方法，属于纳米材料和高分子生物医用材料技术领域。本发明所述丝素蛋白纳米颗粒为规则球形，不溶于水，粒径在10～1000nm之间，所述纳米颗粒主要为silkⅠ结构，可长期稳定保存。本发明在制备丝素蛋白纳米颗粒过程中，通过调节丝素蛋白浓度和冷冻温度即可直接获得不溶于水的丝素蛋白纳米颗粒。制备方法完全采用水溶液体系，整个制备过程无需添加任何化学试剂，工艺简单，可实现丝素蛋白纳米颗粒的宏量制备，从而彻底解决了现有技术所涉及的化学试剂使用和残留、生物相容性下降以及产量低的问题，对丝素蛋白纳米颗粒的工业化应用具有重要意义。

权利要求

1.一种丝素蛋白纳米颗粒，其特征在于：所述纳米颗粒为规则球形纳米颗粒，不溶于水，粒径在10～1000nm之间，所述纳米颗粒主要结构为silkⅠ结构；其中：所述丝素蛋白纳米颗粒采用下述方法制得，步骤如下：(1)配制质量浓度为0.01～1.0％的丝素蛋白溶液，然后置于液氮中进行冷冻处理至溶液完全冷冻，获得冷冻丝素蛋白；

(2)将步骤(1)的冷冻丝素蛋白转移至冰箱中进行软冻处理，诱导丝素蛋白结构转变，获得不溶于水的丝素蛋白纳米颗粒冷冻体；所述的软冻处理具体是指在温度为-10～0℃条件下冷冻处理2～5天；

(3)将步骤(2)所得冷冻体直接进行冷冻干燥处理获得所述的丝素蛋白纳米颗粒粉体；

或将步骤(2)所得冷冻体解冻，得到分散性良好的丝素蛋白纳米颗粒悬液，然后进一步将所述丝素蛋白纳米颗粒悬液进行冷冻干燥处理，得到所述的丝素蛋白纳米颗粒粉体；所述的解冻具体是指在5～60℃条件下进行融化。

2.根据权利要求1所述的丝素蛋白纳米颗粒，其特征在于：步骤(1)中所述的丝素蛋白溶液是将桑蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到再生丝素蛋白溶液。

说明书

一种丝素蛋白纳米颗粒及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于纳米材料和高分子生物医用材料技术领域，具体涉及一种丝素蛋白纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

[0002] 蚕丝丝素蛋白是天然桑蚕丝的主要成分，由蚕后部绢丝腺的内皮细胞分泌。蚕丝丝素蛋白纯度高，不含细胞器和其他生物杂质，生物安全性高。丝素蛋白由于良好的生物相容性、优良的机械性能以及可调节的降解速率，在食品、化妆品、特别是生物医用材料等高新领域有着广泛的应用前景。

[0003] 材料在纳米化后，具有更高的比表面积和化学活性，是材料领域研究的热点之一。蛋白质纳米颗粒因为其良好的生物相容性，在食品和化妆品添加剂、药物载体以及特征材料加工制备等领域备受关注。相分离、盐析、乳化、静电喷射等方法已经用于制备不同尺寸的丝素蛋白纳米颗粒。但是现有的制备方法相对复杂、产量较低，并且不能避免化学试剂的使用。

[0004] 专利ZL 200410014228.2、专利申请CN 106729982A、CN 102417733A等相续报道了化学试剂诱导丝素蛋白变性的方法制备丝素蛋白纳米颗粒。上述报道的丝素蛋白纳米颗粒均无法避免化学试剂的使用，降低了纳米颗粒的生物相容性，也不利于生物活性药物的装载。专利号为ZL 200410016856.4报道了通过冷冻-解冻的方法制备丝素蛋白纳米微球，但需要添加一定量的甲醇等有机溶剂作为变性剂诱导丝素蛋白组装。专利公开号为CN 101653714A的专利报道了静电喷射的方法制备丝素蛋白颗粒，制备过程避免了化学试剂的使用，但是仍然需要使用有机溶剂诱导丝素蛋白不溶于水，而且产量相对较低、静电场下纳米颗粒制备过程稳定性较差。同时，上述报道的丝素纳米颗粒均为稳定的silkⅡ结构，降解速率较慢。

[0005] 公开号为CN 105832706A的发明专利提出了一种亚稳态结构的丝素蛋白纳米颗粒及其制备方法，通过溶剂体系、丝素溶度、溶解、透析和离心的条件协同控制获得丝素蛋白纳米颗粒，制备工艺繁琐，而且，制备过程中采用了甲酸/盐体系，获得纳米颗粒丝素蛋白分子量会下降，酸和盐难以全部去除。

[0006] 在本发明作出之前，公开号为CN106474482A的专利申请公开了一种丝素蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用，即将丝素蛋白在液氮中冷冻诱导丝素蛋白组装成纳米颗粒，冻干后利用有机容易诱导其不溶于水。这种制备方法，需要有机溶剂诱导、反复的清洗和分散，增加了制备工艺的复杂性，获得的纳米颗粒主要结构为silkⅡ结构，降解相对缓慢。

[0007] 基于现有技术存在的上述缺陷，特提出本申请。

发明内容

[0008] 针对上述现有技术存在的问题和缺陷，本发明的目的在于提供一种丝素蛋白纳米颗粒及其制备方法。本发明采用冷冻诱导自组装的方法，通过低温冷冻丝素蛋白水溶液以及软冻诱导丝素蛋白结构转变的方法，直接获得不溶于水、以silkⅠ结构为主的丝素蛋白纳米颗粒，彻底避免化学试剂的使用，实现纳米颗粒的宏量制备，使其更具有产业化上的利用价值。

[0009] 为了实现本发明的上述第一个目的，本发明提供了一种丝素蛋白纳米颗粒，所述纳米颗粒为规则球形纳米颗粒，不溶于水，粒径在10～1000nm之间，所述纳米颗粒主要结构为silkⅠ结构。

[0010] 本发明的第二个目的在于提供上述所述的丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0011] (1)配制质量浓度为0.01～1.0％的丝素蛋白溶液，然后置于液氮中进行冷冻处理至溶液完全冷冻，获得冷冻丝素蛋白；

[0012] (2)将步骤(1)的冷冻丝素蛋白转移至冰箱中进行软冻处理，诱导丝素蛋白结构转变，获得不溶于水的丝素蛋白纳米颗粒冷冻体；

[0013] (3)将步骤(2)所得冷冻体直接进行冷冻干燥处理获得所述的丝素蛋白纳米颗粒粉体；或将步骤(2)所得冷冻体解冻，得到分散性良好的丝素蛋白纳米颗粒悬液，然后进一步将所述丝素蛋白纳米颗粒悬液进行冷冻干燥处理，得到本发明所述的丝素蛋白纳米颗粒粉体。

[0014] 进一步地，上述技术方案步骤(2)中所述的软冻处理具体是指在温度为-10～0℃条件下冷冻处理2～5天。

[0015] 进一步地，上述技术方案步骤(3)中所述的解冻具体是指在5～60℃条件下进行融化。

[0016] 进一步地，上述技术方案步骤(1)中所述的丝素蛋白溶液是将桑蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到再生丝素蛋白溶液。

[0017] 本发明的原理是：丝素蛋白溶液在快速冷冻过程中，自发组装形成纳米颗粒结构，经软冻处理，可诱导丝素蛋白结构向silk Ⅰ结构转变，直接解冻或者冷冻干燥可以获得不溶于水的、分散良好的丝素蛋白纳米颗粒悬液或者粉体。

[0018] 与现有技术相比，本发明涉及的丝素蛋白纳米颗粒及其制备方法具有以下优点和显著的进步：

[0019] (1)本发明在制备丝素纳米颗粒过程中，仅通过调节丝素蛋白浓度和冷冻温度即可直接获得不溶于水的丝素蛋白纳米颗粒，本发明采用全水溶液体系，整个制备过程无需添加任何化学试剂，从而彻底解决了现有的纳米颗粒制备技术多涉及的化学试剂使用和残留问题，具有更高的生物安全性，在食品、化妆品、生物医用方面表现出明显的优势。

[0020] (2)本发明制备的丝素蛋白纳米颗粒粒径主要结构为Silk I结构，具有生物降解性能，相比较传统方法制备的丝素蛋白纳米颗粒降解速率更快。

[0021] (3)本发明的制备方法简单，仅需要简单的冷冻处理，工艺过程简单、产量高，可实现丝素纳米颗粒的宏量制备，且本发明制得的丝素蛋白纳米颗粒可长期稳定保存，因此本发明对丝素蛋白纳米颗粒的工业化应用具有重要意义。

附图说明

[0022] 图1为本发明实施例1得到的丝素蛋白纳米颗粒的10μm扫描电镜图；

[0023] 图2为本发明实施例1得到的丝素蛋白纳米颗粒的1μm扫描电镜图；

[0024] 图3为本发明实施例1得到的丝素蛋白纳米颗粒XRD谱图。

具体实施方式

[0025] 下面对本发明的实施案例作详细说明。本实施案例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。

[0026] 根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

[0027] 为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

[0028] 除非特殊说明，本发明下述各实施例中所述的丝素蛋白溶液在液氮中进行冷冻处理的温度为-196℃。

[0029] 实施例1

[0030] 本实施例的一种丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0031] 将100g桑蚕丝浸入5L的0.05％NaCO3溶液中，于98～100℃煮沸处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；将丝素纤维加入到摩尔比1:2:8的CaCl2/CH3CH2OH/H2O三元溶液中，在72℃下搅拌溶解1h得到丝素蛋白混合溶液；将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，得到纯化的丝素蛋白溶液；

[0032] 将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到0.5wt％，倒入金属盘，置于液氮中至溶液完全冷冻；

[0033] 冷冻的丝素蛋白转移到-4℃冰箱冷冻3天，诱导丝素蛋白结构转变；

[0034] 室温25℃下解冻，获得分散性良好的丝素蛋白纳米颗粒悬浮液，然后将制备得到的丝素蛋白纳米颗粒悬浮液进一步冻干后制得本发明所述的丝素蛋白纳米颗粒。

[0035] 将最终制得的丝素蛋白纳米颗粒进行扫描电镜测试，测试结果分别如图1(低倍)和图2(高倍)所示；同时将得到的丝素蛋白纳米颗粒进行XRD测试，检测结果如图3所示。由图1、2可以看出，制得的丝素蛋白纳米颗粒为规则球形，颗粒粒径在10～1000nm之间；由图3可以看出，丝素蛋白纳米颗粒主要结构为silk Ⅰ结构。

[0036] 实施例2

[0037] 本实施例的一种丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0038] 将脱胶的桑蚕丝素纤维将丝素纤维加入到摩尔比1:2:8的CaCl2/CH3CH2OH/H2O三元溶液中，在60℃下搅拌溶解2h得到丝素蛋白混合溶液；将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，得到纯化的丝素蛋白溶液；

[0039] 将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到0.1wt％，搅拌均匀后，倒入金属盘，调整溶液厚度为3cm，置于液氮中至溶液完全冷冻；

[0040] 冷冻的丝素蛋白转移到-7℃冰箱冷冻4天，诱导丝素蛋白结构转变；

[0041] 冷冻干燥处理，得到不溶于水的丝素蛋白纳米颗粒粉体。

[0042] 实施例3

[0043] 本实施例的一种丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0044] 将纯化的桑蚕丝素蛋白溶液的质量浓度调整到0.01wt％，搅拌均匀后，倒入金属盘，置于液氮中至溶液完全冷冻；

[0045] 冷冻的丝素蛋白转移到-10℃冰箱冷冻5天，诱导丝素蛋白结构转变；

[0046] 冷冻干燥处理，得到不溶于水的丝素蛋白纳米颗粒粉体；

[0047] 将丝素蛋白纳米颗粒粉体加入到去离子水中，经超声波分散后重新得到分散良好的丝素蛋白纳米颗粒悬液。

[0048] 实施例4

[0049] 本实施例的一种丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0050] 将脱胶的桑蚕丝素纤维加入9.3mol/L的LiBr溶液中在60℃搅拌溶解2h得到丝素蛋白混合溶液；将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析得到纯化的丝素蛋白溶液；

[0051] 将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到0.1wt％，搅拌均匀后，倒入金属盘，置于液氮中至溶液完全冷冻；

[0052] 冷冻的丝素蛋白转移到-7℃冰箱冷冻4天，诱导丝素蛋白结构转变；

[0053] 冷冻干燥处理，得到不溶于水的丝素蛋白纳米颗粒粉体。

[0054] 实施例5

[0055] 本实施例的一种丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0056] 将脱胶的桑蚕丝素纤维加入7mol/L的Ca(NO3)2溶液中在80℃搅拌溶解2h得到丝素蛋白混合溶液，用去离子水透析得到纯化的丝素蛋白溶液；

[0057] 将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到1.0wt％，搅拌均匀后，倒入金属盘，置于液氮中至溶液完全冷冻；

[0058] 冷冻的丝素蛋白转移到-1℃冰箱冷冻2天，诱导丝素蛋白结构转变；

[0059] 室温37℃下解冻，获得分散性良好的丝素蛋白纳米颗粒悬浮液。

[0060] 实施例6

[0061] 本实施例的一种丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0062] 将脱胶的桑蚕丝素纤维将丝素纤维加入到摩尔比1:2:8的CaCl2/CH3CH2OH/H2O三元溶液中，在60℃下搅拌溶解2h得到丝素蛋白混合溶液；将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，得到纯化的丝素蛋白溶液；

[0063] 将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到0.2wt％，搅拌均匀后，倒入金属盘，调整溶液厚度为3cm，置于液氮中至溶液完全冷冻；

[0064] 将冷冻的丝素蛋白转移到0℃冰箱冷冻5天，诱导丝素蛋白结构转变；

[0065] 室温5℃下解冻，获得分散性良好的丝素蛋白纳米颗粒悬浮液，然后将制备得到的丝素蛋白纳米颗粒悬浮液进一步冻干后制得本发明所述的丝素蛋白纳米颗粒。

[0066] 实施例7

[0067] 本实施例的一种丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

[0068] 将脱胶的桑蚕丝素纤维加入9.3mol/L的LiBr溶液中在60℃搅拌溶解2h得到丝素蛋白混合溶液；将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析得到纯化的丝素蛋白溶液；

[0069] 将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到0.5wt％，搅拌均匀后，倒入金属盘，置于液氮中至溶液完全冷冻；

[0070] 冷冻的丝素蛋白转移到-5℃冰箱冷冻3天，诱导丝素蛋白结构转变；

[0071] 室温60℃下解冻，获得分散性良好的丝素蛋白纳米颗粒悬浮液，然后将制备得到的丝素蛋白纳米颗粒悬浮液进一步冻干后制得本发明所述的丝素蛋白纳米颗粒。

[0072] 分别将上述实施例2～7制得的丝素蛋白纳米颗粒进行扫描电镜和XRD测试。扫描测试结果表明，实施例2～7制得的丝素蛋白纳米颗粒为规则球形，颗粒粒径在10～1000nm之间；XRD测试可以表明，制得的丝素蛋白纳米颗粒主要结构为silk Ⅰ结构。